JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы количественно эпидермального клеточной гибели лягушек с chytridiomycosis, с использованием двух методов. Во-первых мы используем маркировки конце терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник (TUNEL) в situ гистология для определения различия между клинически инфицированных и неинфицированных животных. Во-вторых мы проводим анализ временных рядов апоптоза над инфекции с помощью анализа белка каспазы-3/7.

Аннотация

Земноводные испытывают большие потери биоразнообразия во всем мире и одна из основных причин является chytridiomycosis инфекционных заболеваний. Это заболевание обусловлено грибкового патогена Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), который заражает и разрушает лягушка эпидермиса; Однако патологические изменения не характеризовались явным образом. Апоптоз (запрограммированная смерть клетки) может использоваться патогенами для повреждать ткани макроорганизма, но также может быть принимающей механизм болезни сопротивления для удаления патогена. В этом исследовании, мы количественно эпидермальных клеток смерть инфицированных и неинфицированных животных, с использованием двух различных анализов: терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник конце маркировки (TUNEL) и caspase 3/7. С помощью вентральных, спинной и ткани кожи бедра в TUNEL assay, мы наблюдаем мобильный смерти клетки эпидермиса в situ клинически зараженных животных и сравнивать гибель клеток с неинфицированным животных с помощью флуоресцентной микроскопии. Для того, чтобы определить, как изменить уровни апоптоз в эпидермисе течение инфекции мы удалить образцы мыс Совет недели над 8-недельного периода и использовать пробирного каспазы-3/7 с извлеченные протеины для количественной оценки деятельности в рамках образцы. Затем мы сопоставляем активность каспазы-3/7 с нагрузкой инфекции. TUNEL assay полезен для локализации клеток смерть на месте, но дорого и времени интенсивно на сэмпл. Assay каспазы-3/7 эффективен для больших выборок и времени курс экспериментов. Однако потому что маленькие лягушки мыс наконечник биопсии имеется ограниченный экстракт для выборки стандартизации через методы количественной оценки белков, таких как assay Брадфорд. Поэтому мы предлагаем оценки площади поверхности кожи через фотографического анализа мыс биопсий, чтобы избежать потребления экстракты во время выборки стандартизации.

Введение

Амфибии в настоящее время испытывают один наибольшие потери глобального биоразнообразия любой позвоночных таксонов1. Главной причиной этих падений является фатальным кожи chytridiomycosis болезни, вызванные грибкового патогена Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. Возбудитель поверхностно заражает эпидермис, что может привести к нарушению функции кожи, что приводит к тяжелой электролита потери, инфаркт миокарда и смерти3. В настоящее время изучаются различные потенциал принимающей иммунные механизмы против Bd , например антимикробных пептидов4,5, кожный бактериальной флоры6, иммунных клеток рецепторов7,8, и активность лимфоцитов9,10. Однако несколько исследований изучить ли эпидермальный апоптоз и клеток смерть является механизм иммунитета против этого смертоносного возбудителя.

Патология Bd -инфекции может быть смерть клетки, apoptosis (запрограммированная смерть клетки) или некроз (незапрограммированным смерти), в эпидермисе. Предыдущие исследования свидетельствуют о том, что инфекция Bd может индуцировать апоптоз, потому что нарушения внутриклеточного соединения наблюдается, когда кожа эксплантов подвергаются zoospore supernatants в vitro11. Кроме того дегенеративные изменения эпидермиса в Bd-инфицированных лягушки наблюдаются с помощью электронной микроскопии12,13. Транскриптомики анализы показывают, что apoptosis пути upregulated в14инфицированных кожи, и амфибии splenocytes проходят apoptosis, когда они подвергаются воздействию Bd supernatants в vitro15. Несмотря на растущий объем доказательств, предполагая, что Bd может вызвать apoptosis и принимающей ячейки смерти в пробирке, в vivo исследований, которые изучить или количественно апоптоз, что отсутствуют механизмы через прогрессирование инфекции. Кроме того это неизвестно, если узел использует апоптоз как оборонительные иммунной стратегия борьбы с Bd инфекции, или если апоптоз патологии заболеваний.

В этом исследовании, мы пытались обнаружить смерть эпидермальные клетки и апоптоз в зараженных животных в естественных условиях с помощью двух методов: assay протеина каспазы-3/7 и терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник маркировки конце () в situ assay TUNEL. Как каждый assay обнаруживает различные аспекты смерти клетки16, вместе эти методы обеспечивают полное понимание механизмов, участвующих в смерти клетки и обеспечить точное измерение эффекта. Assay каспазы-3/7 дает количественную оценку деятельности эффекторных caspases 3 и 7, который позволяет количественной оценки как внутренние и внешние апоптоз пути. В противоположность этому TUNEL assay выявляет фрагментацию ДНК, которая вызвана механизмов смерти клеток, включая апоптоза, некроз и pyroptosis17. Мы используем TUNEL assay расследовать на месте гибели клеток в пределах эпидермиса клинически инфицированных и неинфицированных животных, с использованием трех различных кожи секций: спинку, Вентер и бедра корробори Ложные жабы. Этот метод определяет анатомические сайт гибели клеток, а также отличительные его расположение в пределах конкретных слоев эпидермиса. Затем мы используем пробирного каспазы-3/7 провести количественную оценку серии времени апоптоза на протяжении 8-недельного инфекции в Австралийские квакши verreauxii alpina. Мы принимаем образцы кончик пальца две недели от же животных и возможность соотнести возбудителя инфекции нагрузки с активность каспазы-3/7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Университет Джеймса Кука одобрил животных этики в приложениях A1875 P. корробори и A1897 и A2171 для л. alpina.

1. Животноводство и мониторинг

  1. Дом животные индивидуально, в среде подходит для видов, с соответствующим водой, кормления и график уборки. Ежедневно проверяйте животных.
    1. Взрослые особи в критическом Ложные жабы корробори (для Assay TUNEL, раздел 4) и угрозой Австралийские квакши verreauxii alpina (для каспазы-3/7 assay, раздел 5), в дар от плен селекции зал. Сохранить животных на 15-18 ° C, на мох и гравий субстрат, туман их ежедневно с обратного осмоса вода и кормить 3 раза за неделю с кишки загружен сверчков.
  2. Сбор данных на каждый отдельным один раз за неделю. Тампоном лиц для Bd , как описано в шаге 2.1. Вес каждого животного практически 0,1 г, используя шкалу и измерить их морда провентилировать длины (SVL) с точностью до 0,01 мм, с помощью удаленного суппорты.
  3. После прививки (как описано в разделе 3) Проверьте животных ежедневно для клинических признаков инфекции (нерегулярных кожи Слау, inappetence, покраснение ног, летаргия или задержки восстанавливающих рефлекс) животных этики руководящим принципам. Усыпить животных, если имеются клинические признаки и заболеваемости.
    1. Усыпить с передозировкой Метансульфонат tricaine (MS222) (0,1% w/v MS222, до pH 6-7 с бикарбонатом натрия в возрасте водопроводной воды). Держите животных в MS222 10 мин после всех движение прекращается, и они отображают без реакции на стимулы.

2. тестирование для Bd инфекции

  1. Свабирование скважин для Bd
    1. Тампоном каждое животное новых стерильных района тампоном (один мазок на животное). Используйте следующий способ тампонирования: пять раз на Вентер, пять раз на каждом бедра, стороне и конечностей. Это в общей сложности 45 штрихов.
    2. Осторожно поверните тампон во время и между штрихами для обеспечения эффективного захвата ДНК. Разорвать кончик тампона в 1,5 мл microcentrifuge трубы и хранить при температуре от-20 ° C до добычи.
  2. Экстракции ДНК и ПЦР-анализа
    1. Экстракт геномной ДНК от тампонов, добавляя 50 мкл Реагента коммерчески доступных экстракции ДНК с 30-40 мг шариков кремний 0,5 мм. Шарик бить образцы в шарик колотушки клеток аннулятора максимальной скоростью за 2 мин. После шаг било шарик Центрифугуйте образцы на 2000 x г за 1 мин.
    2. Проинкубируйте образцы на 100 ° C в течение 10 мин и дайте ему остыть. Центрифугуйте образцы на 5000 g x 3 мин, а затем передавать отдельные 1,5 мл пробирок микро супернатант и хранить при температуре от-20 ° C до ПЦР.
    3. Использование количественного PCR (ПЦР) после Бойл и др. 200418 для анализа нагрузки инфекции. Используйте следующие изменения:
      1. Разбавьте экстракции ДНК образцов 6:100 двойной деионизированной водой. 0,7 мкл бычьим сывороточным альбумином (БСА), для каждой скважины, чтобы помочь предотвратить ингибирование ПЦР. Запуск каждого образца в singlicate. На каждой табличке используйте отрицательные (без шаблона) управления и позитивные с серию разрежения стандартов для оценки нагрузки zoospore (инфекции).

3. прививки

  1. Культура- Bd
    1. Готовят отвар культуры путем добавления 16 g Триптон, гидролизат желатина 2 g и 4 g лактозы (TGHL) 1 Л деионизированной воды. Автоклав (121 ° C 40 мин) и позволяют отвар охладить.
    2. Прививать изолировать Bd (в данном случае, изолированных от Нового Южного Уэльса изолировать, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, проезд № 11) в TGHL бульон и растут на 7 d при 23 ° C, а затем передать плиты агара TGHL бульон культуры.
    3. Чтобы сделать плиты, добавьте 16 g Триптон, гидролизат желатина 2 g, 4 g лактозы (TGHL) и 10 g бактериологического агар до 1 Л деионизированной воды и автоклав (121 ° C 40 мин). После того, как смесь достаточно прохладно, чтобы коснуться, но прежде чем он твердеет, залить TGHL агар в 92 мм диаметр культуры пластин так, что они являются полностью 1/4 до 1/3, в биологической безопасности II класса кабинета.
    4. Когда затвердевшим агар и остыть, прививок каждой пластины с 0,5 мл Bd из жидкого бульона и равномерно. Разрешить Bd бульон смесь сухая пластина для примерно 1 час и затем уплотнение пластины с пластиковой парафин фильм. Инкубируйте плиты агара стороне вниз при 23 ° C за 5-7 d.
  2. Наводнение пластины для решения прививки zoospore
    1. Проверьте zoospore подвижности под Перевернутый световой микроскоп для обеспечения жизнеспособности ежедневно перед прививкой. Когда zoospore релиз является высокой, с много zoospores, плавание за пределами данные, культура готова к вакцинации.
    2. Наводнение каждой пластины с 3 мл возрасте водопроводной воды или искусственный пруд воды, путем лить воду в пластину и инкубации при комнатной температуре за 10 минут, чтобы позволить zoospores выпустить в воду. После инкубационного периода сцеживаться zoospore подвеска в новый стерильный контейнер.
    3. Оценка концентрации zoospore, следуя инструкциям изготовителя, с помощью haemocytometer. После того, как концентрация zoospore подвеска, как известно, разбавляют подвеска к концентрации 1 x 10 zoospores6 на 3 мл возрасте водопроводной водой.
  3. Прививок животных
    1. Прививать каждое животное лить 3 мл смеси посевным материалом над своей Вентер19 в контейнерах отдельных 50 мл. Разрешить превышение посевным материалом для сбора в базу прививка контейнера. Оставить каждое животное в отдельных прививка контейнер для 24 ч для обеспечения инфекции и после 24 ч прививка, возвращение каждого человека к дезинфекции террариум.
      1. Лечить террариумах с помощью решения коммерческих отбеливатель 13% объем/объем (v/v)20, по крайней мере дважды промыть водой, а затем дайте высохнуть не менее 24 ч.
    2. Для Bd-негативные элементы управления, макет прививок животных, используя те же методы, как 3.2-3.3, но наводнения Bd-бесплатные агар пластины с 5 мл возрасте водопроводной воды вместо из Bd прививку плиты агара.

4. Assay TUNEL

  1. Усыпить животных, которые наблюдаются клинические признаки chytridiomycosis, как описано в шаге 1.3.1 и равное количество Bd-отрицательные контрольных животных.
  2. Рассечения кожи (спинной, вентральной и бедро) проб из каждого животного. Исправьте кожных проб на 2 ч в 4% v/v фосфатного буфера формальдегида. Короткие и последовательной фиксации времени позволяет ткани будет полностью исправлена, но также позволяет для эффективной и точной иммуногистохимия пятнать. Затем перенесите 80% этанола до встраивания для разрезания.
  3. Внедрите кожи в парафин для гистологической подготовки следующие стандартные методы21. Вкратце протокол является следующим:
    1. Обезвоживания тканей в градуированных серии этанола и снимите этанола с ксилола. Внедрить в парафин ткани и место всех трех кожных проб для каждого человека в одном парафин блока.
  4. Раздел кожи, используя микротом после стандартных гистологические подготовку21. В разделе ткани серийно на 5 мкм и затем аффикс гидрофильные стеклянных скольжениях. Место четыре последовательных histosections каждого типа кожи на слайд. Сделать три слайда на лицо с разделами серийный кожи, помните, что каждый слайд имеет четыре секции каждой ткани прикреплена.
  5. Пятно слайды в следующем порядке:
    1. Пятно первый слайд с гематоксилином следуют эозина counterstaining (H & E). Этот слайд должен визуализировать расположение Bd данные внутри кожи.
    2. Пятно второго слайда после коммерчески доступных assay TUNEL для гистологической подготовки и следуйте инструкциям производителя, которые описаны ниже.
      1. Во-первых deparaffinize разделов ткани в опарник coplin, омыв слайды с тремя изменениями ксилол 5 мин в мыть и следуйте с двумя изменениями 100% этанола за 5 мин каждый мыть. Следуйте с одной мыть этанола 95% за 3 мин и затем 70% этанола на 3 мин закончить с одной стирки PBS на 5 мин.
      2. Предварительной обработки ткани с свежезаваренным разреженных белка, переваривание фермента (протеиназы K в концентрации 20 мкг/мл разбавленной в PBS) и добавить непосредственно на слайд. Позволяют Инкубируйте 15 мин мыть с двумя изменениями PBS в опарник coplin на 2 мин.
      3. Кран лишнюю жидкость и утолить в 3,0% перекиси водорода в PBS в опарник coplin за 2 мин при комнатной температуре. Промойте дважды с PBS, за пять минут каждый мыть.
      4. Избыток жидкости, а затем применить 75 мкл/5 см2 буфера равновесия непосредственно на ткани на слайде. Инкубируйте 10 s. Tap избыток жидкости вокруг раздела и применять 55 мкл/5 см2 работы терминала deoxynucleotidyl фермента tranferase (TdT). Инкубировать в камере увлажненные за 1 ч при 37 ° C.
      5. После инкубации TdT, поместите слайд в опарник coplin рабочей силы остановка/мыть буфера, агитировать за 15 s и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре. Вымойте слайд с тремя изменениями PBS 1 мин в мыть. Кран лишнюю жидкость.
      6. Примените конъюгат анти digoxigenin (родамин) которая нагрелась до комнатной температуры в ткани, 65 мкл/5 см2. Инкубировать в камере увлажненные за 30 мин при комнатной температуре и избегать воздействия света. Вымойте с четырьмя изменения PBS 2 мин в мыть. Кран лишнюю жидкость.
      7. Отделка, добавив 15 мкл 0,5 - 1 мкг/мл DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) в среде монтажа слайда к слайду, который действует как пятно счетчика. Затем накрыть крышкой скольжения и печать с лак или резиновый клей. Разрешить слайды для просушки в темноте, как assay светочувствительный.
    3. Пятно третий слайд окрашивается с помощью TUNEL assay и DAPI изображение, но использовать в качестве положительной и отрицательной контроля для каждого образца.
      Примечание: Из 4 histosections на слайдах управления, первые 2 положительный контроль реплицирует и последние 2 реплицирует отрицательного контроля.
      1. Для положительных элементов управления, вместо того, чтобы шаг 4.5.2.2, предварительно обрабатывать ткани с DN буфера (30 мм trizma база, рН 7,2, 4 мм2MgCl 0,1 ДДТ) и пусть инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем растворить Dnase в DN буфере для конечной концентрации 0.1ug / мл и применить его непосредственно к слайду. Инкубируйте 15 минут при комнатной температуре.  Затем промойте слайд 5 мыть dH2O 3 минуты каждый мыть. Помарки избыток жидкости. Затем возобновите TUNEL assay, как указано в разделе 4.5.2.3.
      2. Для отрицательных элементов управления не добавить фермента tranferase (TdT) терминала deoxynucleotidyl этих образцов (как описано в разделе 4.5.2.4).
  6. Соблюдайте TUNEL слайды сразу же после завершения анализа.
    1. Возьмите фотографии случайные интервалы вдоль каждой секции кожи на 200 X с помощью флуоресцентный Микроскоп, используя фильтры для обеих родамин пятно, которое показывает apoptotic клетки и появляется красный и DAPI, который показывает все ядра и появляется синий, так что накладкой клетки могут быть созданы. Убедитесь, что по крайней мере 100 клеток фотографируются в каждой секции кожи на сэмпл. Хранить слайды в коробке темный микроскопа при-20 ° C.
    2. Подсчитать ячейки (тонированный голубой DAPI) на изображение. Убедитесь, что по крайней мере 100 клеток учитываются в разделе кожи. Достичь 100 клеток, подсчитать все ячейки в пределах изображения. Если меньше чем 100 клетки присутствуют в одном изображении, граф другое изображение до тех пор, пока по крайней мере 100 клеток достигаются каждой секции кожи на животное.
    3. Далее подсчитать количество TUNEL клеток в те же образы (красный родамин окрашенные). TUNEL позитивные клетки, которые указывают апоптоза и не некроза или фона, представляют собой отдельные ячейки с Светлоклеточная краями (мембраны нетронутыми с не lysis). Иногда клетки сокращаться в форме apoptotic тела.
    4. Найдите районы, учтенные в TUNEL assay и анализировать соответствующие регионы на запятнанных H & E histosections. Убедитесь, что запятнанных H & E разделов соответствуют сайты Bd инфекции, которая обеспечивает Bd-зараженных сайтов используются при подсчете apoptotic клеток в TUNEL assay.

5. Caspase 3/7 Assay

  1. Собирать мыс советы от каждого животного ( Bd- воздействию и Bd- отрицательные) один раз в неделю через 3 недели поста прививки и раз в две недели до конца эксперимента, до 8 пальцы на единицу.
    1. Вырезать кончик пальца на второй фаланги с пламенем стерилизовать ножницами и место в 1,5 мл микропробирок и немедленно заморозить при температуре-80 ° C.
  2. Экстракт белков из образца замороженный палец.
    1. Поместите образцы в 100 мкл пример буфера (25 мм HEPES рН 7, 5 мм MgCl2) с двумя бусы из нержавеющей стали (3,2 мм) в 1,5 мл микропробирок колпачок. Лизируйте образцы по 4 циклов шарик 1 мин, победив на максимальной скорости (в же било шарик как используется в шаг 1.2.1) следуют 3 мин на льду. После лизиса Центрифугуйте образцы на 12000 x g и 4 ° C для 5 минут соберите супернатант для использования в assay.
  3. Количественно определить концентрацию белка на сэмпл, используя assay Брадфорд.
    1. В 384 хорошо пластины смешать 10 мкл белков экстракта с 10 мкл Реагента Брэдфорд и инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре. Выполнять каждый образец в двух экземплярах, наряду с серии 5 раз BSA разбавления стандартов. Читайте поглощения в 595 Нм на читателя пластины поглощения.
  4. В качестве альтернативы если образцы кончик пальца слишком малы (концентрация белка находится рядом минимальный стандарт, как определено от assay Брадфорд на шаге 4.3.1, или если лягушек, которые отбираются под 3 g общий вес), стандартизировать образцов путем оценки поверхности кожи область, используя фотографии, вместо assay Брадфорд.
    1. Перед извлечением белки из образца для caspase assay, фотография каждый палец на 40 кратном увеличении с помощью инвертированного микроскопа света.
    2. Проанализируйте образец мыс, с помощью компьютера изображений программное обеспечение, путем оценки области ног. Сделать это, создав линию вокруг края пальца клип и имеют изображений программного обеспечения оценки область в пределах формы. Затем умножить этой области Пи (3.14), который будет примерная площадь поверхности образца кожи 3-режиме (как длина х сечение (Пи х диаметр) дает внешняя поверхность трубки).
  5. Выполните assay каспазы-3/7.
    1. В 384 хорошо люминесценции тарелку добавьте 10 мкл Реагента коммерчески доступных caspase 3/7 и 10 мкл белков экстракта. Запуск каждого образца в трех экземплярах.
    2. Смешайте реактивы, медленно покачивая пластину для 15 s. инкубировать пластину от света на 30 минут при комнатной температуре. Измерения люминесценции, используя читателя светящиеся пластины.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

TUNEL Assay

Там были более TUNEL позитивные клетки в зараженных животных, чем неинфицированных контрольных животных. В месте расположения TUNEL положительных клеток различались в инфицированных и контроля животных. В животных управле...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы исследовали эпидермальный апоптоз и смерть клетки как потенциального механизма патологии chytridiomycosis смертельной болезнью или механизма болезни сопротивления в Bd восприимчивых видов. Мы использовали два метода оценки смерть клетки эпидермиса, assay TUNEL для в месте смерти анал...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим следующих людей, которые помогал с земледелия и сбора данных: D. Tegtmeier, C. де Йонг, J. Hawkes, K. Фоссену, S. Персиваль, м. Мак-Вильямс, L. Бертола, м. Стюарт, н. Харни и т. Knavel; и м. Merces для помощи с вскрытия. Мы также хотели бы поблагодарить M. McFadden, P. Харлоу и Таронга зоопарк для повышения л. alpinaи G. Marantelli для повышения P. корробори. Мы благодарим F. Pasmans, A. Martel для консультации по апоптоз анализов, C. Константин, а. Кладник и р. Уэбб для помощи с TUNEL assay, и т. Emeto и W. Weßels для помощи с протоколом и комплект для assay каспазы-3/7. Эта рукопись и протокол заимствован из Brannelly et al 2017 Коллегиального J22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
POLARstar OmegaBMG LabtechLuminescent plate reader
384 well flat clear bottom plateCorning3707
384 well low flange white flat bottom plateCorning3570
Agar Bacteriological (Oxoid)FisherOXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered FormalinFisher6764254
Lactose Broth (Oxoid)FisherOXCM0137B
Sodium BicarbonateFisherBP328-500
Tricane-S (MS-222)FisherNC0872873
TryptoneFisherBP1421-500
Bovine Serum AlbuminInvitrogen15561020
Sterile rayon swabMedical Wire & EquipmentMW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection KitMerck MilliporeS7165
Coomassie Bradford reagentPierce23200
Caspase Glo  3/7PromegaG8090
HEPES bufferSigma AldrichH0887-20ML
Magnesium chlorideSigma Aldrich1374248-1G
Gelatin hydrolysate EnzymaticSigma-AldrichG0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X)Thermo/Life20-012-043
PrepmanThermo/Life4318930
TaqMan Fast Advanced Master MixThermoFisher4444556
ParafilmBemisPM996
Clorox bleachClorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular GradeFisherBP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscopeCarl ZeissFlorescent microscope
3.2mm stainless steel beadsBioSpec11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		TaqmanIndividual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		TaqmanIndividual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′)TaqmanIndividual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR InstrumentsQiagenqPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5mlFisher02-681-372
Cell culture petri platesNunc263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mmBioSpec11079105Z

Ссылки

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
  4. Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
  5. Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
  6. Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
  7. Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
  8. Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127(2015).
  9. Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
  10. Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069(2016).
  11. Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
  12. Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
  13. Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
  14. Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
  15. Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
  16. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
  17. Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
  18. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
  19. Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
  20. Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
  21. Woods, A., Ellis, R. Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).
  22. Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135CaspaseTUNEL

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены