Крыса модель Центральной усталости, с использованием модифицированных несколько метод платформы

Резюме

Здесь мы представляем протокол представить модель крыса Центральной усталости, используя измененный метод множественные платформы (MMPM).

Аннотация

В этой статье, мы ввели крысы модель Центральной усталость, используя измененный метод множественные платформы (MMPM). Поле несколько платформа была разработана как резервуар для воды с узкими платформ на дне. Модели крыс были введены в бак и стоял на платформах для 14 h (18:00-8:00) в день в течение 21 дней подряд, с пустой элемент управления группой для контраста. В конце моделирования крысы в группе модель показал очевидное усталый вид. Для оценки модели, мы провели несколько поведенческие тесты, включая открытое поле тест (часто), повышенный плюс лабиринт (EPM) и испытания на исчерпывающий плавательный (ES). Результаты показали что тревога, нарушение пространственного познания, производительность бедных мышцы и отказался добровольной деятельности, представлены в модели крыс подтвердить диагноз Центральной усталости. Изменения центральной нейротрансмиттерами также проверить результат. В заключение модель успешно имитировать Центральной усталость, и будущие исследования с моделью может помочь выявить патологический механизм заболевания.

Введение

Усталость является одним из основных факторов, угрожающих здоровью человека¹. В последние десятилетия различные исследования доказали, что усталость периферийно срабатывает, но централизованно управляемых и всегда сопровождается эмоциональные и когнитивные расстройства. Итальянского физиолога A. Mosso впервые предложил слово Центральной усталость². Он обычно определяется как ограниченный добровольной деятельности и познания расстройство из-за дисфункции передачи импульса центральной нервной системы (ЦНС)³. По сравнению с периферической мышечной усталости, Центральный усталость подчеркивает изменения в ЦНС, а также последующего эмоционального/поведенческих беспорядков, включая депрессии, тревоги, познание обесценения и потеря памяти. Одно из исследований показывает, что многие факторы могут вызвать Центральной усталость, среди которых чрезмерной физической активности и психического стресса являются весьма необходимым⁴. Что касается патогенеза теории как триптофан Кинуренин путь гипотеза⁵ объяснить изменения в определенных путей; Однако более углубленные исследования по-прежнему обязаны выявить корреляции Центральной периферической Центральной усталости.

Как основной механизм центральной усталости до сих пор неясно, эффективную модель животных является весьма важным для дальнейших исследований. Существующие модели усталость главным образом вызвано чрезмерное упражнения, как беговые дорожки⁶ и загружен вес плавательный⁷, с мало заботит о психических факторов. Чтобы лучше имитировать развития Центральной усталость, наша группа разработала модель Крыса с MMPM. Во время процесса моделирования крысы стоять на узкие платформах в поле несколько платформа для долгих часов, включая часть времени сна. Отличается от модели чрезмерное упражнения, MMPM модель использует лишение сна в частично как фактор психического при рассмотрении сложных патогенеза Центральной усталости.

Для оценки модели мы используем часто и EPM тесты для определения тревоги настроение и добровольной деятельности. ES испытание проводится для определения производительности периферические миорелаксанты. Кроме того, мы принимаем мозга крысы и обнаруживать допамина (DA) / содержание серотонина (5-HT) в обоих hypothalamuses наблюдать различия Центральный нейромедиатор.

Протокол, представленные ниже предназначен для модели Центральной усталости, вызванных неоднократные физической активности и недостаток сна, подражая общее состояние в жизни человека. Однако регулируя продолжительность модель, он может использоваться во многих других областях, как наблюдение и стресс исследования сна. В будущем исследования, мы надеемся, что эта модель поможет обнаружить больше ЦНС изменений и их связь с периферической системы, выявить механизму патогенеза Центральной усталости.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все животные были сохранены в соответствии с руководящими принципами китайского законодательства об использовании этические и заботиться о лабораторных животных.

1. Предварительное моделирование подготовка

1. Подготовка лабораторных
   1. Запустите УФ-лампа для по крайней мере 30 минут до эксперимента.
   2. Управление лабораторной температуре 25 ± 3 ° C и относительной влажности воздуха около 30%.
   3. Включите лаборатории света в 6:00 и в 18:00 учредить 12 h/12 h свет/темно цикла выключить его.
2. Конструкция коробки множественные платформы
   1. Постройте непрозрачный полиэтиленовый резервуар без крышки 110 × 60 × 40 см³.
   2. Исправить пятнадцать круговыми платформ (h = 8 см, d = 6,5 см) в нижней части бака, которые упорядоченно распространять в три строки и пять столбцов. Оставьте достаточно места между каждой платформы, примерно 10 см между столбцами и 13 см между рядами.
   3. Установить выход воды на боковой стороне бака и установить кран.
   4. Сделайте обложку железо-сетка для танка с коробкой пищи, висит на нем.
3. Группировка и жилищного строительства крыс
   Примечание: Самцов крыс Wistar 8 недель старые, весом около 200-210 g, используются в эксперименте. Крысы живут в группах в ходе процесса моделирования.
   1. Численность крыс хвост корни с маркером.
   2. Взвешивание крыс, исключить чрезвычайно легкие или тяжелые из них и произвольно разделите остальные модели и управления группы.
   3. Аккуратно вставьте крысы чистые клетки и позволяют им акклиматизироваться в лабораторию для по крайней мере 3 дней. Обеспечить достаточное количество воды и продуктов питания.

2. Моделирование с MMPM

Примечание: Этот процесс начинается в 18:00 и заканчивается в 8:00 на следующий день, в общей сложности 14 ч в день, свыше 21 дня. Чтобы избежать вмешательства факторов, тот же человек не требуется проводить весь эксперимент, во время ношения же лаборатории пальто. 10 крыс Вистара используются в эксперименте.

1. Установите резервуар на плоской поверхности, например, слово. Затем заполните бак с примерно 7 см теплой воды (25 ± 3 ° C), примерно в 1 см ниже плоские платформы.
2. Подготовьте достаточно продуктов питания и напитков для всех крыс в баке за 1 день. Положить корм и воду в поле питания и повесьте его на обложке.
   Примечание: Некоторые умные крыс научиться отдыхать на блоке питания. Если это так, гнать их обратно в бак.
3. Взять модель группа крыс из клетки, захватить их за хвост и положил их аккуратно в бак. Запуск всех крыс в воде вместо платформ, чтобы мотивировать их страх перед водой. Убедитесь, что каждый Крыса получает платформу, чтобы стоять на, в то время как крысы контрольной группы остаются в их оригинальных клеток с достаточно пищи и воды.
4. Покрытие бака. Контролировать крыс, чтобы избежать случайного повреждения. Если крыса остается в воде для более чем 1 час без восхождение на платформу, выберите его из аквариума и удалить его из теста.
5. После 14 h взять модель крыс из аквариума и высушите их волосы с сушилкой. Повторно Марк крыс хвосты, если оно исчезает. Вернуть их оригинальный клетки крыс и предоставить им достаточно пищи и воды.
6. Очистите каждый уголок бака. Поднять одной стороне бака и откройте кран для оттока сточных вод.
7. Стерилизовать резервуар с распылителем 75% этанола и подвергайте его воздействию УФ-излучения.

3. модель оценки: Поведенческие тест

Примечание: Все тесты выполняются в поведенческих лаборатории. Шум и дополнительный свет не разрешается во время выполнения теста избежать беспорядков. Если возможно используйте же лица для проведения каждого испытания. Темное Пальто и перчатки необходимы для признания серой шкалы в обработке изображений. Выполнение часто сначала как наименее влияет на поведение крыс.

1. ЧАСТО
   1. Проверьте записи над открытые поля чтобы убедиться, что он правильно подключен к рабочей станции и охватывает каждый угол окна. Отрегулируйте освещение, чтобы устранить тени в поле.
   2. Переместите крысы в поведенческих лаборатории в их оригинальных клеток. Позвольте им акклиматизироваться для по крайней мере 1 час до испытания.
   3. Чистить и дезинфицировать поле с 75% этанола для обеспечения что нет экскременты или запах слева от предыдущих эксперимента.
   4. Удалить крысы из клетки, ее обратно и осторожно положил его в центральной области окна. Быстро отступить оружия из окна так, чтобы не блокировать выстрел.
   5. Введите номер крысы и начать запись. Граф и запись частоты крыса вертикальных мероприятий, включая воспитание и альпинизм.
   6. После 5 минут остановить запись, взять крыс из коробки и вернуть его в клетке.
   7. Повторите шаги 3.1.3 - 3.1.6 до тех пор, пока все крысы закончили тест.
2. EPM
   1. Выполните шаги предварительной проверки и адаптационного как OFT (шаги 3.1.1 - 3.1.2).
   2. Удалить крысы из клетки, ее обратно и осторожно положил его на стыке часть два оружия. Земля крысы к левой открытой руки и быстро оставить так, чтобы не блокировать выстрел.
   3. Введите номер крысы и начать запись. Граф и запись частоты различных руку входов. Если крыса падает лабиринт в тесте, забрать его и отправить его обратно в лабиринте. Записать подробные сведения для анализа данных.
   4. После 5 минут остановить запись, взять крыс вне и вернуть его в клетке.
   5. Удалять экскременты и протрите лабиринт с 75% этанола, чтобы устранить запах бывший крыса.
   6. Повторите шаги 3.2.2 - 3.2.5 до тех пор, пока все крысы закончили тест.
3. ES тест
   1. Заполните резервуар плавательный (70 × 30 × 110 см³) с теплой (25 ± 3 ° C) воды 80 см.
      Примечание: Если есть термостат в баке, температура воды устанавливается около 37 ° C, который похож на крысу температуры тела. Если нет, установите его до комнатной температуры для поддержания постоянной.
   2. Нагрузки для каждого Крыса с pin букетов и связать его осторожно на корню хвоста. Груз весит 10% массы крыса.
   3. Grab крыса, хвост и бросить его в плавательный танк. Если крысы сговор или цепляться за стены, отличает их и управлять их обратно в воду.
   4. Начало времени в момент, когда крысы положить в воду и остановка времени, когда он переполнен, который проявляется как неспособность бороться из воды с рот и нос под водой для более чем 10 s.
      Примечание: Иногда, истощения и утопление происходят внезапно. Будьте уверены иметь достаточное количество экспериментаторов для записи и сохранения животного в то же время.
   5. Удаление исчерпаны крыс из воды без прерывания работы других. Сухие волосы, заново пометить их числа и отправить их обратно к клетке.
   6. Меняйте воду в бак после завершения одной группы. После того, как сделали все крысы, пустые плавательный танк и чистить и стерилизовать его с этанолом и ультрафиолетового излучения.

4. модель оценки: Центральный нейромедиатор обнаружения

1. Анестезировать Крыса с внутри брюшной полости для инъекций 10% хлораль гидрат (3 мл/кг), до тех пор, пока он находится в бессознательном состоянии.
2. Обезглавить крыса.
3. Сделать продольный разрез вдоль линии после медиальной, откройте черепной коробки для обеих сторон и разоблачить мозга. Переверните черепной коробки, удаление мозга и поставить мозг на мешок льда.
4. Отделить и удалить гипоталамусе, который является ромбовидная область в центральной части основания головного мозга, которая имеет четкую границу с окружающих тканей. Поместите его в стерильную пробирку и заморозить жидким азотом. Храните все образцы в холодильнике-80 ° С.
5. Определить содержание да и 5-HT в гипоталамусе, с помощью высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)⁸.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы описываем крысы модель Центральной усталости, с помощью MMPM. 24 крыс Вистара случайным образом разделены в контрольной группе и группе модель с 12 крыс в каждой группе. Модели аппарат предназначен как резервуар для воды с узкими платформ на дне (рис. 1). К...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

MMPM первоначально предназначена для сна лишений⁹. Крысы являются запускаемых в резервуар с водой с платформами, на нижней. Движимый инстинктивное страх перед водой, крыс стоять на платформах и происходит без сна. Исследование показывает, что различные часов лишения сна прив...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
multiple platform sleep deprivation water tank	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		110cm x 60cm x 40cm. There are 15 plastic small platforms at the bottom. The small platform is 6.5cm in diameter and 8cm high
Wistar rats	Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Company	license number SYXK (Beijing) 2016-0011	Use 32 Wistar healthy male rats ,8 week old (200-210 g)
Agilent 1100LC high performance liquid chromatograph	Agilent	G1379A, G1311A, G1313A , G1316A	G1379A, G1311A type chromatographic pump, G1313A automatic sampler, G1316A column temperature box
DECADE II SDC electrochemical detector	Dutch ANTEC company		glassy carbon electrode, Ag/AgCl reference electrode, workstations (Clarity CHS)
Biofuge Stratos high-speed refrigeration centrifuge	HERAEUS
VCX130 ultrasonic fracturing instrument	SONICS
ACS-ZEAS electronic scale	Phos technology development, Beijing.		The weight of the weighing rats can be accurate to 0.1g.
Open Field Box	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		wooden box of open field  100 cm by 100 cm x 40 cm, inside wall and bottom as the gray.The bottom is divided into 25 equal area squares, each of which is 20cm x 20cm, and the 16 grids along the outer wall are the external ones, and the other 9 grids are central.The camera is mounted above the median.
Elevated Plus-maze	Beijing zhongshi dechuang technology development co. LTD.		The open arms and close  arms of the cross are composed of 30cm x 5cm x 15cm, and the central area is 5cm x 5cm, with a camera mounted above the center and 45cm high.
rat swimming bucket.	Zhenhua biological instrument equipment co., LTD. Anhui,China.		The volume of plastic drum is 70cm x 30cm x 110cm, which is used for swimming in rats.
Thermometer	Shiya instrument co., LTD., changzhou,China.		Control water temperature
Small water pump	Xincheng technology co., LTD., chengdu,China.		Used for water tank and swimming behavior.
Ethovition3.0 behavioral software.	Nuldus,Netherlands		Measurement analysis of rat behavior videos.