Синтез многостенные углеродные нанотрубки, модифицированных наночастиц серебра и оценки их антибактериальная деятельность и цитотоксических свойств

Резюме

В этом исследовании были синтезированы антимикробной наноматериалов кислотного окисления многостенными углеродными нанотрубками и последующих редуктивной осаждения наночастиц серебра. Антимикробной активности и цитотоксичность тесты были выполнены с наноматериалы как подготовлено.

Аннотация

В этом исследовании многостенные углеродные нанотрубки (MWCNTs) относились с водного раствора серной кислоты решение сформировать на основе кислорода функциональной группы. Серебряный MWCNTs были подготовлены редуктивной осаждения серебра из водного раствора AgNO₃ на окисленных MWCNTs. Учитывая уникальный цвет CNTs, невозможно применить их к минимальной концентрации тормозящий или анализов митохондриальной токсичности для оценки токсичности и антибактериальные свойства, поскольку они будут мешать анализов. Ингибирование зоны и минимальная бактерицидная концентрация для Ag-MWCNTs были измерены и Live/мертвые и Трипановый синий анализов были использованы для оценки токсичности и антибактериальные свойства без мешать с цветом нанотрубок.

Введение

Конечной целью данного исследования является сделать экологически антибактериальные наноматериалов, который может подавлять рост бактерий, что форма биопленки. Эти антибактериальные наноматериалов имеют потенциал, чтобы преодолеть проблемы токсичности и антибиотикам сопротивление широко используемых химических веществ или антибактериальной химических соединений. Биопленки – гидратированных внеклеточного полимерных вещество (EPS), которое состоит из полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот и липидов^1,2. Биоплёнки предотвращения проникновения посторонних веществ и помогают бактерии растут энергично^3,4. Биоплёнки вызывают запах и хронические инфекционные заболевания^5,6. Methylobacterium spp., например, растет, придерживаясь места, где вода всегда присутствует или где трудно обеспечить бактериальных искоренения на постоянной основе, например теплообменников кондиционеров воздуха, душевые и медицинские приборы. Эти типы биоплёнки вызывают запах и хронические инфекционные заболевания^5,6.

Как правило химические вещества или антибактериальной химических соединений используются для подавляют рост бактерий, которые формируют биопленки. Появление устойчивых к антибиотикам бактерий и озабоченности по поводу безопасности в естественных условиях химических веществ являются движущей необходимость разработки новых материалов для предотвращения образования биопленки и подавляют рост бактерий.

В этом исследовании противомикробные наноматериалов синтезируются которые свободны от антибиотикорезистентности и токсичности. Серебро является известным антимикробное вещество, и недавние события в нанонауки и нанотехнологии привели к активные исследования в антимикробным эффекты металлических наночастиц^7,8. Недавние исследования сообщили, что небольшой размер и высокое отношение поверхности к объему наночастиц приводят к увеличению антибактериальную активность^9,10,11.

Наноматериалы, представленные здесь сочетают наночастиц серебра с повышенной противомикробными свойствами и углеродных нанотрубок с высоким соотношением сторон, тем самым увеличивая площадь поверхности на единицу объема. Сфабрикованные серебряных наночастиц-нанотрубок Углекомпозит экспонатов значительный антимикробные свойства и минимальная токсичность для человека и животных клеток. Синтетических процессов в предыдущих исследованиях используют опасные восстановителями как NaBH₄, формамид, диметилформамид и гидразина. Этот процесс является сложным, опасные и трудоемким. Синтетический процесс сообщили здесь использует этанол как восстанавливающего агента в значительно менее опасные.

Ингибирование зоны и минимальная бактерицидная концентрация (МБК) для Ag-MWCNTs были измерены; Live/мертвые и Трипановый синий анализов были использованы для оценки токсичности и антибактериальными свойствами. Минимальная концентрация тормозной (MIC) и анализов Митохондриальная токсичность (МТТ) не были выполнены из-за необычного цвета углеродных нанотрубок, которые бы помешали анализов. Наконец было определено минимальная концентрация для предотвращения роста Methylobacterium spp. не затрагивая mammalian клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Мунт окисления

1. Измерьте 30-50 мг Мунт в 50-мл флаконе. Постепенно добавить 8 мл H₂так₄: HNO решение₃ (90% начальной концентрации, vol/vol 3:1), Пипетка с 1 мл наконечники.
   Предупреждение: Этот препарат должны проводиться в химической зонта.
   1. Разрешить 30 мин для экзотермической реакции для завершения.
2. Sonicate решение на 60-80 ° C и 160 W за 1 ч до тех пор, пока Мунт оседает в нижней части флакона.
   ВНИМАНИЕ: Уровень воды в sonicator должны быть ниже, чем в верхней части флакона, таким образом, чтобы вода не будет вводиться в пробирку.
3. Передача решения в пластиковых пробирок.
   1. С микропипеткой добавьте 30 мл дистиллированной воды каплям Мунт-COOH решение.
      Предупреждение: Сильной экзотермической реакции происходит во время добавления дистиллированной воды. Добавьте дистиллированную воду медленно и дать время для охлаждения.
4. Центрифуга Мунт-COOH решение в 12000 x g и комнатной температуре в течение 15 мин.
   Предупреждение: При эксплуатации центрифуги, убедитесь, что центрифуги остается сбалансированным, поставив трубку с такой же вес, напротив метро образцов.
5. Удалите супернатант с пипеткой и кончик Пипетка 1 мл. Добавьте 5 мл этанола с пипеткой и кончик Пипетка 1 мл. Промойте стены флакона этанолом дополнительные накапаны. Центрифуга для решения в 12000 x g и комнатной температуре в течение 15 мин.
   1. Определите pH супернатант рН бумагой. Повторите мойки и центрифугирования до тех пор, пока супернатанта рН нейтральным.
6. Удалите все супернатант. Добавьте 1 мл дистиллированной воды, чтобы осадить и разгонять Мунт-COOH равномерно в растворе. Freeze-Dry решения-60 ° c в вакууме до полного высыхания.

2. Серебряные наночастицы осаждения на MWCNTs

1. 10 мг Мунт-COOH в 50-мл Конические трубки и разбавить 30 мл дистиллированной воды. Sonicate раствор при 60 ° C и 160 Вт на 1 ч.
2. 6 мл 0,1 N AgNO₃ в 50-мл Конические трубки и разбавляют 18 мл дистиллированной воды. Sonicate раствор при 60 ° C и 160 Вт на 1 ч.
   Предупреждение: Добавьте₃ AgNO пропорционально общей массы MWCNTs таким образом, чтобы общая масса Ag не превышает 20%.
3. Добавьте решение₃ AgNO каплям MWCNTs решение с пипеткой и кончик Пипетка 1 мл при sonicating смеси на 60 ° C и 160 W. продолжить sonicating за 1 ч после добавления AgNO₃.
4. Центрифуга для решения в 12000 x g и комнатной температуре в течение 15 мин и удалить супернатант. Центрифуга для решения и удалить супернатант еще два раза.
5. Добавить 1 мл дистиллированной воды в смеси Ag-MWCNTs и разгонять осадок равномерно в решении. Добавьте 5 мл этанола и позволяют реакции приступить при комнатной температуре в течение 1 ч.
6. Центрифуга для решения в 12000 x g и комнатной температуре в течение 15 мин и удалить супернатант.
7. Определите pH супернатант рН бумагой. Повторите мойки и центрифугирования до супернатанта рН нейтральным.
8. Добавить 1 мл дистиллированной воды в Ag-MWCNTs и равномерно расходятся в растворе. Freeze-Dry раствор-70 ° c в вакууме за 24 ч.

3. зона ингибирование тест

1. Mix 18.12 g агар R2A и 1 Л дистиллированной воды в колбу. Стерилизуйте смесь в автоклаве при температуре 121 ° C 15 мин.
2. Разрешить гель остыть при комнатной температуре. Место 10 мл геля в чашках Петри до затвердения подготовить сплошной среды.
3. Место 100 мкл бактерий на твердом носителе. Распространение бактерий на твердой питательной, с помощью спредера.
   Предупреждение: Данная процедура должна проводиться в химической Зонта, освещенный с лампой алкоголя.
4. Инкубируйте блюда при 30 ° C в течение 48 часов.
5. 3.12 g R2A отвара смешайте с 1 Л дистиллированной воды в колбу. Стерилизуйте смесь в автоклаве при температуре 121 ° C 15 мин.
6. Передача выросли колоний в жидкой среде с помощью цикла и иглы и инкубировать в инкубаторе на 180 об/мин и 30 ° C.
7. Запишите значение ОД (оптическая плотность) методом УФ-спектрофотометрии на 600 Нм на почасовой основе для измерения роста бактерий.
   Примечание: R2A агар используется в этот тест, а не стандартный агар Мюллер Хинтон, потому что R2A является предпочтительным агар для роста Methylobacterium spp.
8. Место 10 мл подготовленных R2A агар в чашке Петри подготовить агар снизу.
   1. 3.12 g R2A бульона и 8 g агар смешайте с 1 Л дистиллированной воды. Стерилизуйте смесь в автоклаве при температуре 121 ° C для 15 минут место 10 мл этого геля на нижней агар.
9. Загрузите 50 мкл раствора Ag-MWCNTs на диске стерильные бумаги с микропипеткой.
   1. Сухие и стерилизовать Ag-MWCNTs образца в вакуумной камере под УФ на 30 мин.
10. Место Ag-MWCNTs образца на агаре.
11. Инкубируйте плита агара при 30 ° C в течение 48 часов.
12. Мера зона ингибирование¹².
    Примечание: Инструкции для используемого программного обеспечения включены в ссылки.

4. антибактериальная тест

1. Повторите шаги 3.1 до 3,7 подготовить бактериальной культуры.
2. На максимальной ОД прививать 100 мкл бактерий в 3 мл свежие жидкие среды с микро дозаторов кончиком пипетки и 100 мкл.
3. Подготовка пяти 50 мкл образцы решения управления в 15 мл конические трубы. Добавьте следующее к каждой трубы: 1) метанола; 2) 1000 мкг/мл Мунт COOH; 3) Ag 50 мкг/мл MWCNTs; 4) Ag 40 мкг/мл MWMWCNTs; 5) Ag 30 мкг/мл MWCNTs.
4. Инкубируйте на 180 об/мин и 30 ° C до тех пор, пока элемент управления является максимально активным, как определено методом УФ-спектрофотометрии, как описано выше.
5. Измерить ОД значение каждого образца и рассчитать концентрацию MIC. OD значение непосредственно связано с количество бактериальных клеток в образце бульон.
6. Распространения культивируемых бактерий на твердом носителе с распространитель.
7. Инкубируйте блюдо на 30 ° C в течение 48 часов.
8. Граф бактериальных колоний и значения CFU мера для определения антибактериальной активности¹².
   Примечание: Инструкции для используемого программного обеспечения включены в ссылки.

5. жизнеспособность Assay

1. После удаления культуры клеток из инкубатора, всасывания среднего и мыть три раза с прикапывают мыть 5 мл ФСБ.
2. Добавьте 1 mL трипсина-ЭДТА в PBS промывают клеток и всасывания через 1 мин.
   1. Нажмите пластину для удаления застрявшего клеток.
3. Добавьте 5 мл DMEM (средний Дульбекко изменение орел) и затем удалить ячейки. Центрифугуйте образцы на 200 g x 3 мин и удалить супернатант.
   1. Добавьте 1 mL DPBS и перемешать.
   2. Подсчитать ячейки в 10 мкл раствора с автоматической системы подсчета клеток.
      Примечание: Инструкции для подсчета клеток машины включены в ссылки на¹³.
4. Место 1 × 10⁵ AML12 клеток на хорошо в шести ну плите содержащая DMEM решение. Средство содержит плода бычьим сывороточным 10% (v/v) и 1% стерильных антибиотиков.
5. Инкубируйте пластина для 8-12 ч при 37 ° C в среде воздуха /95% 5% CO₂.
6. Всасывания супернатант из скважин с аспиратором.
   1. Добавьте каждый образец состоит из контроля, NMS-ДМСО (диметилсульфоксид) и 30-40 мкг/мл Ag-Мунт по 1 мл DMEM.
   2. Инкубируйте при 37 ° C в среде воздуха /95% 5% CO₂на 8 ч.
7. Удалите супернатант и стирать образцы с 5 мл ФСБ.
8. Добавьте 1 mL комплекта готовы жить/мертвых (20 мкл 2 мм EthD-1 с 5 мкл Флуорексон AM 4 мм в ДМСО в 10 мл PBS) каплям к ячейке.
9. Инкубируйте на технические для 30-45 мин или 37 ° C на 10 мин измерения флуоресценции со стандартным флуоресцентной микроскопии на 100 X или 300 X.

6. Трипановый синий Assay

1. Подготовка проб согласно шаги 5.1 через 5.6.2 выше.
2. Удалите супернатант.
3. Вымойте тарелка с 1 мл раствора 1 x DPBS и сцеживаться.
4. Добавьте 1 mL трипсина пластины и Инкубируйте 3 мин для отсоединения клетки от культуры. Использование ячейки культуры среднего мыть тарелку и собрать клетки. Место сбора клеток в 15 мл.
5. Центрифуга трубки в 200 x g и 4 ° C на 3 мин.
6. Выбросите супернатант. Добавьте 1 mL свежих средних клеток Пелле и повторно дисперсных клетки.
7. 10 мкл Трипановый синий с 10 мкл рассеянных клеток и подсчитать количество ячеек с автоматической системы подсчета клеток.
   Примечание: Инструкции для подсчета клеток машины включены в ссылки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Передача электронной микроскопии (ТЕА) изображения подтверждают формирование Ag-MWCNTs (рис. 1A и 1B). Их успешный синтез был подтвержден изменения поверхности заряда. Был рассчитан размер частиц Ag, хранение на MWCNTs (рис. 1 c). Средний ра...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы приводим простой метод для подготовки MWCNTs с хранение Ag наночастиц. Это Наноматериал Серебросодержащие демонстрирует значительный антимикробной активностью и минимальный потенциал для неконтролируемое поглощение наночастиц серебра в организме. Мы демонстрируем, что синтез?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 N silver nitrate	SIGMA-ALDRICH	1090811000
Carbon nanotube, multi-walled	Tokyo Chemical Industry Co., LTD	308068-56-6
R2A agar	MBcell	MB-R1129
R2A broth	MBcell	MB-R2230
Methylobacterium spp.	KCTC	12618	from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
LIVE/DEAD Cell imaging Kit	ThermoFisher SCIENTIFIC	R37601
AML12			from Chungnam University, Dajeon, Korea
human PBMC	ATCC	PCS-800-011
TEM	JEOL	JEM-2100F
XRD	Rigaku	D/MAX 2500	Cu K photon source (40kV, 100mA)
JuLI Br	NanoEnTek	JULI-BRSC