Метод для изучения полиморфизма C924T гена рецептора тромбоксана А2

Резюме

В настоящем исследовании, мы описывают методологию для анализа генотипа C924T. Протокол состоит из трех фаз: экстракции ДНК, амплификации цепной реакции полимеразы (PCR), и анализ полиморфизма длины рестрикционных (фрагментов ПДРФ) на геле агарозы.

Аннотация

Тромбоксана А2 гена рецептора (TBXA2R) является членом надсемейства G-белка в сочетании с семь трансмембранных регионами. Он участвует в прогрессии атерогенеза, ишемии и инфаркта миокарда. Здесь мы представляем методологии пациента генотипирования расследовать post-transcriptional роль полиморфизм C924T (rs4523), расположенный в регионе 3' гена рецептора TBXA2. Этот метод полагается на экстракции ДНК из цельной крови, полимеразной цепной реакции (ПЦР) усиление часть гена TBXA2, содержащих C924T мутации и выявление дикого типа и мутантов генотипов с помощью анализа дайджест ограничение, Гель специально полиморфизма длины рестрикционных (фрагментов ПДРФ) на агарозе. Кроме того результаты были подтверждены секвенирование гена TBXA2R. Этот метод имеет несколько потенциальных преимуществ, таких как высокая эффективность и быстрой идентификации C924T полиморфизм PCR и энзима ограничения анализа. Этот подход позволяет интеллектуального исследования для зубного налета и прогрессирование атеросклероза, анализируя пациента генотипы для TBXA2R C924T полиморфизма. Применение этого метода имеет потенциал для выявления предметов, которые более восприимчивы к атеротромботических процессов, в частности темы в группе высокого риска, лечение аспирин.

Введение

TBXA2R является членом надсемейства G-белка в сочетании с семь трансмембранных регионами, которые являются широко выразили и локализованы на мембраны клеток или на внутриклеточные структуры^1,2. Сигнальный путь TBXA2R участвует в передовых атеросклеротических процессов³. Увеличение выражение рецептора TBXA2 была продемонстрирована во время атерогенеза прогрессии и клинические и экспериментальные исследования показали свою соответствующую роль в⁴ишемии и инфаркта миокарда. C924T, единичных нуклеотидных Однонуклеотидный полиморфизм гена TBXA2R, был признан в качестве функционального полиморфизм у здоровых добровольцев и был связан с⁵клинических расстройств. Кроме того наши предыдущие исследования⁶ показали, что C924T полиморфизм гена TBXA2R участвует в Стенограмма стабильности; в частности является увеличение нестабильности мутантный тип Стенограмма (TT) в отношении дикого типа (CC). Кроме того несколько раздражители, такие как аденозиндифосфат (ADP), адреналина и коллагена в различных концентрациях индуцированной агрегации тромбоцитов менее эффективен для мутантов типа (TT). Это согласуется с сокращением тромбообразованию и гемостаз. Таким образом нестабильность TBXA2R Стенограмма и связанных снижение агрегации тромбоцитов могут быть связаны с защитной роли генотипа TBXA2R TT против atherothrombosis и его осложнений у пациентов высокого риска аспирин лечение⁶ .

Здесь мы описываем методологии для пациента генотипирования расследовать post-transcriptional роль C924T полиморфизма (rs4523) расположен в регионе 3' гена рецептора TBXA2. Этот метод опирается на следующие шаги: (1) ДНК извлечения из цельной крови, (2) ПЦР-амплификации части гена TBXA2R, содержащих C924T мутации и (3) определение дикого типа и мутантов генотипов, с помощью ограничения длины фрагмента Полиморфизм (RFLP) на геле агарозы. ПРФ-это техника, которая использует вариации в гомологичных последовательностей ДНК⁷. Это приложение было использовано для обнаружения ДНК полиморфизмы, особенно ОНП, найти и связать биологической значимости в генетических вариаций⁸. Полиморфизм, анализируются в первый раз, с помощью ПЦР-ПДРФ людьми был крови ABO⁹. Метод ПЦР-ПДРФ позволяет анализ генетических мутаций в гомологичных последовательностей ДНК, оценивая наличие фрагментов разной длины после переваривания ДНК, используя весьма специфические эндонуклеазами ограничения¹⁰.

В последние годы, были использованы следующие методологии для анализа SNP, с помощью метода PCR: гибридизации коротких Аллел Специфически олигонуклеотиды¹¹, Аллел Специфически PCR¹², выдвижение праймера на ДНК microarrays¹³, Перешнуровка олигонуклеотида пробирного¹⁴, прямой ДНК последовательности для выявления положение конкретных сингл нуклеотидных полиморфизмов¹⁵, Taqman метод¹⁶, добыча Matrix-Assisted лазерной десорбции/ионизации время-из-рейс) MALDI-TOF)¹⁷масс-спектрометрии и GeneChips¹⁸. Эти методы не являются простыми в использовании и могут потребовать дорогостоящего оборудования. И наоборот метод ПЦР-ПДРФ недорогой, простой в использовании, удобный, обладает высокой эффективностью и позволяет быстро идентифицировать C924T полиморфизма. Кроме того мы подтвердили результаты, секвенирование гена TBXA2R, с помощью метода Сэнгер¹⁵.

Этот подход позволяет прогнозирования исследование зубного налета и прогрессирование атеросклероза, анализируя пациента генотипы для TBXA2R C924T полиморфизма. Этот метод может определить темы, более восприимчивы к атеротромботических процессов, в частности, среди пациентов высокого риска, лечение аспирин.

протокол

Протокол соответствует руководящим принципам Комитета этики медицинских исследований университета Кьети.

1. Реагент установки

1. Подготовьте буфера Tris-ЭДТА (TE) (рН 8,0). Добавить 200 мкл ЭДТА 0,5 М и 1 мл трис-Cl 1 м в стакан и довести до 100 мл стерильной водой. Конечная концентрация TE буфера: 10 мм трис-Cl, 1 ЭДТА. Хранить при комнатной температуре (RT).
2. Подготовка 1 Л 10 x буфер электрофореза Стоковый раствор (КЭ). Распустить 108 g Tris база, 55 г борной кислоты и 40 мл ЭДТА 0,5 М (рН 8) в стакан и довести объем 1 Л стерильной водой. Магазин на RT.
3. Подготовка загрузки краситель гель. Распустить 0,25 g бромфеноловый синий, 0,25 г, ксилол cyanol FF, 50 г глицерина, 1 мм ЭДТА (рН 8) в 60 мл деионизированная или дистиллированной воды и довести до объемом 100 мл стерильной водой. Хранить при 4 ° C (несколько месяцев) или при-20 ° C (лет)
4. Подготовка 200 мл 2% агарозном геле. Используйте это свежие или, альтернативно, хранятся затвердевает на RT для до нескольких недель.
   1. Растворите 4 g агарозы в 200 мл 1 x TBE буфера в 600 мл стакан. Перемешайте с помощью магнитный смеситель для около 5 минут, до тех пор, пока полностью приостанавливается агарозы.
   2. Нагрейте раствор 2% агарозы в кипящей воде или на горячей плите (для около 10 мин, до тех пор, пока полностью не растворится агарозы). Обратите внимание, что стакан с геля агарозы должна быть покрыта алюминиевой фольгой. Кроме того тепло открытые стакан в микроволновой печи при высокой температуре около 3-5 мин.
   3. Вихрем 2% агарозном решения с помощью магнитных смеситель, проверяя, что агарозы полностью не растворится.
      Примечание: Частицы агарозы появляются как полупрозрачные зерна до полного растворения. Это может быть необходимо разогреть частицы в течение нескольких минут (около 5-10 мин).
   4. Если хранимая часть геля агарозы используется, нагрейте стакан, покрытые алюминиевой фольги, в ванне горячей водой (на приблизительно 60 ° C) до агарозы растворяется. Удалите с пипетка Пастера «следов» затвердевших агарозы от поверхности до заливки.

2. ДНК очистки

1. Выполните следующие действия перед началом очистки:
   1. Использовать образцы человеческого свежей цельной крови, или разморозить цельной крови замороженные образцы быстро (около 2-3 мин) на водяной бане (при 37 ° C) применение мягкая агитации и затем сбалансировать для RT перед использованием.
   2. Смешайте свежий или талой крови, инвертирование трубы несколько раз.
2. Запустите процедуру очищения, следуя поставщика протоколы для 100 мкл элюции тома.
3. Количественно и рассчитать чистоту ДНК, измерения поглощения на 260, 280 и 320 нм.
   1. Используйте стерильную воду для разбавления пробы и калибровки спектрофотометра.
   2. Применить следующую формулу, чтобы вычислить концентрацию образца ДНК = 50 мкг/мл x (₂₆₀ − A₃₂₀) x коэффициент разбавления и чистоту ДНК = (₂₆₀ − A₃₂₀) / (₂₈₀ − A₃₂₀), с приемлемым соотношением между 1.7 и 1.9.

3. ПЦР-амплификации ДНК образцов

1. Подготовка 25 мкл реакционной смеси в 0,2 мл микро усилители трубки, как показано в таблице 1.
2. Провести ПЦР амплификация очищенного образцов ДНК с помощью автоматизированных тепловых велосипедист, после усиления программы, показаны в таблице 2.
3. В конце амплификации PCR остановите ПЦР-реакции, оставляя образцы ДНК при 4 ° C.

4. ПРФ продуктов ПЦР

1. Подготовьте 22,5 мкл раствора Мастер микс для каждого образца, чтобы выбранный энзима ограничения дайджесты продукты PCR, как показано в таблице 3.
2. Передать новый ПЦР-пробирку для каждого образца, используя пипетку и фильтр советы 2,5 мкл ПЦР продукта.
3. Мкл 22,5 пищеварение Мастер микс решения в пробирки, содержащие продукт PCR каждого образца, используя пипетку и фильтр советы.
4. Инкубируйте реакционной смеси (Мастер микс решения и продукт PCR) при 37 ° C в течение 4 ч.

5. gel электрофорез анализ образцов ПЦР ПДРФ

1. Пятно гель агарозы путем добавления бромид ethidium (бромистый этидий) на 0,5 мкг/мл гель для 10 min. бромистый этидий связывается с ДНК, которые могут быть визуализированы под ультрафиолетового (УФ) света.
   Предупреждение: Важно использовать перчатки и другие защитные устройства во время обработки, хранения и удаления бромистый этидий, потому что это мутаген с потенциальной канцерогенности.
2. Залейте подготовленный агарозном геле в каппу для геля с хорошо гребенку в месте и подождать до тех пор, пока он затвердевает.
3. Поместите затвердевших агарозном геле в поле гель (электрофорез единица).
4. Заполните поле гель с 1 x TBE до тех пор, пока гель покрыта.
5. Пипетки и фильтр советы Загрузите 6 мкл усиливается дайджест ДНК (в частности, нагрузка 5 мкл каждого образца и 1 мкл загрузки краситель гель) в скважинах геля агарозы. Добавьте маркер размера ДНК в отдельном хорошо и параллельно с образцами.
6. Побегите гель на 20 – 30 мин на 100 V.
7. С трансиллюминаторе визуализировать рассеченного фрагментов ДНК или непереваренные продукты PCR, Сравнение фрагментов с ДНК, размер маркера и зарегистрировать результаты, фотографии следуя инструкциям производителя.
   Предупреждение: Используйте защитные устройства (защитные очки или маска) вокруг источников УФ света.

Результаты

Цель этого метода заключается в оценке тромбоксана А2 рецептор генотипа в отношении C924T полиморфизм. Человеческий геном TBXA2R расположен на 19p13.3, охватывает 15 kbp и состоит из трех экзонов, разделенных двух интронов. C924T полиморфизмы гена TBXA2R (539 bp) был усилен используя праймеры PCR, показанный на рисунке 1, которые были хорошо инженерии для того чтобы усилить конкретного региона ДНК, но не orthologous или paralogous неспецифического региона. Кроме того был проведен анализ ПДРФ с помощью энзима ограничения RsaI (рис. 1) на продукты PCR, и результаты были визуализирована на геле агарозы, чтобы охарактеризовать конкретные изучал SNP.

Основываясь на наличие различных фрагментов длиной после переваривания ДНК, возможна дискриминация генотипа пациента для C924T полиморфизма. В самом деле как показано на рисунке 2, homozygosity основных аллеля (CC) отображает две полосы (395 и 144 bp), потому что энзима ограничения точно режет часть гена TBXA2R на сайте C924T полиморфизм. Homozygosity незначительные аллеля (TT) подтверждается однодиапазонный (539 bp), потому что вырезывание энзима ограничения не происходит. Гетерозиготных аллеля (CT) показывает три полосы (539, 395 и 144 bp). Как показано на рисунке 2, C924T полиморфизм, определяется RsaI пищеварение на продукт PCR, было подтверждено анализа последовательностей.

Компонент	Объем (мкл)	Конечная концентрация
10 x буфер ПЦР Tween-20 (15 M MgCl2)	0.25	1.5 MgCl2 ммоль/Л
dNTP смесь (10 мм)	1	200 МКМ
Грунтовки (вперед) (10 пмоль/мкм)	1	0,4 МКМ/МКЛ
Грунтовки (обратный) (10 пмоль/мкм)	1	0,4 МКМ/МКЛ
Taq -полимеразы (5 U/мкл)	0.2	1 U/МКЛ
Образец ДНК (42 нг/мкл)	1	42 нг/мкл
DNase бесплатно вода	20.55
Итого	25

Таблица 1: Установки амплификации PCR. Мастер микс реакционную смесь 25 мкл, созданная в 0.2 мл ПЦР-пробирку для усиления единого образца ДНК.

Стандартное PCR
Первый шаг в активации	5 мин		95 ° C
3-ступенчатый Велоспорт
Денатурация	30 s		94 ° C
Отжиг	60 s		55 ° C
Расширение	60 s		72 ° C
Количество циклов		30 циклов
Окончательное расширение	8 мин		72 ° C

Таблица 2: Программа амплификации PCR. Настройка автоматизированных тепловых cycler для того, чтобы выполнять ПЦР и усилить дна шаблона. ПЦР-реакции остановили охлаждения на 4 ° C.

Компонент	Объем (мкл) (n = 1)	Объем (мкл) (n = 10) *
10 x буфер фермента	2.5	27,5
Энзима ограничения (5 U/мкл)	0.5	5.5
DNase бесплатно вода	19.5	214.5
Итого	22,5	247.5

Таблица 3: Пищеварение энзима ограничения продуктов ПЦР. Мастер микс раствор готовят так, чтобы выбранный энзима ограничения дайджесты продуктов PCR. *: Чтобы настроить Мастер микс решение для 10 образцов, добавить 10% больше, наконец, составляющих 11 образцы.

Рисунок 1: ПЦР праймеры и энзима ограничения RsaI. Прямого и обратного грунты, предназначенные для усиления TBXA2R гена часть 539 bp, содержащие C924T полиморфизм. RsaI является энзима ограничения, выбран признать GTAC сайтов. ˅: сайт резки RsaI фермента. C(/T): C924T полиморфизм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: электрофоретическая картина ДНК и анализа последовательности. (A) C924T, генотип распознается RFLP шаблон после переваривания с конкретного фермента RsaI. (B) ДНК анализа последовательности: результаты, полученные с RFLP после переваривания с RsaI энзима ограничения были подтверждены с помощью анализа последовательностей, показаны C924T полиморфизм. Эта цифра была изменена от De Iuliis et al., простагландинов и других посредников липидов⁶. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы описали методологии, которая позволяет пациенту генотипирования с целью расследования post-transcriptional роль C924T полиморфизма (rs4523) расположен в регионе 3' TBXA2R гена. Во-первых этот метод полагается на экстракции ДНК из цельной крови. В частности это первый процесс состоит из очищения всего ДНК человека, геномных и митохондриальных, пробах цельной крови, свежие или замороженные, относились с ЭДТА (цитрат или гепарин). За короткий срок хранения образцов цельной крови храните при температуре 2-8 ° C до 10 дней. Для хранения более 10 дней, хранения образцов в 70 ° C. Процесса автоматизированной очистки состоит из 4 шагов: лизируют, привязать, вымыть и элюировать. Во-вторых метод полагается на амплификации PCR части гена TBXA2R, содержащих C924T мутации. Наконец выполняется идентификация дикого типа и/или мутант генотип с помощью энзима ограничения анализа (RFLP) на геле агарозы.

Важнейшие шаги в протоколе, являются следующие: (i) в том случае, если часть геля агарозы хранении в RT используется, затвердевших агарозы могут быть повторно растворенного над кипящей водяной бане (при 60 ° C для около 15-20 мин.) или в микроволновой печи (3-5 мин) до заливки. Примечание: ослабьте крышку, когда переплава агарозы в бутылке. (ii), Кроме того, при повторном нагревании агарозы, испарение приведет к увеличению его концентрации. По этой причине он может быть полезным для компенсации путем добавления небольшого количества воды. (iii) ДНК фрагментов менее чем 1000 буфере TBE рекомендуется получить лучшее возможное разделение и bp были дифференцированы на геле агарозы. (iv) мы предпочитаем использовать геля агарозы, вместо того, чтобы гель полиакриламида, потому что подготовка последнего является более сложным, и она занимает гораздо больше времени, чтобы настроить. (v) выбор времени электрофореза геля зависит от ожидаемого размера продуктов амплификации. На основе этого протокола, достаточно для выполнения электрофорез на 20-30 мин на 100 V в 2% агарозном геле, поскольку размер ПЦР фрагментов варьируется от 100-500 bp. (vi) он является обязательным для получения 10-50 ng шаблона хорошего качества ДНК, извлеченные из человеческих образцов . По этой причине мы предпочитаем использовать автоматизированной очистки ДНК, вместо того, чтобы полуавтоматических или ручной один. (vii) подготовить реакция Мастер микс для амплификации PCR и Мастер микс решение для ПЦР продукты пищеварения, добавляя 10% больше (для учета потери жидкости во время дозирование) к объему рассчитываются умножается на число образцов для необходимого объема на 1 образец ДНК.

Наиболее часто ловушка метода является наличие дополнительного усиления продуктов из-за неправильного тепловая велосипедист программы, неправильный усиление подготовки Мастер микс или ДНК шаблоном засоренности. Кроме того отсутствие продуктов ПЦР может объясняться инактивированных полимеразы Taq или неправильный тепловой циклователь запуска. Кроме того наличие неожиданных фрагментов может быть из-за загрязнения продукта ПЦР или неполное переваривание из инактивированных фермента, слишком мало количество энзима ограничения объема или слишком короткий инкубационный период.

В последние годы, были использованы следующие методологии для анализа SNP, с помощью метода PCR: гибридизации коротких Аллел Специфически олигонуклеотиды¹¹, Аллел Специфически PCR¹², выдвижение праймера на microarrays ДНАА¹³ , лигирование олигонуклеотида проба¹⁴, прямого секвенирования ДНК для идентификации позицию конкретного сингл нуклеотидных полиморфизмов¹⁵, Taqman метод¹⁶, добыча Matrix-Assisted лазерной десорбции/ионизации Время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии¹⁷и GeneChips¹⁸. Эти методы не являются идеальными, поскольку они являются не просто использовать и/или требуют дорогостоящего оборудования. И наоборот ПЦР-ПДРФ метода, описанного в настоящем исследовании недорогой, простой в использовании, удобный, обладает высокой эффективностью и позволяет быстро идентифицировать C924T полиморфизма. Ограничение до нынешнего метода является, что он может использоваться только для небольшого числа полиморфизмов и несколько образцов в сеансе работы.

Для будущих применений этот метод может использоваться для прогнозирования исследований, касающихся зубного налета и прогрессирование атеросклероза, анализируя пациента генотипы для TBXA2R C924T полиморфизма. Кроме того этот метод может определить темы, более восприимчивы к атеротромботических процессов, в частности, высокого риска пациентов с аспирином. Наконец, этот метод может применяться для изучения других полиморфизмы, участвующих в персонализированной медицины для конкретных наркотиков (например, антикоагулянтов и противосудорожные средства) для того чтобы понять соответствующие препарата дозировку и индивидуальные фармакологических и клинические ответ для каждого пациента перед началом терапии и чтобы избежать негативных последствий.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAsymphony SP	QIAGEN	937055
Spectrophotometer	EPPENDORF	6131-02222
UV-transilluminator	UVP	732-110
PCR tubes	EPPENDORF	H0030121589
PCR thermal cycler	EPPENDORF	5331-03721
Pipettors and filter tips	EPPENDORF	H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02
Horizontal minigel electrophoresis apparatus	DIATECH PHORESIS 10	RI002-10
Dry block heater	TWIN INCUBATOR	DG210
QIAsymphony DNA Midi Kit	QIAGEN	931255
10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase)	DIATECH AND TAKARA	T0100 AND R0001DM
Taq polymerase	TAKARA	R0001DM
dNTP mixture	DIATECH  pharmacogenetics	NM001	dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM
PCR primers	DIATECH  pharmacogenetics	\\
Restriction enzyme RsaI	New England biolabs	R0167L
Restriction enzyme 10x buffer	New England biolabs	R0167L
Agarose	Sigma	A9539	DNA fragments are best separated in TBE buffer
Tris base	Sigma	T6066
Boric acid	Sigma	B7901
0.5 M EDTA, pH 8.0	Sigma	E7889
10% (wt/vol) ammonium persulfate	Sigma	E3678	prepared fresh each time
EtBr (0.5 μg/μL)	Sigma	E8751
Bromophenol blue	Sigma	B0126
Xylene cyanol FF	Sigma	X4126
Glycerol	Sigma	G5516
DNA size marker	DIATECH  pharmacogenetics	R1002-10	Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI
Sterile water (autoclaved)	DIATECH  pharmacogenetics	\\