JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы предлагаем недорогой и надежный метод для создания electroporated мозга organotypic срез культур из эмбрионов мыши подходит для confocal микроскопии и жить изображений техники.

Аннотация

ГАМК интернейронов (INs) являются важнейшими компонентами нейрональных сетей, которые управляют познания и поведения. Модули, предназначенные для заполнения коры мигрируют касательной от их места происхождения в вентральной конечного мозга (в том числе от медиальной и хвостовой Ганглиозный Высокопреосвященства (MGE, КГЭ)) спинной пластины корковых в ответ на разнообразные внутренние и внешние подсказки. Были разработаны различные методологии годами генетически манипулировать конкретные пути и исследовать, как они регулируют динамических цитоскелета изменения, необходимые для правильного в миграции. В утробе матери электропорации широко применяется для изучения эффекта генов репрессий или гиперэкспрессия в конкретных в подтипы оценивая влияние на морфологию и окончательную позицию. Однако, хотя этот подход легко используется для изменения радиально мигрирующих пирамидных клеток, это более технически сложно при ориентации соц.страх в утробе матери электропорации генерирует низкой урожайностью, учитывая снижение выживаемости потомства при Электропорация проводится перед e14.5, как это принято при изучении МГЕ производные INs. В альтернативный подход МГЕ эксплантов обеспечивают легкий доступ к МГЕ и облегчить изображений генетически модифицированных модулей. Однако в этих эксплантов INs мигрируют в искусственных матрицы, лишенный эндогенного указания подсказки и таламуса входов. Это побудило нас, чтобы оптимизировать метод, где модули можно перенести в более натуралистических окружающей среды, в обход технических проблем в утробе матери подходов. В настоящем документе мы описываем сочетание бывших utero электропорации мозги эмбриона мыши следуют organotypic срез культур легко отслеживать, изображения и реконструировать генетически модифицированных модулей мигрируют вдоль их естественные пути в ответ на эндогенные подсказки. Этот подход позволяет для количественной оценки динамических аспектов миграции с покадровой конфокальная томография, а также подробный анализ различных морфологических параметров, с помощью нейронов реконструкций на фиксированной полученных ткани.

Введение

Корковых интернейронов ГАМК (INs) разнообразны в отношении их биохимических свойств, физиологические свойства и связи, и они посредником различные функции в зрелых сетей1,2,3 ,4,5. Спецификация различные подтипы корковых INs жестко регулируется через генетических каскадов, которые были широко изучены1,2. Большинство (70%) корковых ГАМК INs происходят из прародителей в медиальной Ганглиозный возвышение (MGE), вентрально расположен эмбриональной структурой и необходимо перенести на относительно большие расстояния до корковых пластина1, 2 , 6. Хотя кортикального слоя пирамидальных клеток мигрировать радиально от желудочков зоны (VZ) коры пластины вдоль радиальной глии эшафот, тангенциальная миграции модулей, которые не присоединены к такой леску, требует целого ряда внутренних и внешние сигналы для привлечения мигрирующих нейронов к пластину кортикального слоя, при этом направляя их от не корковых структур2,,78. После выхода клеточного цикла, модули отталкиваются от MGE от химио отвратительный подсказки, выраженных в VZ MGE, который вызывает тангенциальная миграции к корковых плита9,10. Перенос INs избежать стриатума с помощью различных отталкивающим подсказки11 и, после достижения корковых пластины, они с тангенциальным переключиться в режим радиальная миграция и добраться до их окончательного ламинарные позиции, частично в ответ на сигналы от пирамидальной клетки12 и других клеточных популяций13. Миграция модули, что касается других нейрональных популяций, включает в себя различные динамические морфологических изменений разрешить фактическое движение нейрона. Этот так называемый нейронов локомоции характеризуется повторяющихся циклов трех последовательных этапов: удлинение ведущих процесс, активно антероградная движения ядра (nucleokinesis) и Ретракция конечные процесса14. В миграции регулируется многочисленные внутренние и внешние сигналы, которые управляют ветвления и активного ремоделирования ведущих процесса для руководства INs в правильном направлении, определение ориентации и скорость миграции14,15 ,16.

В последние годы1,2,7,,1718,19,20, широко изучены факторы, регулирующие корковых в миграции и нарушения в некоторых из этих молекулярных субъектов было постулировано приведет к нервной расстройств, например педиатрических огнеупорных эпилепсии или аутизм спектра расстройства1,2,21, 22 , 23 , 24. Таким образом, чтобы существенно продвинуть вперед нашу способность изучать этот динамичный процесс, как ранее рассмотренных25проводилась разработки различных подходов in vitro и in vivo . В vitro методы, включая Бойден Пробирной палаты и полоса выбор Assay, обеспечивают быстрый и наиболее воспроизводимого средства оценки требования и клеток автономная воздействия конкретных генов и белков во время миграции нейронов, без влияния других факторов25. Эти анализы являются особенно полезными, когда в сочетании с живой изображений8,,2627. С помощью этих методов модули легко извлекаются из e13.5 МГЕ и изолированные ферментативные и механических диссоциации, после чего можно исследовать различные сигнальные пути и указания подсказки, как показано ранее8,28 . Однако эти анализы проходят в искусственных внеклеточного матрикса в отсутствие трехмерные ткани архитектуры, которые могут изменить нейрональных поведение и ячейки свойства, потенциально влияющие ячейки миграции и/или выживание25. Чтобы обойти эти ограничения, ex vivo МГЕ эксплантов были разработаны как альтернативную инструмент для количественной оценки динамических морфологические изменения, происходящие во время миграции, а также такие параметры, как скорость и ориентации в14, 29. Создание МГЕ эксплантов является относительно простым и была широко описано в других разделах30. Это предполагает покрытие небольшой экстракт МГЕ на монослое смешанных корковых клеток или в смеси matrigel и коллагена в присутствии привлекательным или отталкивающего подсказки25, хотя последние являются Факультативным31. МГЕ эксплантов позволяют высоким разрешением изображений малонаселенных помеченных клеток, упрощение исследования внутриклеточных процессов, таких как цитоскелета реконструкции в процессе ведущих ветвления, как показано ранее32,33 ,34 и в настоящем исследовании. МГЕ эксплантов успешно использовались для оценки динамических цитоскелета изменения во время миграции в 2D среде, например после конкретных фармакологических или эозинофилов манипуляций (см., например, Тиленс et al. 201633) . Однако с этим подходом, INs мигрируют в пределах искусственного матрицы, и это может привести к изменению в поведении и воспроизводимость и значимость экспериментальные результаты.

Напротив в утробе матери электропорации позволяет генетические манипуляции INs в их родной среде и широко используемый метод, чтобы быстро и эффективно оценить влияние выгоды и потери функции гена в обход ограничений дорогостоящей и трудоемкой Выбивное и стук в стратегии25,35. В утробе матери электропорации может быть смещенной в отношении в прародителей, используя ячейки типа конкретных промоутеров и позиционирование электрода к вентромедиального структур, в том числе МГЕ36. Кроме того в утробе матери электропорации позволяет своевременно выражение экспериментальных конструкций в течение 1-2 дней, по сравнению с 7-10 дней, необходимых для конструкции выражения с использованием вирусных векторов25. Однако в утробе матери электропорации из в прародителями клонит быть малой мощности. Действительно, хотя пирамидальной клетке прародителями, расположенных в зоне спинной желудочков может эффективно transfected в утробе матери электропорация, ориентации более вентрально расположен структур, таких как MGE, более технически сложных, особенно в небольших e13.5 эмбрионы и высокий уровень эмбриональных летальность далее уменьшает экспериментальная урожайность25.

Чтобы обойти некоторые технические ограничения, связанные с in vitro МГЕ explant экспериментов и в естественных условиях в утробе электропорация, ex vivo organotypic срез культур были развитыми8,37, 38,39. Мозг organotypic срез культур предложение условия преимущество передразнивать в естественных условиях , будучи менее дорогостоящим и длительным, чем формирование животных моделей25. Действительно эти препараты позволяют легко доступ к MGE, наряду с конкретными визуализации INs и могут быть объединены с фокуса электропорации расследовать конкретные молекулярные пути в Син, перенос в более физиологических окружающей среды8 , 39 , 40 , 41. Поэтому мы оптимизировали подход для organotypic культур38, который мы в сочетании с экс-utero электропорации и time-lapse конфокальная томография, для дальнейшей оценки происходящих морфологических и динамичный процесс во время тангенциального миграции МГЕ-модулей. Настоящий Протокол была адаптирована и оптимизирована от других, которые использовали для изучения миграции пирамидальных клеток42,43 бывших внутриутробно или в утробе матери мозга электропорации и organotypic срез культур и корковых INs36,,3944. В частности обезглавлен эмбрионов мыши и MGE является electroporated ex vivo после внутрижелудочкового введения экспериментальной плазмиды, позволяя более эффективной и точной ориентации МГЕ прародителей чем то, что может быть достигнуто с в утробе матери электропорации. Затем извлекаются мозги и секционного корональных ломтиками весь мозг, которые могут быть культивировали на несколько дней, таким образом позволяя непрерывное отслеживание и изображений из transfected INs. Этот подход обычно этикетки вскользь миграция модули 5-20 на срез мозга, свести к минимуму количество экспериментальных итераций, необходимых для достижения статистической значимости, при маркировке достаточно редкий нейронов населения для обеспечения легко разделение отдельных нейронов для реконструкции и тонкой морфологической оценки. Кроме того по сравнению с МГЕ эксплантов, organotypic культур убедитесь, что миграция модули подвергаются более естественной окружающей среды, включая локально выделяется chemokines и входы от таламуса афферентов. Таким образом, этот подход является хорошо подходит для количественного определения направленности и пути миграции, принятых transfected INs, предлагая достаточно анатомические детали, чтобы позволить характеристика тонкой динамических процессов, таких как ведущий процесс ветвления, nucleokinesis и завершающие процесс отзыва.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты с участием животных были одобрены Comité Institutionnel des Bonnes сходной avec les Animaux исследований (CIBPAR) в исследовательском центре Сент-Жюстин Чу и были проведены в соответствии с канадского Совета по животных уход Руководство Уход и использование экспериментальных животных (ред. 2).

Протокол, описанные здесь был оптимизирован для электропорации эмбрионов в эмбриональных день (e) 13.5, в то время, когда МГЕ производные INs активно создаются, до45,пик КГЭ-производные модули производства46. Кроме того для смещения электропорации к ГАМК INs, мы используем промоутер выборочно выражена в модули (например, промоутер Dlx5/6 с минимальными enhancer)47.

1. Приготовление растворов для электропорации и ломтик Organotypic культур

  1. Подготовка 125 мл стерильной питательной среды.
    1. Мера 125 мл регулярных нейрон конкретных питательной среды (см. Таблицу материалов для разработки) в стерилизованные бутылки в ранее УФ стерилизации биобезопасности кабинета распыляется с 70% этиловом спирте. Добавление 2,25 мл 50 x сыворотки свободный нейрон конкретные дополнения, 1,75 мл 200 мм глютамина (конечная концентрация 0,5 мм) и 6,25 мл сыворотки тепла инактивированная лошадь, ранее aliquoted в стерильных условиях. Перемешать, Алиготе 15 мл стерильного конические трубы и хранить при 4 ° C.
      Примечание: Подготовленные питательной среды может храниться до 3 недель при 4 ° C.
    2. Разделите 100 X Стоковый раствор Botteinstein в N-2 формулировка48 на 150 мкл аликвоты в стерильных условиях и заморозить при температуре-20 ° C до использования.
  2. Подготовка 1 Л стерильных искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО).
    1. Мера 800 мл дистиллированной воды в стакан емкостью 1 Л. Добавить 25.67 г сахарозы, 5.08 г хлорида натрия (NaCl), 2.18 г бикарбоната натрия (NaHCO3), 1,80 г глюкозы, 0,19 г хлористого калия (KCl), 0,15 г монокальций фосфат безводного натрия (NaH2PO4), 1 мл 1 М запасов CaCl2 .2H2O и 2 мл 1 м складе MgSO4.7H2O. движение, чтобы растворить при комнатной температуре. Долейте дестилированную воду до общим объемом 1 л.
    2. С помощью фильтра 0.22 мкм, фильтр решение в стерильных бутылку в стерилизованные биобезопасности кабинета и хранить при 4 ° C до 1 месяца.
  3. Готовить свежий раствор 4% агарозы в фаго перед каждой эксперимент.
    1. Мера 25 мл ранее подготовленных фаго в 50-мл стерильного Конические трубки и добавить 1 g легкоплавких точки агарозы.
    2. Тепла для 45 s в микроволновой печи. Чтобы избежать разлив, прерываний, Отопление каждые 3-4 s, когда начинает кипеть, открытая трубка, чтобы позволить давление вне, снова закройте его и вручную агитировать смешать агарозы. Повторяйте до тех пор, пока решение агарозы однородной. Держите агарозы решение при 42 ° C в течение оставшейся части эксперимента, чтобы избежать затвердевания.
      Примечание: Повышение температуры вызовет повреждение тканей мозга.

2. Подготовка плазмиды для инъекций

  1. Вытащить микроинъекции Пипетки стеклянные
    1. Установите микропипеткой съемник с соответствующими параметрами, безопасного стекла капилляров в предоставленный пространстве и убедитесь, что он центрируется с нити накаливания.
    2. Нажмите кнопку извлечения.
    3. Осторожно удалите недавно сделал микроинъекции пипетки от тепла съемник и место в поле или чистой Петри до дальнейшего использования, чтобы избежать повреждения кончик.
  2. Set-up биобезопасности, кабинет с всеми инструментами необходимо для этого эксперимента (см. Рисунок 1A), щедро спрей все инструменты в области биобезопасности кабинета с 70% этанола и стерилизовать инструменты и среды с УФ-излучения для 15-20 мин.
  3. Во время стерилизации шага оттепель плазмид на льду (4 ° C).
  4. Мера 10 мкл плазмиды от Стоковый раствор (4 мкг/мкл) в чистой 1,5 мл пластиковых пробирок. Добавьте 0,01% от быстро зеленый FCF. Осторожно перемешать, спина кратко и держать на льду до использования.
    Примечание: Макси prep ДНК должны быть подготовлены согласно протоколу производителя с помощью комплекта эндотоксинов свободный макси prep. ДНК может быть солюбилизирован в буфере TE или свободной от нуклеиназы H2O и подготовка плазмида с краситель решение может, но не не нужно выполнять в стерильных условиях. Плазмиды от макси подготовка должна быть aliquoted, чтобы избежать нескольких циклов замораживания оттаивания. Aliquoted плазмид должна быть смешанной с красителем не более что 2 ч перед использованием и не должно быть размораживают для дальнейшего использования.
  5. После стерилизации готовят нано инжектор следующим образом.
    1. Выберите один из ранее подготовленных стекла микроинъекции пипетки, хранящиеся в чистое поле или Петри и использования небольших пинцет сократить кончиком пипетки в скошенный способом добиться наружным диаметром примерно 15 мкм.
      Примечание: Наружный диаметр здесь является приблизительной мерой дать пользователю представление о том, что мы используем в наших экспериментах и оптимизирована для облегчения пирсинг черепа для инъекций плазмида без повреждения мозга, позволяя при этом для жидкости Загрузка и выпуск ДНК. Наружный диаметр может измеряться, глядя на вырезать кончик стекла микроинъекции пипетки, соединенный с микрометрическим линейки под микроскопом светлые области.
    2. Используйте шприц для заполнения микропипеткой с минеральным маслом от его unpulled конца (высылать всех воздуха).
    3. Вставьте микропипеткой наполненный стакан в нано инжектор, следуя инструкциям производителя.
    4. Пустой 2/3rds стекла микропипеткой (сохраняя достаточно нефти, чтобы не допустить въезда воздуха).
  6. Тщательно вставьте подготовленный микропипеткой в пробирку, содержащую раствор плазмида/красителя и заполнить стекло микропипеткой плазмида/краска раствором.

3. сбор зародышей мыши от беременных женщин

  1. Контролировать размножающихся самок ежедневно, чтобы оценить для вагинального подключения, предпочтительно в то же время ежедневно (полудня). День e0.5 соответствует первый день, когда наблюдается Вагинальные вилка.
    Примечание: Эксперименты, описанные здесь может проводиться в мышах одичал типа. Однако, чтобы облегчить идентификацию МГЕ и маркировать все ГАМК INs (или конкретных вложенные наборы, например МГЕ производные INs), трансгенных животных могут быть использованы (например: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre с КРР репортер аллеля,47,и т.д.49). В этой ситуации экспериментальной плазмида инъекции следует выразить еще Флюорофор (например, mCherry или TdTomato) чтобы разрешить визуализации transfected INs (желтый), который можно сравнить с не transfected INs (зеленый).
  2. Пожертвуйте девушки на эмбриональных день e13.5, шеи дислокации.
    Примечание: Анестетиков, учитывая в то время жертвоприношения может повлиять в миграции и выживание50,51 и его следует избегать.
  3. Собирайте эмбрионов, кесарево сечение следующим образом.
    1. Щедро спрей Женский живот с 70% этиловом спирте. Подтянуть кожу живота с парой стерильный пинцет и, с другой стороны, использовать стерилизовать хирургические ножницы для резки кожи от живота.
    2. С второй пары стерильный пинцет и ножницы подтянуть брюшной фасции и сократить его тщательно избегая матки.
    3. С помощью третьей пары стерилизованные щипцами и ножницы, тянуть маточные рожки и вырезать их из полости таза. Место расчлененных рога матки в стерильных 60-мм Петри, наполненный нейронной основе культуры среднего дополнена аминокислоты, витамины и неорганических солей (см. Таблицу материалы для коммерчески доступный продукт).
  4. В стерильные биобезопасности кабинета используйте две пары тонкой пинцетов (по одному в каждой руке) вскрыть эмбрионов из плаценты и изолировать головки путем обезглавливания.
  5. Рельеф вырезать кончиком пипетки пластиковые передачи 3 мл стерильного, аспирационная головы и передачи их в новых стерильных Петри 60-мм слоистых с затвердевшей Черный воском и заполнены с тем же нейронной основе дополняется питательной среды как указано выше.
    Примечание: Этот шаг минимизирует переноса загрязнений (мыши волосы, кровь). Черный воск используется для стабилизации голову во время вскрытия. Культура СМИ не нужно быть кислородом во время этих процедур.

4. внутрижелудочкового плазмида инъекции и Ex Vivo электропорации МГЕ

Примечание: Следующие шаги должны выполняться в стерильных условиях в ранее подготовленных биобезопасности кабинета.

  1. Место Петри 60-мм слоистых с черным воском и содержащие обезглавленное головы в нейронной основе дополняется питательной среды под бинокль в кабинете биобезопасности.
  2. Стабилизировать головы, ростральной части вправо, с тонкой пинцет с левой рукой и использовать nano инжектор в правой руке для вставки 1-2 мкл раствора плазмида/краска на правой боковой желудочек.
    Примечание: Сопредседатель выражение эксперименты могут быть проводимых co-electroporating плазмида спасения и выражая индуцируемый плазмиды путем смешивания обоих плазмид в эквимолярных концентрациях.
  3. Electroporate вводят мозга.
    1. Поместите головку между электродами с отрицательным электродом дорзально позиционируется и параллельно с головы и положительного электрода к вентральной стороне головы целевой MGE.
    2. После того, как хорошо расположены электроды, доставить 4 прямоугольных импульсов 40 V для 50 мс в 500 мс интервалами между импульса.
    3. Удалите любой остаточной ткани из электродов с помощью пинцета, уже помещены в биобезопасности кабинета.
      Примечание: Эти параметры были оптимизированы специально для electroporator, используемые в наших экспериментах. Мы рекомендуем, что пользователи выполнять оптимизацию тесты заранее при использовании другого типа electroporator.
    4. Повторите шаги 4.1 до 4,3 для всех остальных мозги.
      Примечание: Хотя этот протокол описывает манипуляции, необходимые для одного мозга, его можно ввести до 4 мозги последовательно до electroporating каждый мозг, тем самым увеличивая урожайности. Эта стратегия особенно выгодно, когда 2 или более различных плазмид вводят последовательно (например, элемента управления или экспериментальных плазмида) во время же эксперимента (позволяя сравнения между однопометники). Кроме того, это можно придать и electroporate одновременно обе стороны мозга для повышения урожайности, путем размещения электродов полностью параллельна поверхности мозга.

5. мозг диссекции и ломтик Organotypic культур

  1. Хотя по-прежнему манипулирования в стерильных условиях кабинета биобезопасности, вскрыть мозг из черепа.
    1. Стабилизировать голову на слой черного воска, вставляя иглу в каждый глаз тщательно избегая мозга.
    2. Использование тонкой пинцет провести с левой стороны шеи и вторая пара тонкой пинцет рвать кожу от черепа, от задней к передней.
    3. Удерживая голову вбок с помощью пинцета в одной руке, используйте другую пару пинцетом в другой тщательно вырезать черепа на уровне ствола мозга и аккуратно потяните черепа. С каждым пинцет вырезать черепа в сагиттальной плоскости (срединная) на фронт и затем надрезать боково освободить фрагменты черепа.
    4. Поднимите ствола мозга и тщательно вырезать мозговых оболочек и черепных нервов, до тех пор, пока мозг полностью выходит черепа.
      Примечание: Все шаги, описанные в разделе 5.1 должно выполняться в строгих стерильных условиях в области биобезопасности кабинета.
  2. Внедрите мозга в 4% легкоплавких точки агарозы для разрезания.
    1. Заполните чашку Петри 35-мм с агарозы раствор, приготовленный выше (сдержано жидкости при 42 ° C).
    2. Быстро передавать electroporated мозга заполнены агарозы блюдо с помощью пипетки ранее вырежьте передачи. Держите блюдо при комнатной температуре.
    3. Перемешать агарозы металлической палкой, чтобы держать мозг в середине также (для предотвращения затопления) и позиции мозга в плоскости rostro хвостового параллельно на блюдо. Остановите, помешивая, когда агарозы начинает закрепить, чтобы избежать повреждений мозга.
    4. Используйте лезвия для резки агарозы, окружающих мозг для того чтобы сформировать прямоугольного блока, оставляя запас 1-2 миллиметров вокруг мозга. Убедитесь, что в ростральной части мозга перпендикулярно передней предела блока для облегчения ориентации для последующих этапов резания.
    5. Повторите для каждого мозга.
      Примечание: Это возможно сократить более чем одного мозга в то время (максимум 3) на формирование отдельных агарозы блоков при установке каждого мозга на разных высотах.
  3. Vibratome корональных секций и ломтик культуры.
    1. Оттепель один Алиготе 100 X N-2 дополнение (150 мкл) на льду и добавить 15 мл aliquoted питательной среды в стерильных условиях.
    2. Передать каждой скважины 6-ну культуры плиты 750 мкл питательной среды (с 1 X N2 за дополнительную плату).
    3. С помощью пинцета, изогнутые место один Вставка культуры клеток (диаметром 30 мм, размер пор 0,4 мкм, ПТФЭ) в каждом средне заполнены хорошо.
    4. Заполните vibratome Ванна с непрерывно кислородом фаго. Охладите до 4 ° C со льдом вокруг ванны, или использовать охлажденных vibratome.
    5. Установите скорость vibratome 0.150 мм/с и частотой 80 Герц.
    6. Приклейте агарозы блок на vibratome платформу, Ростральные край вниз и брюшной кромки, с которыми сталкивается пользователь.
    7. Вырежьте мозг в корональных разделы для получения 250 мкм толстые секции (при 4 ° C).
    8. Стерилизованные шпатели Соберите 2-3 разделы, содержащие МГЕ и место вставки все секции мозга от одного животного на одном 30-мм мембраной, тщательно избегая дублирования между разделами. Место вставки в одной скважиной 6-ну культуры плиты (содержащие 750 мкл, дополненная питательной среды, как описано выше). Кроме того каждый раздел могут быть размещены на отдельный 13-мм Диаметр мембраны в пластине культуры 12-ну заполнены с 500 мкл дополнены питательной среды. Количество питательной среды, рекомендованных для каждой скважины позволяет Секции мозга будет кормиться в средствах массовой информации без затопления.
      Примечание: Шаги, описанные в 5.3.6 и 5.3.7 не проводятся в условиях полной стерильности, если vibratome можно стерилизовать и используется в области биобезопасности кабинета. Таким образом крайне важно проводить эти шаги тщательно, чтобы избежать любого загрязнения. Надлежащие средства защиты (Чистая маска, перчатки хирургические и халате) следует носить во все времена и частей тела, даже охватывает, такие как волосы, лицо и руки, никогда не следует передавать над культуры пластин (с или без культуры среднего). Также рекомендуется опрыскивать часто на перчатки и шпатели используются для сбора секции мозга на 70% спирте.
    9. Место культуры пластины в вентилируемых стерильные инкубатора при 37 ° C с 60% влажности и 5% CO2 48 или 72 ч.
      Примечание: Эти инкубации раз были оптимизированы для покадровой изображений МГЕ производные INs и конфокальная томография фиксированной ломтиками, соответственно. Оптимальной инкубации раз должен испытываться заранее для каждого экспериментального дизайна. Кроме того если выбрали инкубация 72 h и под, существует не нужно изменить питательной среды. За время инкубации питательной среды следует изменить каждые 2-3 дня.
    10. После инкубации желаемого времени передать под патрон 8 coverslip интересующие разделы и добавить 3-5 мкл питательной среды. Место coverslip в экологической палаты (37 ° C, влажность 60%, 5% CO2) подключены к Перевернутый спиннинг диска конфокальный оснащены приобретение компьютерного программного обеспечения для настройки покадровой изображений сессии.
      Примечание: Кроме того, секции может быть исправлено с параформальдегида 4% (на ночь при 4 ° C или 2 ч при комнатной температуре), а впоследствии и immunostained с различных антител для визуализации морфологические особенности electroporated модули под конфокальный Микроскоп. Хотя eGFP и mCherry могут быть визуализированы на confocal микроскопии без какой-либо борьбе окрашивание процедуры, мы рекомендуем иммуногистохимия против GFP и mCherry для повышения сигнал, так как процесс фиксации может уменьшить флуоресценции, сокращение Обнаружение тонкой компонентов эмбриональных нейронов, например мелких ветвей в процессах пробелы в начале или в конце.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В этом разделе мы предоставляем представитель результаты, полученные после бывших utero электропорации управления плазмида или экспериментальной плазмида, ориентация ген интереса, в MGE зародышей мыши e13.5 следуют organotypic срез культур инкубировали при 37 ° C в течение 48...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этой статье мы предоставляем надежный метод для выполнения ex utero электропорации МГЕ мыши на e13.5 и для поколения organotypic культурах эмбриональных мозга фрагментов. Хотя в vitro методы, такие как Пробирная палата Бойден, сравнительно легко выполнить и могут быть использованы для оц...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать. Мнения, высказанные здесь не обязательно отражают точку зрения министра здравоохранения или правительство Канады.

Благодарности

Эта работа была поддержана операционной гранты от Фонда Savoy и лечения эпилепсии Фонда и оборудованием гранты от Канадского фонда для инноваций E.R (Конфокальный микроскоп) и G.H (вращение диска конфокального микроскопа). Е.р. получает премию карьеры от Fonds de recherche дю Квебек-Santé (FRQ-S; Премия Clinician-Scientist) также, как от канадской институтов для медицинских исследований (КНИИЗ; Молодой следователь Award). Г.Х. — старший ученый FRQ-S. ЕГ.Ф является получателем Steriade-Savoy докторантура награду от Фонда Savoy, Чу Сент-Жюстин фонд докторантура премии и премии докторантура FRQ-S, в партнерстве с Фондом звёзд. Этот проект стал возможным мозга Канады через Фонд исследований мозга Канады, при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Канады, присуждена л.е.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Neurobasal MediumThermoFisher Scientific21103049Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplementThermoFisher Scientific1750404450X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubesSarstedt62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)ThermoFisher Scientific11415064Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-GlutamineInvitrogen25030-081
Horse serum, heat inactivatedMillipore-SigmaH1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100XWisent305-016Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mLVWR89132-062
Class II Type A Biosafety CabinetNuaireNU-540
SucroseBioShopSUC700.1
Sodium ChlorideBioShopSOD001.1
Sodium bicarbonateThermoFisher ScientificS233-500
D+ glucoseMillipore-SigmaG7528-250G
Potassium ChlorideThermoFisher ScientificP217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrousBioShopSPM400.500
Calcium chloride dihydrate ThermoFisher ScientificC79-500
Magnesium sulfate heptahydrateBiosShopMAG522
AgaroseBioShopAGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubesSarstedt62.547.004
1.5 mL centrifuge tubesSarstedt72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette pullerSutter Instruments Co.Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary TubeDrummond scientific1-000-800/12
EthanolVWRE193
5 mL syringeBecton Dickinson & Co309646
Mineral Oil (heavy)Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5World Precision Instruments50451111 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7World Precision Instruments50450411.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips
HTC TweezersWorld Precision Instruments50461711 cm, Straight, flat
Operating scissorsWorld Precision Instruments50122516 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing ForcepsWorld Precision Instruments50121712.5 cm, straight, serrated
Iris ForcepsWorld Precision Instruments50447810.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue ForcepsWorld Precision Instruments50199615 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded endsFisherScientific21-401-5You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter InjectorDrummond scientific3-000-204
TC Dish 60, StandardSarstedt83.390160-mm dish
Tissue culture dishSarstedt83.180035-mm dish
Black WaxFisherScientificS17432
Transfer pipettes Ultident170-CTB700-2123 mL, small bulb
Stereo MicroscopeLeica BiosystemsLeica M80In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square PoratorBTX Harvard ApparatusECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mmBTX Harvard Apparatus45-0487
25G 1 1/2Becton Dickinson & Co305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtomeLeica BiosystemsVT1000S
GEM, Single edge razor bladeElectron Microscopy Sciences71952-10Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 wellIbidi80827Pack of 15
Millicell cell culture insertMillipore-SigmaPICM0RG5030 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscopeLeica MicrosystemsN/A
Spinning disk confocal head Ultraview VoxPerkin ElmerN/A
Volocity 6.0 acquisition softwareImprovision/Perkin ElmerN/A
LiveCell Stage top incubation systemPathology devicesLC30030Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscopeLeica
mCherry-Lifeact-7Addgene54491Gift from Michael Davidson
Fast Green FCFMillipore-SigmaF7258-25G25G bottle, certified by the Biological Stain Commission

Ссылки

  1. Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. , 649325(2011).
  2. Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  5. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562 (Pt 1), 9-26 (2005).
  6. Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71 (1), 45-61 (2011).
  7. Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38 (1), 2019-2029 (2013).
  8. Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44 (2), 251-261 (2004).
  9. Zhu, Y., Li, H. -S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
  10. Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28 (1), 62-73 (2008).
  11. Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59 (5), 733-745 (2008).
  12. Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69 (4), 763-779 (2011).
  13. Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30 (20), 7072-7077 (2010).
  14. Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25 (24), 5691-5699 (2005).
  15. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a001834(2010).
  16. Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30 (25), 8660-8670 (2010).
  17. Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. , (2017).
  18. Chu, J., Anderson, S. A. Development of cortical interneurons. Neuropsychopharmacology. 40 (1), 16-23 (2015).
  19. Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23 (4), 894-900 (2006).
  20. Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2 (2), e00031(2010).
  21. Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63 (4), 466-481 (2009).
  22. Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120 (4), 503-535 (2010).
  23. McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165 (3), 775-784 (2004).
  24. Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109 (4), 400-404 (2005).
  25. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7 (5), (2017).
  26. Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25 (15), 1221-1226 (2014).
  27. Zito, A., et al. Neuritin 1 promotes neuronal migration. Brain Structure and Function. 219 (1), 105-118 (2014).
  28. Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25 (4), 991-1003 (2015).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77 (1), 70-82 (2013).
  30. Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
  31. Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22 (3), 680-692 (2012).
  32. Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34 (14), 4941-4962 (2014).
  33. Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26 (10), 1131-1148 (2016).
  34. Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15 (3), S371-372 373-380 (2012).
  35. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  36. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518(2014).
  37. Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97 (2), 287-292 (1997).
  38. Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  39. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32 (2), 738-745 (2012).
  40. Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27 (14), 3875-3883 (2007).
  41. Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524(2014).
  42. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
  43. Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, 2.26.21-22.26.18 (2016).
  44. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  45. Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59 (5), 722-732 (2008).
  46. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
  47. Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20 (2), (2000).
  48. Bottenstein, J. E. Cell culture in the neurosciences. , Plenum Press. (1985).
  49. Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30 (15), 5334-5345 (2010).
  50. Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118 (3), 516-526 (2013).
  51. Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865(2016).
  52. Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92 (12), 1785-1791 (2014).
  53. Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34 (23), 7787-7801 (2014).
  54. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28 (7), 1613-1624 (2008).
  55. Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32 (49), 17690-17705 (2012).
  56. Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19 (1), 27-37 (1997).
  57. Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129 (1), 245-252 (2002).
  58. Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23 (4), 729-744 (2012).
  59. Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
  60. Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496 (1-3), 23-32 (2004).
  61. Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62 (1), 53-71 (2009).
  62. Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15 (2), 229-237 (2016).
  63. Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex--an in vitro study. Neuroscience. 201, 357-365 (2012).
  64. Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7 (1), 4897(2017).
  65. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27 (12), 3078-3089 (2007).
  66. Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93 (5), e1035 1035-1048 (2017).
  67. Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656(2017).
  68. Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23 (18), 4846-4858 (2014).
  69. Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501 (7466), 217-221 (2013).
  70. Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
  71. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33 (21), 9122-9139 (2013).
  72. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
  73. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  74. Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134e13 5organotypic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены