Метод для высокой скорости стретч травмы человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток нейронов в формате 96-луночных

Резюме

Здесь мы представляем метод для модели человека в vitro стретч травмы в формате 96-луночных на шкале отношение к воздействия травмы. Это включает методы для изготовления растягивающийся плиты, количественное определение механических оскорбление, культивирования и ранив клетки, изображений и высокой контент-анализа для количественного определения травмы.

Аннотация

Черепно-мозговой травмы (ЧМТ) является одной из основных клинических задач с высокой заболеваемости и смертности. Несмотря на десятилетия доклинических исследований были разработаны не проверенная терапия для TBI. Этот документ представляет новый метод для исследований доклинических нейротравма, предназначенные для дополнения существующих доклинических моделей. Он вводит человека патофизиологии с помощью человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, нейронов (hiPSCNs). Он достигает загрузки импульса продолжительность похож на длительность загрузки клинических закрытой травмы удара головой. Он использует формат 96-луночных, который способствует высокой пропускной способности эксперименты и обеспечивает эффективное использование дорогих клеток и культуры реагентов. Силиконовые мембраны сначала обработаны удалить нейротоксическое неотвержденных полимера и затем кабалу коммерческих 96-луночных пластине органов для создания эластичного 96-луночных пластины. Заказного устройства используется для отступа все или некоторые из хорошо дно из-под, вызывая equibiaxial механические штамм, который механически повреждает клетки в культуре в скважинах. Отношения между отступ глубины и механические деформации определяется эмпирически при высокой скорости видеосъемка хорошо днища отступа. На эти силиконовые мембраны с использованием модифицированных версий протоколы культуры клетки обычных можно культивируемых клеток, включая hiPSCNs. Флуоресцентный микроскопических изображений клеточных культур приобретаются и проанализированы после травмы в полуавтоматических моды для количественного определения уровня травмы в каждой скважине. Представленная модель оптимизирована для hiPSCNs, но в теории может применяться для других типов клеток.

Введение

TBI является одной из основных причин смертности и заболеваемости в Соединенных Штатах, вызывая около 52 000 смертей и 275 000 госпитализаций каждый год¹. Без единого успех²было проведено более 30 клинические испытания терапии кандидата для TBI. Эта форма неудача свидетельствует о том, что человека конкретных процессов отдельных человека TBI от патофизиологии, наблюдается в часто используемые доклинических моделях грызунов.

Появление hiPSCNs создала возможность для изучения нейротравма в модели человека в пробирке . Наркотиков, выявление с помощью модели, основанные на hiPSCN может доставить результаты, которые являются более интеллектуальный клинический успех, чем модели, используя грызунов клетки. Кроме того hiPSCNs может быть генетически манипулировать изолировать и изучить влияние индивидуальных человеческих генетических вариантов на патологии³.

Метод, описанный в этой рукописи призвана обеспечить уникальные преимущества на основе hiPSCN болезни, моделирования нейротравма. В vitro стретч травмы модели нейротравма, хорошо установленных^4,5,6 с первичных клеток грызунов и человеческие нервные рак клеточных линий. Большинство из этих моделей генерировать стрейч загружая пневматически силиконовые мембраны. Этот подход является эффективным в едином формате хорошо но оказалось трудно масштаба до нескольких хорошо формате⁷. В результате никогда не было на экране высокой пропускной способности для агентов для лечения растяжения потерпевшего нейронов.

В этой модели мембраны тянется из-за отступ от под с жесткой индентора. Этот подход показал многократно для создания клинически значимых патологии в пробирке в одном хорошо систем^8,9,10. Наши последние работы показал, что он легко масштабируется 96-луночных формат при сохранении импульса длительностью порядка десятков миллисекунд¹¹, который является время, домен закрыт удара головы события^12,13.

В целом основные преимущества этой модели в vitro травмы являются 96-луночных формат, использование hiPSCNs и клинически значимых времени домен оскорбление.

протокол

1. силиконовые детоксикации

1. Нарежьте 254 мкм толщиной, 30,48 см x 30,48 см силиконовые мембраны 7,5 см x 11 см прямоугольников с помощью лезвия бритвы и акриловые шаблон. 10 прямоугольные мембраны могут быть сделаны с каждого листа. Сохраните документ, который поставляется с силикона.
2. Место мембраны в ванну деонизированной воды (ди) с мылом посуда. Один момент, скраб мембраны энергично с перчатке пальцев для по крайней мере 20 s или до тех пор, пока нагнул.
3. Промойте мембраны под проточной водой ди пока явно удаляется lathered мыло. Заложить мембраны на бумаге (от их упаковка) и автоклава на цикле гравитации.
4. Замочите каждый силиконовые мембраны в 250 мл 70% этанола за мембраны на орбитальный шейкер на 60 об/мин за 24 ч. Использование контейнер изготовлен из материала, который не реагирует с этанолом, таких как полипропилен.
   1. Если более чем одна мембраны помещается в одной ячейке, или если мембраны придерживаться нижней части Бен, отделите мембраны от их среды с пластиковые наконечники и Пипетка кончик стойки.
5. Передача силиконовые мембраны в перчатках на 250 мл воды ди на мембраны и замочить на орбитальный шейкер для 48 ч, при 60 об/мин.
6. Лег мембраны на бумаге и место в 93 ° C духовке посуда за 4 ч.
7. Храните мембраны на бумаге, в чистом и сухом месте, покрытые другой лист бумаги, чтобы защитить их от пыли.

2. плита изготовление

1. Плазмы чистого лечения 96-луночных плита топ с 200 W плазмы (см. Таблицу материалы) для 60 s на высокой мощности, поместив его нижней стороной вверх внутри плазмы чище. Проверка на фиолетовый свечение видно через окно камеры, которая указывает, что сложился эффективный плазмы. Эта техника склеивания адаптирована из Sunkara и др. ¹⁴
2. В течение 60 сек, место верхней пластины в 200 мл 1,5% (3-аминопропил) triethoxysilane (APTES) в DI воды за 20 мин, снизу сторона вниз. Это решение является нестабильным: готовить не более чем 60 s до введения пластину.
   Предупреждение: Работа с APTES зонта.
3. Плазмы лечить извлеченные силиконовая мембрана в плазме очиститель для 60 s на высокой мощности. Таким образом, что он заканчивается не более 5 мин до конца периода 20 мин в шаге 2.2 время плазменной обработки.
4. Используйте щипцы для расположения лечить плазматической мембраны поверх 7,5 x 11 см² пергаментную бумагу прямоугольник. Совместите 7,5 см x 11 см x 0.5 см сляб алюминия в нижней части пластины изготовление зажим. Совместите силиконовые мембраны и пергаментной бумаги на алюминиевых плит с помощью щипцов.
   Примечание: Файлы компьютерного проектирования (CAD) для этого устройства предоставляются в дополнительных материалах как дополнительного кода файл ' пресс умереть - универсальный 3D. ШАГ». Связанные Билл материалов поставляется в Дополнительная таблица 1: Пользовательские построен устройства - BOM.xlsx.
5. Удаление вершины пластины из APTES ванна и стряхните излишки раствора. Окунуться в ванну воды 200 мл ди 5 s и стряхнуть избыток воды. Окунуться в ванну воды различных 200 мл ди 5 s и стряхнуть избыток воды. Замените воду в этих банях перед окунать плита топ.
6. Используйте сжатый воздух для полностью высушите верхней пластины.
7. Место в верхней пластины в верхней части плиты изготовление зажим. Аккуратно закройте зажим изготовление пластины для Сожмите пластины верхней и силикона. Зажим для по крайней мере 1 час.
8. Разрешить пластину вылечить за 24 ч при комнатной температуре перед использованием, защитой от пыли.

3. растяжения плита

1. Очистите бойки.
   Примечание: Дополнительныесм.
   1. Подготовка 60 W баня стиль sonicator с ди воды при комнатной температуре.
   2. Поддержка блок индентора выше sonicator Ванна, таким образом, чтобы только вершины бойки погружен на глубину от по крайней мере 1 мм. Sonicate бойки для 8 min 42 кГц.
   3. Сушить бойки сжатым воздухом.
2. Совместите индентора блока.
   1. Расположите камеру с живой корм выше растяжения устройство таким образом, чтобы она смотрит на массиве индентора. Фокус на вершинах бойки.
      Примечание: Настройки, описанные в разделе 4, «Характеристике мембраны стрейч,»-один из возможных камеры установки для выполнения этой задачи.
   2. Безопасный тарелку на сцене повреждения устройства, с помощью стадии зажимы (рис. 1) и место куполом света над устройства.
      Примечание: См. Таблицу материалов для программного обеспечения управления инструментом.
   3. Запуск программного обеспечения управления инструмент, нажав на значок программы на рабочем столе компьютера, управляя повреждения устройства. Запуск проекта «in_vitro_neurotrauma.lvproj», щелкнув его в окне запуска. Из окна проекта запуска управления движением и положение трекер виртуальных инструментов (ВИС), которые называются «motion_control.vi» и «position_tracker.vi», соответственно, щелкнув на них.
   4. Закройте клетки вокруг повреждения устройства. Нажмите кнопку «стрелка» в левом верхнем углу управления движением VI для запуска VI и нажмите «Возле дна» снизить на сцену в пределах 2 мм связаться бойки. Нажмите кнопку «Стоп», чтобы остановить VI.
      Предупреждение: Держите руки подальше от подрамника когда манипулирования камерой в клетке. Клетки должны быть оборудованы дверной переключатель, который обеспечивает мощность для растяжения устройство только при закрытой дверце клетки.
   5. В окне проекта щелкните правой кнопкой мыши на «ось 1'. Нажмите на «Интерактивный тест панели». В открывшемся окне установите размер шага до 50 мкм, введя в поле «Целевой позиции» '500' единиц.
   6. Нажмите зеленую кнопку «идут» в нижней части окна «Интерактивный тест панели» неоднократно до пластины сначала делает контакт с любой бойки. Проверка для контакта на живой изображения камеры. Примечание позицию вертикальной этап указаны в левом верхнем углу окна «Интерактивный тест панели»; Это положение первого контакта.
   7. Ниже еще (как описано в шаге 3.2.6) до тех пор, пока каждый хорошо сделал контакт с бойки. При необходимости, переместить камеру, чтобы увидеть целую тарелку и вверх стадии (указав негативную позицию «целевой») и вниз. Примечание позицию вертикальной этап указаны в левом верхнем углу окна, когда все сообщения в контакте (это положение полный контакт).
   8. Обратите внимание на разницу между первый контакт и полный контакт позиций. Закройте панель интерактивный тест. Запустить движение управления VI (см. шаг 3.2.4) и нажмите на «Top» поднять на стадии. Остановка управления движением VI с «Stop» кнопку.
   9. После стадии находится в верхней части своей поездки, откройте дверь, чтобы отключить устройство. Отрегулируйте винты на углах индентора блока. Ослабьте винт на углу, который сделал первый контакт, чтобы понизить его и затяните винт напротив поднять в углу, что сделал последний контакт.
   10. Повторите этот процесс снижения на этапе до тех пор, пока пластины контакты бойки, осмотр контакт изображений для наклона, поднимая сцене, и корректировки (шаг 3.2.9) индентора блокировать. Когда стадия и блок выравниваются, сделают все бойки контакт одновременно.
   11. Откройте дверь, чтобы отключить устройство. Вставьте винты крепежные в их отверстия на блоке индентора и затяните их. Убедитесь, что блок уровня с крепежными винтами в месте (3.2.4-3.2.8 меры). Принять к сведению позицию стадии, сообщает «Интерактивный тест панели» когда пластины делает контакт. Это будет нулевой позиции для отступа экспериментов.
3. Смажьте бойки.
   1. Если блок индентора был только что создан и еще не были смазаны, очистить сплошной резиновый коврик (7,5 см x 11 см x 1,5 мм) и мягкие, закрытые ячейки пены резиновый коврик (7,5 см x 11 см x 3 мм) с wipe этанола, пропитанной лаборатории. Дайте им высохнуть на воздухе.
   2. Замочите уничтожить лаборатории в кукурузном масле и разложил ее на твердый резиновый коврик на тусклый блеск.
   3. Место пены колодки на твердой резины площадку для передачи нефти на поролоновую подкладку. Поместите 7,5 см x 11 см x 0.5 см алюминиевые плиты поверх пены колодки и загрузить его с балластом весом около 360 g (например, 6 конические трубы, загружен с 45 мл воды каждый) для обеспечения последовательной передачи нефти из твердой резины pad пенопластовую подкладку. Разрешить 10 s для масла для передачи на площадку поролон.
   4. Переместите панель поролон на массиве индентора. Место алюминиевые плиты и балласта поверх него для обеспечения последовательной передачи нефти советы бойки. Разрешить 10 s для масла для передачи бойки.
   5. Если не плита была растянута с блоком индентора была создана и смазкой для в первый раз, растянуть испытательной пластине перед началом эксперимента.
      Примечание: Это предотвратит любые несоответствия между первый участок и последующего простирается от привходящих эксперимент. Для последующих тянется повторите только шаги 3.3.2-3.3.5 перед каждым растянуть.
4. Растяните тарелку.
   1. Смажьте бойки, как описано в пункте 3.3.
   2. Закрепите пластину на сцене повреждения устройства Зажимы стадии. Если требуется стерильности, отрегулируйте положение крышки для обеспечения пластины не подвергая культуры поверхности воздух комнаты.
   3. Опустите сцену в нулевой позиции, используя управления движением 'VI' (см. шаги 3.2.4-3.2.6); нуль позиция определяется во время шага 3.2.
   4. Измените имя файла в поле «путь» в «позиция отслеживания VI» с уникальным именем файла, затем запустите его с помощью кнопки «стрелка» в левом верхнем углу этого окна.
   5. Установите глубину и продолжительность отступа (обычно 1-4 мм и 30 мс, соответственно, максимальная глубина 5 мм, минимальная продолжительность 15 мс) в «Травмы (мм)» и «Продолжительность (МС) травмы» поля «движение панели управления VI», нажав на полях и введя нужное значения.
   6. Запустите «движение панели управления VI» и нажмите на «Травма» для отступа пластину.
   7. Переместите стадии до верхней части его путешествия, нажав на «Top». Затем остановить VI с помощью кнопки «Стоп» и отключить устройство травмы, открыв дверь.
   8. Проверка перемещения истории этапа представлены в «положении трекер VI», чтобы подтвердить, что указанное максимальное смещение применяется. Щелкните правой кнопкой мыши на графике и нажмите «Экспорт в Excel». Нажмите на ' файл | Сохранить ' чтобы сохранить данные.

4. Характеризуя растянуть мембраны

1. Краска на выемку в верхней части каждого индентора белый обеспечить высокий контраст фона для высокой скорости видеосъемка.
   Предупреждение: Не красят колеса бойки, где они делают контактов пластинами.
2. 3D печать с poly(lactic acid) (НОАК), или иным образом изготовить, цилиндрические штамп с которой, чтобы сделать точку в каждой скважине. Сделайте цилиндра 5,9 мм в диаметре и 12,2 мм высотой, с 1,0 мм и диаметром 1,5 мм цилиндрические выступ сосредоточены на вершине.
   Примечание: 3D печати модель ' штамп. STL' доступен в качестве дополнительного файла.
3. Плазмы лечить пластины право сторона до активации поверхности силикона культуры клеток в скважинах для 60 s, как указано в шаге 2.1.
4. Место пластину на резиновый коврик или другой мягкой поверхности. Премьер небольшой выступ на марке (см. шаг 4.2) с чернилами с постоянным маркером. Вставьте отметку в колодец для проверки и нажмите, чтобы обеспечить хорошую передачу чернил. Премьер отметку перед каждой скважины.
5. Совместите блок индентора и смазывать бойки травмы устройства (см. шаги 3.2-3.3). Прочно закрепите пластину на стадии повреждения устройства. Разместите яркий рассеянный свет осевой выше повреждения устройства.
6. Установить высокоскоростной камеры на стенде бум над устройством травмы, вниз прямо, с объективом набор для маленьких пронумерованных диафрагмы и включите его. Запустите программное обеспечение камеры на компьютер, подключенный к камере. Скорость кадра раскрывающегося меню выберите 2 000 кадров в секунду и в затвор раскрывающегося меню, выберите быстрый время экспозиции, что дает высокий контраст изображения. Центр над точками скважин.
   1. Расположите камеру так, чтобы поле зрения содержит 12 скважин в сетке 3 x 4.
      Примечание: Это поле зрения предлагает оптимальный компромисс между пропускной способности и резолюции для изображения 1280 × 1024.
7. Нижняя пластина к нулевой точке (см. шаги 3.2.4-3.2.6). Одн щелкните запись кнопку на программное обеспечение камеры так, что он читает «триггер». Инициируйте позиции трекер VI (шаг 3.4.4).
8. Включите яркий рассеянный свет осевой. Отступ пластины, как описано в шаге 3.4.6.
9. Выключите яркий рассеянный свет осевой.
10. На компьютере управления камерой, найти в 30-40 мс окно записи, в котором происходит отступ: перетащите начало и конец стрелки в строке высокоскоростной видео играть в программное обеспечение камеры. Нажмите кнопку Сохранить, задайте имя в поле «Имя файла», выберите «TIFF» в поле «Формат» и нажмите на «Сохранить».
    1. Посмотрите. TIF-файлов изображений наименее растягивается (начало) и наиболее растягивается (пик отступы) государства.
    2. Чтобы измерить высоту и ширину точек в оба изображения, используйте Фиджи для открытия изображений наименее и пик стрейч бок о бок. С помощью инструмента Прямоугольное выделение по умолчанию, щелкните и перетащите, чтобы нарисовать прямоугольник вокруг точки в наименее растягивания изображения. Измерить высоту и ширину с ' анализ | Мера '.
    3. Повторите для точка в том же хорошо на пик растянуть изображение. Повторите для остальных скважин.
11. Рассчитайте штамм Лагранжа в направлениях x и y следующим образом:
    
    
    Примечание: Здесь, E_xx является деформации Лагранжа в направлении x , E_yy является штамм Лагранжа в направлении y , X является ширины точки, Y -высота точка, _f обозначает окончательное изображение (то есть, изображение отступ пик), и _я обозначает исходное изображение (то есть, изображение предварительно отступа). Средняя два значения чтобы определить нагрузку в этом хорошо.

5. покрытие культивируемых клеток

1. Автоклав бункеров и балласта весов, которые будут использоваться для стерилизации.
2. Плазмы лечить дном силиконовые пластины правой стороной вверх для 60 s (см. шаг 2.1). Немедленно потопить пластины в стерильных контейнеров, содержащих этанол 70% за 15 мин.
3. Погрузите плиты в стерильных фосфатный буфер (PBS) в отдельный стерильный бункеров для 30 мин.
4. Аспирационная PBS из скважин. Только сухой одной пластины на время, чтобы предотвратить потери плазменной обработки скважин.
   Предупреждение: Силиконовые дном пластины обеспечивают менее тактильной обратной связи, чем жестких плит, когда закупорить и более склонны блокировать кончиком пипетки.
5. Добавьте 100 мкл 0,1 мг/мл поли L-орнитин (ООП) за хорошо в стерилизованные пластины. Инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч.
6. Промывайте лунки дважды с 100 мкл стерильные PBS, оставляя второй мыть на скважинах, до тех пор, пока суспензию клеток готов.
7. Удаление флакона hiPSCNs от хранения жидкого азота, используя защитные перчатки и место на сухой лед. Быстро транспорт флакона в ванну воды 37 ° C и размораживать ровно 3 мин. Не вихрем флакона.
8. В стерильные капот мягко передавать содержимое флакона 50 мл Конические трубки с помощью Пипетки серологические 1 мл.
9. Промойте пустой криогенных флакон с 1 мл комнатной температуре полного обслуживания среды (база СМИ + дополнение).
10. Передача 1 мл СМИ в 50-мл пробирку каплям на около одной капли в секунду. Аккуратно водоворот трубки при добавлении. Добавьте 8 мл комнатной температуре полное обслуживание средних 50 мл трубки на около 2 капли/сек.
11. Крышка трубки и инвертировать 2 - 3 раза. Подсчет количества ячеек с Горяева. Вычислите объем дополнительных средств массовой информации, необходимых для разбавления суспензии клеток до 225 000 клеток/мл.
12. Аккуратно Пипетка количество средств массовой информации (рассчитанных выше) в трубку с помощью Пипетки серологические 25 мл суспензии клеток.
13. 10 мкл акций Ламинин 1 мг/мл 1 мл суспензии клеток с 1000 мкл микропипеткой для достижения 10 мкг/мл Ламинин в суспензию клеток. Аспирационная вверх и вниз раз с наконечником для Ламинин, затем крышка трубки и один раз перевернуть трубку.
14. Аспирационная PBS из пластин, одна пластина одновременно. Используйте многоканальные пипетки для 100 мкл суспензии клеток hiPSCN для каждой скважины. Колодцы имеют культуры площадь 0,33 см², поэтому плотность клеток на площади 67.500 клеток/см².
15. Отдых пластины при комнатной температуре в течение 15 минут после посева для поощрения вложения. Чтобы избежать вибрации вентилятора стерильных культуры Гуд, поместите покрыты пластины на стенде лаборатории. Инкубируйте культур при 37 ° C с 5% CO₂.
16. Выполните полный средства массовой информации изменения в 24 ч, заправка скважин с 200 мкл полное техническое обслуживание средств массовой информации. Выполните с половиной, изменяемые СМИ 100 мкл/хорошо каждые 2-3 дня.

6. ранив культур

1. Совместите блок индентора и найти нулевой позиции, как описано в шаге 3.2. Смажьте бойки, как описано в пункте 3.3.
2. Задайте имя файла для перемещения истории в позиции tracker VI (шаг 3.4.4). Установите параметры травмы в движение управления VI (шаг 3.4.5).
3. Взять тарелку ранения из инкубатора и зафиксируйте его на сцену. Отрегулируйте положение крышки для обеспечения пластины не подвергая культур к комнатным воздухом.
4. Нижняя плита нулевой точки (шаги 3.2.4-3.2.6) с помощью движения управления VI. Начало «позиции трекер VI» (шаг 3.4.4).
5. Использование элемента управления движением VI для отступа пластину (как описано в шаге 3.4.6). Для притворство тянется только этот шаг следует пропустите.
6. Вернуться сцену в верхней части диапазона движения (см. шаг 3.4.7). Возвращение пластину в инкубаторе.
7. Проверить и сохранить трассировку перемещения (как в шаге 3.4.8).

7. микроскопия

1. Подготовка 10 x окрашивание раствора с 2 мкг/мл Hoechst 33342 и 5 мкг/мл Флуорексон AM в техническое обслуживание средств массовой информации.
2. Каждое пятно с 20 мкл Спайк 10 x окрашивание раствора.
3. Инкубируйте 15 мин с пятно на 37 ° C.
4. Приобрести широкое поле флуоресцентного изображения. Использование обычных FITC и DAPI фильтровать наборы изображений Флуорексон утра и Hoechst 33342 сигналов, соответственно. Если несколько хорошо изображений последовательности будет принимать более чем на 10 мин, заключите пластину в стадии Топ инкубатор для поддержания здоровья культур.
   Примечание: 10 X 0,30 NA объектив обеспечивает достаточно подробные для определения жизнеспособности клеток и морфологии. Отрегулируйте выгоды для обеспечения хорошего визуализация невритов, даже если это вызывает некоторое насыщение гораздо ярче сома.
5. Сегмент изображения живых клеток в зелёном канале Флуорексон AM для выявления сома и невритов. Используйте ядерные изображения в канале синего Hoechst 33342 для оказания помощи в идентификации сома.

Результаты

Носилки прибор способен двигать на этапе repeatably с длительностью импульса как короче 10-15 мс в зависимости от амплитуды импульса (рисунок 2A). Амплитуды импульса высокой повторяемости, но длительность импульса колеблется около 1 мс между повторами. Амплитуда импульса фактической расходится с амплитуда импульса предписанные загружаются большое количество скважин, при установленном амплитудной является высоким (см. рис. 2B). Увеличением амплитуды стадии перемещения за пределы 3 мм, амплитуда фактического перемещения во все большей степени отстает от амплитуды предписанные перемещения (см. рис. 2B). Тщательное выравнивание блока пост устраняет любые тенденции в деформации мембраны по строкам или столбцам (рис. 2 c). На 3,5 мм с 52 скважины с отступом назначают стадии перемещения амплитуды (3,3 мм амплитуда фактического перемещения), средние деформации Лагранжа во всех местах, хорошо был 0.451 (стандартное отклонение средств для всех мест расположения = 0,051, значит стандартных отклонений для всех мест расположения = 0,065, n = 5 измерений за хорошо). Эти результаты представлены здесь для полноты картины, хотя некоторые из них уже сообщил¹¹.

Оптимальный, ранен культуры будет иметь несколько, если таковые имеются сгустки более 5 клеток. Невритов будет индивидуальный, длинные, стройные и изогнутые с мало или вообще не знаком напряженности или бисером (рис. 3A). В идеальных условиях жизнеспособности культур тесно следует подходить к жизнеспособности, указанный в спецификации производителя (обычно 60-70%) и культур на силиконовой похожи на обычных жестких культуры субстратов ( Рисунок 3B). Невритов могут или не могут быть видны на микроскопе светлые области низкой мощности. Ламинин концентрации и плотность клеток влияние культур на базовом и после травмы. Увеличение плотности клеток увеличилось количество и размер сгустки, которые образуются в культуре. Повышение концентрации Ламинин часто противодействует этот эффект (рис. 3A). Однако увеличивая Ламинин концентрация слишком много затуплены чувствительность культур для травм (Рисунок 4). Ламинин оптимальная концентрация ранен культур была 50 мкг/мл Ламинин (рис. 3), но было получено оптимальное разделение между Шам и стрейч пострадавшего населения в 10 мкг/мл Ламинин (рис. 4). Более высокие концентрации Ламинин уменьшена чувствительность культур травмы на короткое время точек (рис. 4), но и улучшение базовых жизнеспособность клеток больше момента времени (например, 7 дней). В целом стоит для оптимизации Ламинин концентрации для каждой экспериментальной ситуации.

Штамм мембраны, изображений момент после травмы, Ламинин концентрации и плотность клеток оказываемое высоко статистически основной эффект на neurite длину в клетку (ANOVA, p < 0,001). Эффект мембраны нагрузку на neurite длину клетки были чрезвычайно статистически значимых взаимодействий с после травмы изображений времени точки и Ламинин концентрации (ANOVA, p < 0,001) и статистически значимое взаимодействие с ячейкой плотность (ANOVA, p < 0,05). Аналогичным образом, мембраны деформации, после травмы изображений момент времени, клетки плотность, и Ламинин концентрации все оказали весьма статистически основной эффект на жизнеспособность клеток (ANOVA, p < 0,001). Эффект мембраны нагрузку на жизнеспособность клеток был высоко статистически значимое взаимодействие с точкой изображений время после травмы (ANOVA, p < 0,001) и статистически значимое взаимодействие с плотность клеток (ANOVA, p < 0,05). Эти результаты доказывают, что сроки, плотность клеток и Ламинин концентрации оказывают важное влияние на отношения между прикладной оскорбление и экспериментальных результатов, поэтому каждый должны быть тщательно оптимизированы.

Жизнеспособность низкий клеток и бисером невритов, наряду с чахлыми neurite роста, указывают токсичных культуры условий, которые могут возникнуть в результате неправильно подготовленных силикона. Пропуск или укорочения насыщения воды или сухой печи можно оставить всасывается этанола или воды в мембране, соответственно, который может диффундировать в средствах массовой информации и подчеркнуть клетки. Хорошо потерпевшего культур будет сократили жизнеспособность клеток, укороченные или отсутствующие невритов, вышитый бисером невритов и невритов, которые выглядят тугой или натянут. Травмы могут вызвать слипания в клеточных культурах, которые были хорошо дисперсной до травмы. Большие скопления может посрамить морфологического анализа. Для морфологического анализа уровень вреда должен быть настроен таким образом, что заметные изменения происходят, но клетки по-прежнему присутствуют с некоторыми невритов.

Рисунок 1 : A помечены схема устройства травмы. Вид сверху (A), (B) изометрическая проекция, вид спереди (C), (D) вид справа. Линейки шкалы применяется для ортогональных представлений (A, B и D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Кинематика механических оскорбления. (A) стадии перемещения историям над 5 импульсы в диапазоне амплитуд предписанного (предписанных амплитуд, перечислены в легенде) при загрузке не скважин. (B) стадии перемещения историям над 10 импульсами в диапазоне амплитуд предписанного (предписанных амплитуд, перечислены в легенде) при загрузке 52 буровые скважины. (C) среднего напряжения в каждой скважины с амплитудой перемещения стадии 3,3 мм (n = 5 измерений в колодец, средняя ошибка стандарт на хорошо = 0,029). Обратите внимание, что С4-F4 и C9-F9 нерастянутого контроля скважин. Эта цифра была изменена от Шерман и др. ¹¹ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Оптимизация культуры условия на силиконовой. (A) эффект различной плотности и Ламинин концентрация клеток на hiPSCN культур на силиконовой. Глыба увеличивается с увеличением плотности клеток и снижение концентрации Ламинин. Плотность и Ламинин концентрации клетки должны быть оптимизированы для достижения моно дисперсионные культур. Моно дисперсионные культур менее уязвимы для артефактов при количественной оценке. Обратите внимание, что оптимизировать визуализацию невритов было налажено динамический диапазон. Как следствие насыщенных гораздо ярче сома. Эта презентация является предпочтительной альтернативой оптимизации динамического диапазона в отношении сома, который делает гораздо тусклее невритов почти невидимым. Состояния, отмеченные красной площади считается оптимальным для экспериментов в vitro стретч травмы. (B) при оптимальных условиях, культур на силиконовые мембраны выглядеть культур на обычных жестких подложках. Левая панель показывает hiPSCNs, культивируемых на 33,750 клетки/см² с 3,3 мкг/мл Ламинин на обычных, жесткой 96-луночных плиты (субстрат культуры клеток является культура ткани лечение циклических олефинов Кополимер). Правой панели воспроизводит панели красным от (A). Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Фенотип травмы и ее зависимость концентрации Ламинин. (A) здоровой культуры, используя 10 мкг/мл Ламинин и 67.500 клеток/см². Невритов, долго не бисером. Есть несколько мертвых ядер и несколько сгустки. (B) культуры, с использованием тех же условиях культуры, ранения с 57% пиковой нагрузки и отображаемого после 4 ч невритов сокращаются или пропавших без вести и некоторые из них бусы (обозначается стрелками). Есть меньше Флуорексон AM-положительных клеток и более Флуорексон AM-отрицательные (т.е., мертвые) ядер. Травмы увеличилась слипания среди живых клеток. (C) 4 ч после травмы, neurite длину клеток снижается с увеличением напряжения в манере, которая зависит от концентрации Ламинин. (D) 4 ч после травмы, жизнеспособность клеток снижается с увеличением напряжения в манере, которая зависит от концентрации Ламинин. (E) 24 ч после травмы, neurite длину клеток снижается с увеличением напряжения в манере, которая зависит от концентрации Ламинин. (F) 24 ч после травмы, жизнеспособность клеток снижается с увеличением напряжения в манере, которая зависит от концентрации Ламинин. (n = 4 в бар, погрешностей, стандартное отклонение ± 1, масштаб баров = 100 мкм). Штамм значения выводятся из стадии перемещения с использованием данных из ранее публикации Шерман и др. ¹¹ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Технический чертеж из индентора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительная таблица 1: Пользовательские построен устройств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 2:96 хорошо пластины погрузчик распиновка схема соединений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный код файла 1: чертежи компьютерного проектирования травмы устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный код файла 2: компьютерного проектирования чертежи изготовления зажима плиты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительные 3 файла кода: 3D представление штамп геометрии, подходит для использования на 3D принтере с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный код файла 4: SubVI для MuStLiMo_si_initialize.vi, который является SubVI для motion_control.vi. Преобразует элементы в диалоговых окнах параметры для движения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительного кода файла 5: SubVI для нескольких прямой линии Moves_simplified.vi, который является SubVI для motion_control.vi. Преобразует элементы в диалоговых окнах параметры для движения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный код файла 6: SubVI для position_tracker.vi. Перемещение треков счетчик ввод от линейного энкодера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнительного кода 7: основы проекта LabVIEW. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный код файла 8: топ-уровня VI, которая перемещает устройство. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный код файла 9: SubVI для motion_control.vi. Выполняет быстрого перемещения, который тянется пластину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный код файла 10: SubVI для motion_control.vi. Выполняет медленного перемещения, что движется стадии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный код файла 11: SubVI для motion_control.vi. Земельные участки (обычно донными) перемещения истории в панели управления motion_control.vi. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный код файла 12: топ-уровня VI, которая записывает историю перемещений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный код файла 13: содержит Variable2, который обеспечивает взаимодействие между motion_control.vi и position_tracker.vi. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный код файла 14: чертеж печатной платы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный код файла 15: макет для печатных плат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Ключ для получения последовательной, biofidelic фенотип в этой модели является применение последовательного biofidelic механические оскорбление. Эта модель может генерировать импульса как 10-15 мс, которые похожи на длительности импульса для головы воздействия человека согласно трупной эксперименты^12,13короткой длительности. Согласованности это оскорбление зависит от выравнивания пластины с блоком индентора и последовательной смазка бойки. Когда блок индентора хорошо скоординированы, существует не тенденция в прикладной напрягаться по строкам или столбцам (рис. 2 c). Тонкий слой смазки обычно создает меньше трения, чем толстый слой, и вязкой смазки не рекомендуется, потому что они фол силикона и воспрепятствовать проходу света при микроскопии. Фактические стадии Амплитуда перемещения может существенно отвечают предписанные перемещения амплитуды когда используются многие бойки, и амплитуда перемещения установленных стадии большие (> 3 мм). Однако фактическое перемещение меньше, чем установленный перемещения на большие амплитуды, он по-прежнему повторяемые (рис. 2B). Таким образом большие, фактического перемещения амплитуд надежно достигается путем ввода предписанные значения превышает требуемое значение. Амплитуда перемещения вопросы только потому, что это легко записи прокси для пик мембраны штамм, который непосредственно измеряет механических оскорбление, которое вызывает патологии. Таким образом процедура, описанная для определения деформации мембраны от стадии перемещения имеет решающее значение. Этот процесс должен повторяться, если какие-либо крупные изменения к системе, которая влияет на взаимодействие между пластиной и бойки, например если разные диаметр бойки, различные индентора материалов, покрытий или различные типы силикона дном плиты используются. Процесс реорганизации блок индентора и определении нулевой позиции следует повторить в начале каждого эксперимента. Схематическое изображение растяжения устройства показано на рисунке 1. CAD-модели, необходимые для воспроизведения устройство предоставляются дополнительные материалы: «повреждения устройства - полное собрание - универсальный 3D. ШАГ '; связанные Билл материалов, предоставленных какДополнительная таблица 1: Пользовательские построен устройства - BOM.xlsx. Также увидите Дополнительные таблицы 2 96 хорошо плиты _loader – Цоколевка проводки Diagram.xlsx, который описывает кабельных соединений, которые соединяют различные компоненты систем. «Interconnector_circuit_board.dip» описывает плат, соединяющего кабели.

Если устройство отключается с этапа в середине его путешествия, этап будет двигаться после отрезали власть, потому что это подпружиненный. Когда восстанавливается питание, петля обратной связи обнаружит большой разницы между последней известной позиции предписанные и фактическое положение. Это вызовет на сцену, чтобы переместить внезапно на позицию она находилась на момент отключения устройства. Это резкое движение может привести к ошибкам в выходных данных кодировщика, поэтому следует соблюдать осторожность, чтобы отключить устройство, только тогда, когда в его неподключенных он покоится позицию в верхней части своей поездки.

Изготовление зажим предназначен для объединить тело и силиконовые нижней пластины в манере, которая позволяет оптимальную связь. С этой целью, есть три ключевые особенности в конструкции, представленные в дополнительном файле ' пресс умереть - универсальный 3D. ШАГ». Во-первых держатель тела зажим пластины параллельно нижней силикона. Если это правильно построен, это потребует без перестройки после первоначальной установки. Во-вторых слой поролона в зажим обеспечивает небольшое количество соответствия под плитой, как полностью жесткая система теоретически будет испытывать внезапное увеличение от нуля зажима для бесконечной зажима, когда зажим был закрыт. Положение перекладину и винт зажима регулируются таким образом, чтобы расстояние между двумя сторонами зажим может быть доработаны.

Следует приложить все усилия к тому, предоставлять яркий, белый фон позади точки на дне хорошо во время деформации характеристику экспериментов. Чем лучше контраст в эти образы, тем легче будет для автоматизации процесса измерения высоты и ширины точки, которая может стать утомительным для человека-оператора анализируя большой эксперимент. Высокоскоростной видеосъемка в нижней части скважины в плиту 96-луночных представляет проблемы, потому что стены также, как правило, отбрасывания теней. Использование купол света или осевой рассеянного света, который может осветить вдоль линии визирования камеры без затемнения изображения устраняет теней или зеркального отражения, которые возникнут с обычным источником света. Ярких доступен источник света должны использоваться потому что яркого освещения позволяет изображения, которые должны быть приобретены с короткое время экспозиции. Коротких продолжительностей свести к минимуму размытие движения. Обновление светоизлучающие диоды (СИД) в осевой рассеянный свет позволяет короче время экспозиции в высокоскоростной видео приобретения. Светодиоды можно обновить, открыв рассеянный свет осевой, удаление запасов светодиоды, монтаж 4 высокая мощность Светодиодных массивов на задней панели с использованием светодиодов держатели, подключив их к постоянного тока питания и сборкой рассеянный свет осевые (см. таблицу Материалы для каталога чисел). Недостатком обновление светодиодов является, что пассивно охлаждения светодиодов не могут храниться на более чем на несколько секунд из-за риска перегрева. Таким образом различные свет необходим для выравнивания после блока и камеры перестройки.

Представленный метод количественного определения деформации мембраны путем измерения дилатация точка штамп на мембраны относительно сырой, но он может масштабироваться до нескольких скважин на надежной основе. Поле деформации через дно хорошо можно охарактеризовать более подробно, с использованием цифровых изображений корреляции. Этот метод предполагает распыления пятнистым узором на базе скважины и затем изображений на высокоскоростной во время деформации. Коммерческое программное обеспечение может затем использоваться для количественного определения деформации в каждой точке изображения путем отслеживания эволюции крапинами узора.

Этот протокол создает многогранный, клинически значимых, стретч травмы фенотип в hiPSCNs. Гибель клеток, neurite дегенерация и neurite бисером являются все документально следы TBI в организме человека и животных моделей¹⁵. Ключ к успеху в этой модели установление и поддержание здоровой культуры. Вообще говоря протокол культуры клеток, разработанный с обычными жесткими пластинами является стоит отправной точкой для эластичного плиты культуры. Однако возможность, что в вопросе клетки могут по-разному реагируют на силиконовой всегда должны быть рассмотрены. Это особенно верно в отношении hiPSCNs, которые очень чувствительны к условиям культуры. Некоторые примеры оптимизации плотности и Ламинин концентрации клеток поставляются в разделе Представитель результаты (рис. 3, рис. 4). Активация силикона с плазменной обработки является жизненно важным. Силиконовый гидрофобный и инертной; в своем естественном состоянии он не будет привязан к Ламинин или других молекул, используемых для содействия клеток вложение. Плазменная обработка оказывает поверхности гидрофильных и предоставляет реактивной групп. Эти изменения позволяют молекул адгезии для привязки к силикона и поощрение вложения клеток. Важно отметить, что эффект лечения плазмы рассеивается в течение нескольких минут, пока поверхность погружен в жидкость, и поэтому процедуры, которые включают сушки поверхности активированного должно выполняться как можно быстрее. Простой способ проверить, если эффект от лечения плазмы стерлась является место капли воды на поверхности. На необработанных силикона капли будет шарик вверх в то время как на силиконовой плазмы лечить, он будет распространяться. С hiPSCNs, который мы использовали (см. Таблицу материалы), производитель рекомендует добавить Ламинин суспензию клеток, а не перед покрытием. Этот протокол включил этот подход успешно. Хотя сегментации в теории, можно с открытым исходным кодом или языки программирования общего назначения, для получения хороших результатов требуется высокая степень владения с помощью этих инструментов. Невритов часто трудно отличить от фонового сигнала, потому что они настолько тонкая. Поэтому мы рекомендуем использование средств коммерческого программного обеспечения, распространяемых высокое содержание микроскопии компаний с выделенных модулей для сегментации и количественной оценки нейронов, если они доступны. Даже с коммерческим программным обеспечением он мудр экспортировать изображения сегментации визуально проверить точность.

Существуют некоторые ограничения, связанные с работой в растягивающийся пластины, по сравнению с работы с обычными, жесткие пластины. Растягивающийся пластины может отражаться как обычно с воздушных целей. Однако очень трудно изображений с целями погружения. Объектив нефти может повредить силикона. Кроме того цель оказывает давление на силиконовые мембраны, как она движется вверх. Это давление вытесняет мембраны вертикально, что делает его трудно привести пример в фокус. Силиконовые мембраны, в настоящее время используется в изготовлении пластин, толщиной примерно 250 мкм. Эта толщина превышает Фокусное расстояние многих высокой мощности, погружение целей. Особое внимание необходимо заложить мембраны идеально плоской до зажима для достижения плоскостности, необходимые для микроскопии. Системы автофокусировка может компенсировать отклонения в плоскости готовые пластины в некоторой степени. Будущие версии протокола может предварительно напряжение мембраны, прежде чем он прикреплен к верхней пластине для обеспечения плоскостности. Процедуре свободных клей для склеивания силиконовые мембраны к верхней пластине¹⁴ считается важным преимуществом нынешнего протокола. Это устраняет риск нейротоксичность от клея, а также любые отклонения в плоскости из-за неоднородного Толщина клеевого слоя.

Несколькими электродами массивы обычно используются в экспериментах с hiPSCNs для оценки их зрелости и функциональность. К сожалению эти системы несовместимы с этой моделью, потому что субстрат культуры клеток является жестким. Это позволяет создать массив растягивающийся несколькими электродами, хотя это пока только было продемонстрировано в одном хорошо формате^16,17. Обратите внимание, что бойки можно индивидуально удалены из блока индентора, так что некоторые скважины не отображаются с отступом и может служить Шамс. Удаление индентора предотвращает отступы, но не полностью устранить механические загрузки, так как есть еще инерционного движения жидкости в скважинах, во время этапа. Стоит сравнить эти скважины, скважины в плитах, которые никогда не подвергались этап движения для измерения любых патологических влияние движение жидкости. Кроме того массив бойки в блоке должны быть bisymmetric (симметричные спереди назад и стороны в сторону). Эта предосторожность гарантирует, что пластины равномерно загружается во время отступы, так что стадии не наклон вбок и вызвать стержней для связывания их подшипников.

Одна из главных задач для терапевтических инноваций в нейротравма является сложность и неоднородность состояния. Травма применяет мультимодальной стресс для каждого типа клеток в центральной нервной системе одновременно. Нейроны надежно образующиеся человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) и в настоящее время широко доступны от коммерческих поставщиков. Инновация идет быстро в этой области, и другие типы нервных клеток например астроциты¹⁸ и микроглии¹⁹ также вытекают из hiPSCs. Вскоре, возможно, можно изолировать клетки автономной ответы каждого из этих типов клеток травмы в пробирке и затем Сопредседатель культуры различных типов клеток чтобы понять, как они общаются после травмы. Таким образом она может быть в конечном итоге можно воссоздать клинической проблемой снизу вверх тщательно понять ее в систему человека. Этот подход отличается от традиционного подхода, опираясь на грызунов модели и имеет потенциал, чтобы генерировать новые идеи, которые приводят к первой терапии для этого состояния общих, разрушительных и неразрешимыми.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
.010" Silicone Sheet	Specialty Manufacturing, Inc	#70P001200010	Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet
Sparkleen	Fisher Scientific	#043204
Nunc 256665	Fisher Scientific	#12-565-600	Bottomless 96 Well Plate
Kim Wipes	ULINE	S-8115
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	#PDC-001-HC
(3-Aminopropyl) triethoxysilane	Sigma-Aldrich	#440140	APTES
Parchment Paper	Reynolds	N/A
Dome Light	CCS inc	LFX2-100SW
Dome Light Power Supply	CCS inc	PSB-1024VB
Axial Diffuse Lighting Unit	Siemens	Nerlite DOAL-75-LED	Diffuse axial light
High Power LED Array	CREE	XLamp CXA2540	High Power LED Array
LED holder	Molex	1807200001	LED Holder
LED power supply	Mean Well	HLG-320H-36B	Constant Current Power Supply
FastCam Viewer software	Photron		camera softeware
Fastcam Mini UX50	Photron	N/A	High Speed Camera
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8	Nikon	#1455	High Speed Camera Lens
0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine	Sigma-Aldrich	#P4597
iCells	Cellular Dynamics International	#NRC-100-010-001
iCell media	Cellular Dynamics International	#NRM-100-121-001
iCell supplement	Cellular Dynamics International	#NRM-100-031-001
Laminin	Sigma-Aldrich	#L2020
Hoechst 33342	Fisher Scientific	#H3570
Calcein AM	Fisher Scientific	#C3099
voice coil actuator	BEI Kimco	LA43-67-000A
optical linear encoder	Renishaw	T1031-30A
servo drive	Copley Controls	Xenus XTL
Controller	National Instruments	cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller
cRIO chassis	National Instruments	cRIO 9113
digital input module	National Instruments	NI 9411
data acquistion chassis	National Instruments	NI 9113
LabVIEW	National Instruments		instrument control software
hiPSCNs	Cellular Dynamics International