JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Toeprinting целями для измерения способности в vitro транскрипции РНК формы перевода инициации комплексов с рибосомами при различных условиях. Этот протокол описывает метод для млекопитающих РНК toeprinting и могут быть использованы для изучения Кап зависимых и управляемая IRES перевод.

Аннотация

Начало перевода является шагом ограничения скорости синтеза белка и представляет собой ключевой точку, в которой клетки регулируют их производства белка. Регуляции синтеза белка является ключом к сотовой стресс реакция, и регуляции является центральным элементом многих государств болезни, как рак. Например хотя сотовой стресс приводит к ингибированию глобальной перевод смягчающих Кап зависимых инициирования, некоторые белки стресс реакция выборочно переводятся в Кап независимым образом. Сдержанный РНК нормативных элементов, таких как сотовой внутренних рибосома запись сайтов (IRESes), позволяют для перевода этих конкретных мРНК. Идентификация такими мРНК и характеристика механизмов их регулирования, были одной из ключевых областей в молекулярной биологии. Toeprinting — это метод для изучения структуры РНК и функции, как она относится к инициации перевода. Цель toeprinting – оценить способность в vitro транскрипции РНК сформировать стабильные комплексы с рибосомами под целый ряд условий, с тем чтобы определить, какие последовательности, структурные элементы или аксессуар факторы участвуют в рибосомы Привязка — предварительно курсор для инициирования эффективного перевода. Наряду с других методов, таких как Западная анализа и Полисома профилирования toeprinting позволяет для надежной характеристика механизмов для регулирования возбуждения перевода.

Введение

Как перевод потребляет наиболее клеточной энергии, это имеет смысл, что перевод является жестко регулируемых1. И наоборот, регуляции перевода- и последующего изменения объема белка-часто наблюдается в реакции на стресс и болезни государствах, таких как рак1,2. Основным преимуществом трансляционная управления является скорость, с которой клетки могут изменить их вывода белка для того, чтобы реагировать на различные раздражители3. Таким образом, перевод правил представляет собой важный механизм, который может повлиять на выживание клетки и смерти1,2,3. Шагов, перевода начало является наиболее высоко регулируемые и сложных3. Короче говоря наиболее эукариотические мРНК содержат 5' м7G колпачок, который почти всегда необходима для их перевода. Кап зависимых посвящения требует эукариотических инициации факторов eIF4E, eIF4A и eIF4G (Кап признание комплекс) взаимодействовать с 5' конца мРНК. 43S preinitiation рибосомы комплекс, который содержит eIF2-прыгните инициатор тРНК и eIF3, привлекается к 5' концу мРНК через взаимодействие eIF4G с eIF3. Считается, что preinitiation комплекс сканирования мРНК, опираясь на eIF4A (РНК-helicase) до начала кодон (Авг) расположен. 48S инициации комплекс впоследствии формируется и тРНК доставляется в P-сайт рибосомы. Наконец субблоки рибосома 60 и 40 объединились в начала 80-х годов комплекс, следуют перевод удлинение1,3,4. В отличие от внутренних рибосома запись сайтов (IRESes) обойти требование для 5' Кап, привлекая рибосомных субблока 40 лет непосредственно до начала кодон3. Физиологический стресс условиями ослабление глобальной мРНК перевод из-за изменения ключевых общих эукариотических инициации факторов (eIFs). Однако механизмы инициации неканонических перевод позволяют выборочный перевод некоторых мРНК, которые часто кодируют белки стресс реакция, и dysregulation неканонических перевод посвящения замешан в государствах заболевания как рак 1 , 2. сдержанный РНК нормативных элементов, таких как сотовые IRESes, позволяют для перевода таких mRNAs2,3.

Особенно интересным аспектом трансляционная управления — понять механизмы канонической против не канонический перевод заданный мРНК. Toeprinting — это метод, который позволяет детальное изучение механистический начало перевода конкретных РНК в пробирке. Общая цель toeprinting заключается в том, чтобы оценить способность РНК, представляющих интерес для nucleate формирования перевод посвящения, комплекс с рибосома под целый ряд условий, с тем чтобы определить, какие последовательности, структурные элементы или аксессуар факторы, необходимые для начала эффективного перевода. К примеру рибосома набора может быть препятствуют в отсутствие крышкой 5' но стимулируется наличием IRES.

Принцип метода заключается в пробирке транскрибировать РНК интерес, проинкубируйте его присутствии клеточных экстрактов, содержащих перевод компонентов (или очищенный) чтобы транскрибировать инициации комплексы форме и обратить вспять РНК с конкретным грунт. Стабильные комплексы РНК рибосома приведет к обратной транскрипции зависает на краю 3' рибосомы так называемые «toeprint»5,6,7.

В этот протокол, рибосомных субблоков, eIFs, tRNAs и IRES транс-Исполняющий обязанности (ITAFs) удобно факторов, кролик ретикулоцитов lysate (РРЛ). Еще одно преимущество этого протокола является использование дневно меченых грунт и флуоресценции формирователя изображений на основе геля, а не radiolabeled грунтовка. Это устраняет дополнительные шаги, включая radiolabeling грунт, а также сушки геля и подвергая его активизация экран. Люминесцентных полосы регистрируются в режиме реального времени, как работает гель, позволяющий для большей резолюции. Раскрытый Х-хромосомой Ингибитор апоптоза РНК IRES белка (XIAP) используется в качестве примера здесь, хотя ограничен мРНК также могут быть проанализированы по этой технике8.

В отличие от западных анализ, который измеряет конечный результат процесса перевода в lysates клетки, toeprinting является подход в vitro для измерения перевода инициации комплекс формирования на РНК. Этот упрощенный подход позволяет весьма детальное изучение субстратов или факторов, которые регулируют перевод посвящения (например., ограничен или ООН ограничен мРНК, IRES структуру, наличие или отсутствие поли A хвост, предоставление конкретных белковых факторов, и т.д.). Таким образом toeprinting может использоваться для изучения различных видов перевод8 или эффекты мРНК структур, таких как IRESes, синтез белков9,10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: РНК очень восприимчивы к деградации рибонуклеаз (полиадениновый). Принимайте стандартные меры предосторожности, чтобы сохранить нетронутыми РНК. Часто менять перчатки. Использование фильтрации наконечники, свободной от нуклеиназы пластик и свободной от нуклеиназы химических веществ на всех этапах протокола. Использование свободной от нуклеиназы или диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной воды для всех решений.

1. Подготовка решений

  1. Подготовка Toeprinting буфера: 20 мм трис-HCl (рН 7,6), 100 KOAc, 2,5 мм Mg(OAc)2, 5% (w/v) сахарозы, Дитиотреитол (DTT) и 0,5 мм спермидина 2 мм.
    1. Хранить DTT и спермидина в одноразовых аликвоты при-20 ° C, чтобы избежать повторного замораживания оттаивания циклов.
      Примечание: DTT и спермидина следует добавить в буфер toeprinting непосредственно перед использованием. Не хватает DTT и спермидина решение может храниться при температуре-20 ° C.
  2. Подготовьте аликвоты 85 мм 5'-что imidodiphosphate (GMP-PNP) и 91 мм аденозинтрифосфатом (АТФ). Хранить аликвоты при-20 ° C.
  3. Подготовить 450 мл 6% полиакриламида - 7M мочевины гель смеси: 67.5 мл 40% acrylamide:bis-акриламида (19:1), 189 г мочевины, 112.5 5 x TBE (Tris/Борат/thylenediaminetetraacetic кислоты (ЭДТА)) до 120 мл воды. Растворите мочевину потепления в ванну воды 37 ° C или на горячей плите с перемешиванием. Фильтр решение (например., 0,2 мкм нитроцеллюлоза вакуум-фильтр).
    Примечание: Раствор может храниться при температуре 4 ° C для по крайней мере один месяц.
    Предупреждение: Мономерных акриламида является нейротоксин, который могут проникать через кожу. Проявлять большую осторожность, чтобы избежать контакта с кожей (т.е., надевайте перчатки, лабораторный халат и защитные очки). Полиакриламида также должны быть обработаны с осторожностью, как полимеризации может не перейти к 100% завершения.
  4. Подготовить формамид загрузки краска: 95% формамида, 18 мм ЭДТА, 0,025% (w/v) лаурилсульфат натрия (SDS), 0,025% (w/v) бромфеноловый синий, cyanol ксилол 0,025% (w/v). Хранить при температуре от-20 ° C.
  5. Растворите 1 нмоль праймера (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' конца меченых с IRDye 800) в 100 мкл воды для рабочей концентрации 10 пмоль/мкл. Хранить при-20 ° C в одноразовых аликвоты (приблизительно 10 мкл), защищенном от света месте.

2. Подготовка мРНК

  1. Усилить ДНК шаблоны для синтеза мРНК полимеразной цепной реакции (ПЦР) из соответствующих шаблонов (т.е., геномной ДНК или плазмида ДНК, в соответствующих случаях). Используйте высококачественный ДНК-полимеразы согласно инструкциям производителя, с соблюдением следующих условий реакции (35 циклов): расплава, 98 ° C, 10 s; отжиг, 53 ° C, 20 s; продлить, 72 ° C, 30 s.
    Примечание: Форвард грунт (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) включает в себя последовательность промоутер T7 для транскрипции РНК; Обратный грунт (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) включает в себя 51 тимин остатков предоставлять хвост поли A для транскрипции РНК. Обратите внимание, что РНК может быть также в vitro расшифрованный от плазмидной ДНК.
  2. Использование соответствующей транскрипции Кит в vitro транскрибировать IRES-содержащие РНК или ограничен РНК из шаблона ДНК. Следуйте инструкциям производителя. Подготовка образца РНК в стандартных 20 мкл реакции томов. Лечить недавно синтезированных РНК с 2 единицы DNase РНКазы бесплатно 30 минут при 37 ° C.
  3. Разбавить DNase лечение РНК до 110 мкл с нуклеиназы свободной воды добавить 110 мкл кислоты фенола, вихрь 5 s и центрифуги на 3 мин на 20000 x g при комнатной температуре. Удаление 100 мкл водной фазы к новой пробке отцентрифугировать 1,5 мл, 10 мкл ацетат натрия 3 M и вихрь 2 s. Добавить, 3 тома 100% этанола, вихрь 5 s и осадок РНК при-20 ° C на ночь.
  4. Центрифуга на > 20000 x г за 30 мин при 4 ° C и удалить супернатант. Помыть лепешка с 500 мкл ледяной 70% (v/v) этанола и повторите центрифугирования. Аспирационная столько супернатанта как возможно и воздушно-сухой Пелле за 5-10 мин будьте осторожны, чтобы не вытеснить гранулы.
  5. Ресуспензируйте РНК в соответствующий объем свободной от нуклеиназы воды приносить рабочей концентрации 0,5 мкг/мкл. Это могут храниться при температуре-80 ° C или используется немедленно.

3. Toeprinting реакция

  1. Смесь 15 мкл кролик Lysate ретикулоцитов (РРЛ, не лечить нуклеиназы), 1 мкл (40 единиц) АБС битор РНКазы, 1 мкл 91 мм АТФ (1.82 окончательный мм) и 1 мкл 85 мм, GMP-PNP (окончательный 1.7 мм) в 1,5 мл отцентрифугировать. Инкубируйте на 30 ° C за 5 мин.
    Примечание: РРЛ должна быть aliquoted для одноместного размещения избежать повторяющихся замораживания оттаивания. Критический элемент управления является реакцией хватает РРЛ, с целью выяснения природные паузы обратной транскрипции благодаря вторичной структуры РНК. Добавьте toeprinting буфер для замены RRL для данного элемента управления.
  2. Добавить 0,5 мкг (1 мкл) РНК и Инкубируйте на 30 ° C за 5 мин.
  3. 22 мкл буфера Toeprinting и Инкубируйте на 30 ° C в течение 3 мин.
  4. Добавить 0,5 мкл (5 пмоль) IRDye меченых грунтовки и инкубировать на льду за 10 мин.
  5. 2 мкл дНТФ 25 мм (конечная концентрация: 1 мм), 2 мкл 100 мм Mg(OAc)2, 1 мкл из птичьего Myeloblastosis вирус обратной транскриптазы (AMV-RT) и 3,5 мкл буфера Toeprinting. Окончательный объем-50 мкл.
  6. Инкубируйте реакции при 30 ° C по 45 мин.
  7. Добавить 200 мкл нуклеиназы свободной воды и немедленно извлечь с 250 мкл 25:24:1 фенола: хлороформ: изоамилового спирта (рН около 8,0). Вихрь 5 s и центрифуги на 20000 x g 3 мин при комнатной температуре. Удалить водяной участок для новой трубки отцентрифугировать 1,5 мл, добавить 3 тома 100% этанола, вихрь 5 s и осадок при-20 ° C на ночь.
  8. Центрифуга на > 20000 x г за 30 мин при 4 ° C и удалить супернатант. Помойте лепешка ДНК с 500 мкл ледяной 70% (v/v) этанола. Центрифуга на > 20000 x g 15 мин при 4 ° C. Аспирационная столько супернатанта как можно и сухих гранул на 5-10 минут будьте осторожны, чтобы не вытеснить гранулы воздуха.
  9. Растворяют гранулы в 6 мкл нуклеиназы свободной воды и добавить 3 мкл формамид загрузки красителя.

4. последовательность реакций

  1. Используйте шаблон ДНК от 2.1 и IRDye меченых грунт из шага 3.4 для стандартной последовательности реакций, используя dideoxynucleotides (ddNTPs) как ограничители цепи. Используйте соответствующий комплект секвенирования ДНК и следуйте инструкциям производителя.
  2. Mix 6 мкл каждой последовательности реакции с 3 мкл формамид загрузки красителя.

5. Подготовка секвенирования гель и электрофорез

Примечание: Этот протокол использует флуоресценции Тепловизор на основе геля и 21 см x 23 см x 0.2 мм гель, но могут быть адаптированы для других секвенсоров или гель размеров, если требуется.

  1. Тщательно очистите распорки 0,2 мм, а также короткий (23 × 25 см) и долго (30 × 25 см) стекла с 100% этанола. Сухой воздух.
  2. Размешивать 30 мл 6% полиакриламида - 7M мочевины геля смешать с 200 мкл 10% (w/v) Аммония пероксодисульфат (APS) и 20 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED). Залейте гель, заботясь, чтобы избежать пузырей и вставьте гель «акула-гребень». Разрешить гель для полимеризации в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Соберите аппарат секвенирования и заполнения резервуаров с 1 x TBE.
  4. Предварительно баллотироваться 15 мин на 1500 V до достижения оптимальной температуры 55 ° С.
  5. Тепло образца/Загрузка краситель микс (от шагов 3.9 или 4.2) до 85 ° C за 5 мин нагрузки 1 мкл на гель последовательности.
  6. Побегите гель на 1500 V за 8 ч. Машина будет читать полосы в режиме реального времени.
  7. Разберите аппарат и распоряжаться гель акриламида и идущий буфер.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Ранее мы описали XIAP IRES способность поддерживать инициирование Кап независимые перевод в vitro8,10. Toeprinting был ключевым технику допросить механистический детали XIAP IRES посвящения комплекса. Конструкцию ДНК кодирования мРНК, содержащие X...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Toeprinting – это мощный метод непосредственно измерить РНК интерес способность поддерживать образование комплексов инициации перевода высоко контролируемых обстоятельствах. Этот протокол описывает упрощенную технику для toeprinting РНК у млекопитающих. Кролик ретикулоцитов lysate (РРЛ) исполь?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы имеют без конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Эта работа финансировалась естественных наук и инженерно-исследовательский совет Канады-Discovery Грант (RGPIN-2017-05463), Канадский фонд для инноваций-Джон р. Эванс лидеров фонда (35017), инновационную программу кампуса Альберта и в министерстве Альберты Экономического развития и торговли.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DEPC (Diethyl pyrocarbonate)SigmaD5758-100ML
TRIS base, UltrapureJT Baker4109-01
KOAc (Potassium acetate)Bio BasicPB0438
Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)Bio BasicMB0326
Sucrose, molecular biology gradeCalbiochem573113-1KG
SpermidineSigma85558
GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solutionSigmaG0635
ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solutionSigmaA6559
19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%Bio BasicA0006
UreaBio BasicUB0148
500mL bottle top filtration units, 0.2 µmSarstedt83.1823.101
FormamideSigmaF9037-100ML
EDTA (disodium salt, dihydrate)Bio BasicEB0185
SDSBio BasicSB0485
Bromophenol blueBio BasicBDB0001
Xylene cyanol FFBio BasicXB0005
MEGAshortscript T7 transcription kitAmbionAM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kitAmbionAM1344
Acid Phenol:Chloroform (5:1)AmbionAM9722
25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl AlcoholInvitrogen15593-049
Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.Green Hectares, USAContact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)Thermo FisherE00382
100 mM dNTPsInvitrogen56172, 56173, 56174, 56175Mix equal parts for a stock of 25 mM each.
AMV-RT, 10 U/µLPromegaM5101
Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing KitThermo Fisher707701KT
Model 4200 IR2 DNA analyzerLI-CORProduct has been discontinued
APS (Ammonium Persulfate)Bio BasicAB0072
TEMEDBio BasicTB0508
Phusion High Fidelity PolymeraseNew England BiolabsM0530
Turbo DnaseThermo FisherAM2238

Ссылки

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
  3. Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121(2016).
  4. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
  5. Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
  6. Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
  7. Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15(2010).
  8. Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
  9. Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
  10. Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
  11. Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
  12. Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
  13. Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
  14. Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
  15. Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
  16. Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295(2014).
  17. Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).
  18. Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135ToeprintingIRES5eIFs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены