JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Пошаговое руководство для проверки потери лизосомальных кислотности в кишечнике C. elegans с помощью РН чувствительных жизненно красителя 5 (6) - карбоксильную - 2', диацетата 7'-dichlorofluorescein (cDCFDA)

Аннотация

Нематоды Caenorhabditis elegans (C. elegans) является модель системы, которая широко используется для изучения долголетия и пути развития. Такие исследования способствуют прозрачности животного, возможность прямого и обратного генетических анализов, относительная простота генерации дневно обозначенные протеины и использование флуоресцентных красителей, которые могут быть либо microinjected в начале эмбриона или включены в питание (штаммE. coli ОР50) для обозначения клеточных органелл (например 9-диэтиламино-5 H-бензо (а) феноксазин-5-1 и (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-пиррол-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Здесь мы представляем использование Люминесцентную краску pH фактора, что пятна кишечных лизосомы, обеспечивая визуального Индикация динамического, физиологические изменения в лизосомальных кислотности в живые черви. Этот протокол не измерить лизосомальных рН, а скорее стремится создать надежный метод оценки физиологической релевантные варианты в лизосомальных кислотности. cDCFDA является ячейка permeant соединение, которое преобразуется в люминесцентных Флюорофор 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) после гидролиза внутриклеточных эстераз. Протонирование внутри лизосомы ловушки cDCF в эти органеллы, где он накапливается. Из-за его низкой pKa 4.8 Эта краска используется в качестве датчика рН в дрожжей. Здесь мы описываем использования cDCFDA в качестве пищевой добавки для оценки кислотность кишечного лизосом в C. elegans. Эта техника позволяет для обнаружения alkalinizing лизосом в живых животных, и имеет широкий спектр экспериментальных приложений, включая исследования по вопросам старения, autophagy и лизосомальных биогенеза.

Введение

Появление белка агрегатов широко принято быть отличительной чертой старения в эукариотической клетки1,2,3и формирование которого считается среди водителей принцип сотовой старение4 , 5 , 6 , 7. имеется все больше свидетельств того, что как клетки возраст, катаболизм белков нарушается, привело к увеличению в агрегации белков. Крах протеолиза в процессе старения клеток предполагает ухудшение autophagy8 , а также деградации белка протеасом опосредованной9. Наконец необратимым белка окисления увеличивается в старых клеток, дальнейшего ущерба катаболизма белков10.

Подуманы, что autophagy был первоначально неизбирательной процесс для сыпучих деградации белков, поврежденных, но недавние исследования показали, что autophagy высокоселективных для катаболизма белка агрегатов и неблагополучных органеллы, которые не являются поддаются деградации через механизмы других белков в Распродажа11. Во время процесса autophagy поврежденные и агрегированных белки изолированы в двойной мембраной пузырьков, под названием autophagosome. Этот autophagosome затем предохранители с кислой органеллы, называется лизосомы, что приводит к деградации autophagosome груза12. Лизосомы представляют конечной autophagic пути и участвуют в различных клеточных процессах, таких как ремонт мембраны, транскрипционный анализ контроля и питательных зондирования; подчеркивая их централизованной роли клеточного гомеостаза (обзор в ref. 13). Несколько исследований показали связь между возрастом зависимых снижением лизосомальных функции и различных нейродегенеративных расстройств13. Последовательно восстановление лизосомальных функции в старые клетки могут отсрочить наступление связанных со старением фенотипов14,15. Исследования состава intralumen окружение предлагают, что крах лизосомальных функции в старые клетки не из-за сокращения производства лизосомальных протеаз16. Кроме того было предложено, что потеря intralysosomal кислотность, критическим требованием о ее Ферментативная активность, могут лежать в основе падение Лизосома опосредованной протеолиза17. Чтобы иметь возможность изучить эту гипотезу, важно развивать реагентов и протоколы зонда динамических изменений в лизосомальных рН в живых клетках воспроизводимых и последовательным образом.

Кишечник C. elegans основных метаболических ткани в глистах и это регулятором важнейших системных гомеостаза и продолжительность жизни. Мы разработали анализов для оценки изменений в кислотности в просвет кишечника лизосомы червей, чтобы определить, как Лизосома опосредованной протеолиза способствует старению. Хотя рН чувствительных флуорофоров ранее использовались в C. elegans в ознаменование кишечных лизосомы, там еще не был попытке создать успешный протокол, который может обнаружить небольшое увеличение в лизосомальных рН в vivo18. Здесь мы предоставляем протокол, который может использоваться для определения потери лизосомальных кислотности в клетках кишечные нематоды Caenorhabditis elegans с помощью простой и удобный кормления протокол, который включает в себя рН чувствительных Флюорофор (cDCFDA) в ОР50 пищу.

протокол

1. пятно и изображения кишечных лизосомы

  1. Семя нематоды роста СМИ (НГМ) плиты с ОР50
    1. Подготовить NGM плит согласно рекомендуемый протокол19 и позволяют закрытых пластины сохнуть в течение 2 дней при комнатной температуре.
    2. Прививать ОР50 бактерий в стерильных бульоне Лурия (LB) отвар и расти в тряску инкубатора или водой ванну при 37 ° C для 36 h или пока ОД между 0,2 и 0,4. Избегайте использования бактериальной культуры с OD > 1 или ОД < 0,2.
    3. После NGM плит сухой, посевным материалом ОР50 на центре пластины место падение (~ 30 мкл) и затем распространилась падение в патч, примерно, 2 x 2 см в размер.
      Примечание: Любые оставшиеся посевным материалом ОР50 можно хранить при 4 ° C до одного месяца.
    4. Инвертировать ОР50 пластины, когда посевные высохнет (примерно 10-15 мин) и затем инкубировать пластины при 37 ° C за 36 ч.
    5. После 36 h удалите пластины из инкубатора и хранить при 4 ° C до последующего использования.
      Примечание: Плиты должно быть хорошо для до 1 месяца на 4 ° C.
  2. Дополнение cDCFDA к ОР50
    1. В дополнение к cDCFDA на ОР50 плиты, подготовьте рабочий запас cDCFDA 10 мм в диметилсульфоксида (ДМСО). Держите решение cDCFDA, защищенном от света и хранить при-20 ° C для последующего использования.
    2. Осторожно поместите 100 мкл 10 мм cDCFDA раствора на поверхность ОР50 патч 2 см x 2 см, таким образом, что весь патч равномерно покрыта cDCFDA.
      Примечание: Это очень важно, что вся патч ОР50 покрыта cDCFDA. При необходимости, используйте до 150 мкл cDCFDA для каждой пластины. Важно также, что cDCFDA решение не распространяется за пределы ОР50 патч, так как любой cDCFDA, которая течет из ОР50 патч не будут включаться в пищу и приведет к сокращению интенсивности окрашивания.
    3. Поместите пластины для ОР50 в темной коробке на вершине скамейке, до тех пор, пока все cDCFDA раствора поглощается в бактериальных патч (обычно около 25-30 мин).
  3. Пятнать червей с помощью cDCFDA
    1. Как только cDCFDA полностью пронизана ОР50 патч, разместить не более чем 20 червей на пластину и инкубировать пластины, перевернутая при 20 ° C для минимум 14 h.
      Примечание: Рекомендуется размещать cDCFDA пластины в непрозрачные коробки для сведения к минимуму воздействия на свет.
    2. Чтобы контролировать потребление различия между эксперименты и нормализовать cDCFDA сигналов, (рекомендуется) совместно пятно с 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ( Бора difluoro) (2.5 мкл раствора свежеприготовленные 1 мм), краситель слабых Амин acidotropic, чьи флуоресценции является во многом не вариант над кислой рН спектра (см. Таблицу материалы для общих имен реагентов).
      Примечание: Не испачкать червей за менее чем 14 h, поскольку это может обеспечить неадекватной cDCFDA окрашивание интенсивности и дать ложное толкование лизосомальных рН.
  4. Подготовка слайдов для микроскопии
    1. Место два параллельных полос маркировки лентой около 3 дюйма друг от друга на гладкой плоской поверхности, такие как зеркало (рис. 1).
    2. Слой на поверхности зеркала с водоотталкивающими спрей и вытирать излишки жидкости.
    3. Растопить 2% агарозном (растворяют в дистиллированной H2O) в микроволновую печь до тех пор, пока полностью сжиженные, затем поместить 50 мкл капля агарозы между двумя полосами ленты и быстро охватить падение с микроскопа, таким образом, что слайд перпендикулярно полоски ленты. После затвердевшим агарозы, образуя круговой площадки под слайдом, переверните слайд и 10-15 мкл азид натрия 5 мм (3NaN) на площадку агарозы.
      Примечание: НАН3 является ингибитором цитохрома C, когда используется в низких концентрациях, обратимо anesthetizes червей, так что они не будут двигаться во время визуализации.
    4. Выберите червей из ОР50 плиты с cDCFDA и передавать их на чистую тарелку NGM без каких-либо ОР50. Разрешить червей двигаться на несколько секунд, чтобы позволить большую часть ОР50 чтобы быть удалены с поверхности червей, а затем перенесите червей на площадку агарозы, содержащие азид натрия 5 мм.
    5. Сразу же покрытия агарозы pad с крышки выскальзования. Не забудьте осторожно поместите крышку выскальзования без применения слишком большое давление, так как это может привести к разрывным червей.
      Примечание: ОР50 бактерий, дополняется cDCFDA флюоресцируют когда визуализация по микроскопии, поэтому важно очистить червей как лучший максимально прежде чем поместить их на панель агарозы, содержащие азид натрия. Если готовит более чем 6 штаммов C. elegans (включая N2, дикого типа управления), желательно подготовить образцы в партии 6, с тем чтобы обеспечить, что черви не высыхает на площадку агарозы. В некоторых штаммов вульвы начинается к разрыву после продолжительных периодов времени из-за давления от скольжения обложки, поэтому важно планировать соответственно.
  5. Конфокальная микроскопия
    Примечание: Некоторые Микроскопы есть встроенная функция, которая автоматически увеличивает интенсивность флуоресценции для компенсации переменной уровни флюоресценции. Такие Микроскопы могут не работать хорошо для визуализации червей, окрашенных с cDCFDA, поскольку они по сути увеличит интенсивность флуоресценции образцов.
    1. Выполнение визуализации на стандартный конфокального микроскопа с помощью волны возбуждения/выбросов, равным 488/530 Нм для cDCFDA. Возьмите одной плоскости изображения (не Z-стеки) кишечника лизосом и использовать только лизосомы, которые находятся в центре внимания (интенсивность максимального сигнала) для количественной оценки интенсивности.
      Примечание: Возможно из-за различия в доступности краситель, лизосомы клеток кишечника непосредственно кзади глотки поддерживать cDCFDA окрашивание интенсивности независимо от генотипа или возраста, поэтому осторожность во избежание изображений лизосом в этих клетках.
    2. Изображения слайд, содержащий 2-дневных дикого типа N2 червей впервые. При этом параметры конфокальный изображений например мощности лазера, Пинхол и диафрагмы для обеспечения что cDCFDA, интенсивность окрашивания не перенасыщен.
      Примечание: После того, как эти параметры заданы, не изменяйте их на весь срок изображений на этот день.
    3. 1024 x 1024 пикселей изображения одной плоскости кишечник (3-4 изображений на червя) с использованием 60 X увеличением объектива.
      Примечание: CDCFDA спектр излучения в глистах даст один известный пик на 520 Нм, что совпало с его сообщил флуоресценции спектра20, обеспечивая конкретного сигнала считывания, которая отличается от кишечных аутофлюоресценция (рис. 3).
    4. Экспорт изображения raw конфокальный (теперь файлы) в TIFF-файлов для каждого канала.
    5. Далее, откройте ImageJ и нажмите на файл | Открыть для открытия файла изображения, чтобы быть количественно. Как только загружает изображение, используйте средство выделения овальной формы в ImageJ для выбора региона интерес (ROI).
    6. После этого, нажмите на анализ | Мера для количественного определения интенсивности флуоресценции для этого ROI. Выберите 4-5 различных в фокус лизосомы за изображение и рассчитать интенсивность средняя относительная флуоресценции каждого региона интерес (ROI).
    7. Для каждого изображения измеряют интенсивность флуоресценции фон в регионе кишечника между лизосом. Вычитание значения интенсивности флуоресценции фон из значений интенсивности лизосомальных флуоресценции.
    8. В общей сложности собирают около от 30 до 50 отдельных нормализованных значений интенсивности (6-10 животных) cDCFDA для каждого штамма тестируется. Эти значения можно используйте для печати коробку и нитевидные участок с помощью любого соответствующего статистического программного обеспечения.
      Примечание: Пятнать может значительно изменяться в зависимости от таких факторов, как температура, время инкубации и общего здоровья и возраста животных таким образом, чтобы сравнения интенсивности флуоресценции актуальны только в рамках процесса образцы в же окрашивание эксперимент. Поэтому важно для обработки элементов управления в каждом окрашивание эксперимент. Вычислить статистические различия (t-тесты) с помощью любого соответствующего статистического программного обеспечения.
    9. Изображения всех штаммов из же эксперимент (витражи в тот же день) в последовательности, стараясь не изменить любой из параметров визуализации.

Результаты

cDCFDA пятна лизосом в зависимости от рН и его низкой pKa и готовы поглощение в лизосомы делает его Идеальный рН датчик21. cDCFDA, окрашивание интенсивность пропорциональна лизосомальных рН (т.е. окрашивание увеличивается интенсивность как уменьшение рН)

Обсуждение

Разнообразные события на клеточном и молекулярном способствуют старения, под влиянием черты истории жизни и генетические факторы. Наши недавние исследования22 свидетельствует о том, что репродуктивный цикл играет важную роль в контроле фитнес Сома через регулирование ди?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить центр генетики Caenorhabditis штаммов, естественных наук и инженерных исследований Совета (СЕНТИ) и Канадский фонд инноваций (CFI) для финансирования. Мы хотели бы поблагодарить доктора Чена Lizhen (Департамент клетки систем и анатомии, UT здравоохранения Сан-Антонио) за предоставление неограниченного использования средств ее лаборатории для всех C. elegans экспериментов, а также Ванг Exing (заместитель директора, оптических изображений объекта UT здравоохранения Сан-Антонио) для помощи конфокальной микроскопии. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Майрона Игнатий за оказание поддержки и поощрение для облегчения снимать видео.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
OP50 (E. coli)Caenorhabditis Genetics CenterOrder online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50
5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate ThermoFisherC369Commonly known as cDCFDA
9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boronThermoFisherL7528Commonly known as Lysotracker Red
Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)
ImageJDownload for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LB Broth powderThermoFisher22700041
Bacto AgarSigmaA5306-1KG
NaClSigmaS9888
Bacto PeptoneFisher ScientificS71604
Cholesterol powderSigmaC3045 
CaCl2Sigma449709
MgSO4SigmaM7506
K3PO4SigmaP5629
Sodium AzideSigmaS2002
DMSOSigmaD8418
Microscope SlidesVWR48311-703
Cover SlipsThermoFisher3406
AgaroseSigmaA6013
Incubator
Mirror or other smooth flat surface

Ссылки

  1. Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
  2. Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
  3. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  4. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
  5. Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
  6. Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
  7. Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?. Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
  8. Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
  9. Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
  10. Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
  11. Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
  12. Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
  13. Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
  14. Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
  15. Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
  16. Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age?. Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
  17. Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
  18. Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  20. Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
  21. Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
  22. Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).
  23. Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
  24. Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
  25. Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
  26. Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
  27. Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
  28. Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
  29. Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
  30. Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
  31. Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134C elegansvcDCFDA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены