JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Цель настоящего Протокола заключается в спектрофотометрически контролировать транс плазмы мембраны электронного транспорта используя внеклеточного электрон акцепторов и проанализировать ферментативные взаимодействия, которые могут произойти с эти внеклеточные электрона акцепторами.

Аннотация

Транс плазмы мембраны переноса электронов (tPMET) играет роль в защите клеток от внутриклеточного редуктивной стресса, а также защиту от повреждений, внеклеточная окислителей. Этот процесс транспортировки электроны от внутриклеточного восстановителях внеклеточного окислителей не является правильно определенным. Здесь мы представляем спектрофотометрические анализы по C2C12 myotubes следить за tPMET, используя внеклеточного электрон акцепторов: водорастворимые tetrazolium соль-1 (WST-1) и 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP или DCIP). Путем сокращения этих акцепторов электронов мы в состоянии контролировать этот процесс в режиме реального времени анализа. С добавлением ферментов, таких как аскорбат оксидазы (AO) и супероксиддисмутазы (СОД) для анализов мы можем определить, какая часть tPMET объясняется аскорбат экспорта или супероксид производства, соответственно. В то время как WST-1 было показано производить стабильные результаты с низким фоном, DPIP был в состоянии быть повторно окисленные после добавления AO и SOD, которая была продемонстрирована с спектрофотометрический анализ. Этот метод демонстрируется в реальном времени, несколько хорошо, быстро спектрофотометрические пробирного с преимущества по сравнению с другими методами, используемыми для наблюдения за tPMET, как Гексацианоферрат (FeCN) и c сокращение ferricytochrome.

Введение

Очищенная плазменных мембран возможность уменьшения акцепторов электронов привело к считает, что плазматической мембраны имеет присущие окислительно-восстановительного потенциала1. Ранее видели в грибов, растений и животных, tPMET представляет собой процесс, общие для нескольких организмов2,3,4,5. В частности этот процесс был продемонстрирован в Saccharomyces cerevisiae, морковь клеток, эритроцитов, лимфоцитов, остеосаркома, меланома, макрофаги, скелетных мышц и нейтрофилов2,3, 4 , 5 , 6 , 7. в процессе, который перевозит электронов через плазматической мембраны для уменьшения внеклеточного окислителей, tPMET участвует в многих клеточных функций, в том числе: рост клеток5,8, жизнеспособность клеток9, железо метаболизм10, сигнализации11,12,13и защита от реактивнооксигенных видов12,,1415клеток. Из-за tPMET в причастности многих клеточных функций, дисбаланс tPMET был предположил вносить вклад в развитие некоторых серьезных заболеваний, включая рак16,17сердечно-сосудистых заболеваний и метаболических синдром18.

Существует несколько способов для отслеживания передачи электронов через плазматическую мембрану, но наиболее широко используемый метод заключается в оценке сокращения акцепторов внеклеточного электронов через колориметрические анализов. Часто используемые внеклеточного электрона акцепторов являются соли tetrazolium, DPIP, FeCN и ferricytochrome c19,20. Наиболее часто используемым tetrazolium соль является второго поколения соли известный как19WST-1. Это соединение проще использовать в колориметрические анализов по сравнению с первого поколения tetrazolium соли из-за две группы сульфонат, которые увеличивают его растворимость воды21. WST-1, в сочетании с промежуточных электрон акцептора 1-метокси мембранотропного порфириновых (МПМ), уменьшается в два одного электрона передачи событий. Это сокращение меняется слабо цвета окисленной формы WST-1 к более интенсивным, желтые Формазаны20,22. WST-1 имеет коэффициент Высокая молярная вымирания 37 x 103 M-1см-1, приводит к высокой пробирного чувствительность21,22. DPIP также используется в качестве акцептора внеклеточного электронов для мониторинга tPMET. Было показано, что DPIP может быть внеклеточно уменьшен tPMET без помощи промежуточных электронных акцепторов23,24. Из-за отсутствия промежуточных электронных акцепторов DPIP может непосредственно пикап электроны от плазматической мембраны, в отличие от WST-124. Подобно DPIP, FeCN было показано, быть уменьшена внеклеточно для Ферроцианид tPMET без помощи промежуточных электронных акцепторов19,24. В отличие от WST-1 и DPIP FeCN имеет коэффициент низкий Молярная вымирания приводит к нижней пробирного чувствительность9. Другой часто используемые внеклеточного электрон акцептора следить за tPMET-ferricytochrome c. аналогичен WST-1, ferricytochrome c сокращение увеличивается с использованием промежуточных электрон акцептора, МПМ22. Хотя, в отличие от WST-1 c метод ferricytochrome менее чувствительным из-за высокой фон и коэффициент низкий Молярная исчезновения22.

Здесь мы представляем метод для в реальном времени анализ tPMET через спектрофотометрические анализов. Метод используется внеклеточного электрона акцепторов WST-1 и DPIP, как они оба имеют коэффициентом Высокая молярная вымирания, в то время как существо менее дорогостоящим по сравнению с другими широко используется акцепторов внеклеточного электронов как ferricytochrome c. Мы использовали мембранотропного порфириновых (PMS) вместо МП они имеют аналогичного химического состава и PMS гораздо дешевле. МПМ воздухе стабилен, которая является важной характеристикой для коммерческих комплект, который нуждается в длительный срок. Однако мы делаем PMS свежие для калибровочных, поэтому стабильность не должно быть проблемой. Мы также представляем метод для оценки возможных ферментативные взаимодействий (см. Рисунок 1) между внеклеточным электрон акцептора и ферменты, которые могут быть использованы для дальнейшей характеризации процесс tPMET. В частности ферменты, которые AO и SOD могут использоваться определить какая часть tPMET благодаря аскорбат транспорта или внеклеточная супероксид релиз, два общих метода для электронов перевозиться через плазматическую мембрану.

протокол

Примечание: Смотрите Рисунок 1 Схематический обзор ключевых шагов.

1. WST-1 сокращения Assay

  1. Расти и дифференцировать C2C12 адэрентных клеток с использованием стандартной ячейки культуры процедуры7 в 96-луночных пластину, используя строки A-F.
    1. Воспользуйтесь средством дифференциации, состоящий из Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) с 2% лошадь сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 0,1 мг/мл. Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO2.
    2. При мониторинге аскорбат участие в tPMET, дополнение дифференциация СМИ с аскорбиновой кислотой 100 мкм. Позволяют клеткам инкубировать в дифференциации СМИ для ~ 24-48 ч.
  2. Подготовка запасов WST-1 и PMS решения.
    1. Чтобы сделать 10 мм запас WST-1, распустить 0,033 г WST-1 (формула веса (FW): 651.34 г/моль) в 5 мл фосфата буфер солевой раствор (PBS). Хранить при 4 ° C.
    2. Чтобы сделать 5 мм запас PMS, распустить 0.0023 g PMS (FW: 306.34 г/моль) в 1,5 мл дейонизированной H2O (diH2O). Хранить при температуре-20 ° C и защищать от света.
  3. Добавить 0,0108 г глюкозы для конечной концентрации 5 мм до 11,4 мл PBS или HEPES буфер солевой раствор (HBS; 20 мм HEPES натриевая соль, 140 мм NaCl, 5 мм KCl, 2,5 мм MgSO4, 1 мм CaCl2). 480 мкл 10 мм WST-1 для конечной концентрации 400 мкм и 48 мкл 5 мм PMS для конечной концентрации 20 мкм.
  4. При мониторинге аскорбат участие в tPMET, решение разделите два 6 мл аликвоты. Один Алиготе 6 мкл diH2O и для других Алиготе мкл 6 ку/2мл AO для конечной концентрации 2 ед/мл.
  5. При мониторинге супероксид участие в tPMET, решение разделите два 6 мл аликвоты. Один Алиготе 55 мкл буфера4 КПО 0,1 М и для других Алиготе мкл 55 6,5 ку/мл SOD для конечной концентрации 60 ед/мл.
  6. Вымойте клетки с PBS. Аспирационная средства массовой информации и добавить 150 мкл PBS. Затем, аспирационная PBS.
    Примечание: Assay делается с покрытием, прилагаемый клетки. Таким образом нет центрифугирования или использование трипсина в процессе стирки.
  7. 100 мкл раствора WST-1 (-) SOD или (-) АО столбцы 1-6 и добавить 100 мкл раствора WST-1 (+) SOD или (+) AO столбцы 7-12 в 96-луночных пластины. Использовать строки, G и H в качестве фона элементов управления (например, для мониторинга изменений в поглощения в одиночку реагента в скважинах без клетки).
  8. Измерение оптической плотности значений, с помощью спектрофотометра каждые 10 мин на 1 ч в 438 Нм.
  9. После прочтения, аспирационная СМИ и мыть каждый хорошо с 150 мкл PBS. Затем, аспирационная PBS.
  10. Расчет изменения в поглощения для каждой скважины путем вычитания начального поглощения для колодца от поглощения в любой точке времени для этого хорошо. Исправьте это изменение для изменения поглощения (если таковые имеются), наблюдается на фоне скважинах (т.е., скважин с Пробирной решения, но не клетки).
  11. Для анализа нормализовать оптической плотности данных измерения управления 60 мин или промыть скважин с PBS или HBS и затем выполнить bicinchoninic кислоты assay протеина (BCA).
  12. Добавить 2 мг/мл бычьим сывороточным альбумином (БСА) стандарт (диапазон от 0,5-2 мкл для стандартной кривой, в зависимости от степени слияния клеток) для пустой скважин (строк G и H), затем добавьте BCA реагент для всех скважин.
  13. Количественную оценку данных через нмоль WST-1 сокращения за мкг белка. Используйте 37 мм-1 см-1 22 как коэффициент вымирания для снижения WST-1 438 Нм.

2. DPIP сокращения Assay

  1. Расти и дифференцировать C2C12 адэрентных клеток с той же процедурой, шаг 1.1.
  2. Запасов 10 мм DPIP раствор готовят следующим образом. Распустить 0,029 g DPIP (FW: 290.08 г/моль) в 10 мл diH2O. Confirm концентрация DPIP путем измерения оптической плотности на 600 нм с спектрофотометром. Использовать 1 мм-1 см-1 23 как коэффициент вымирания для снижения DPIP 600 Нм. Хранить при 4 ° C.
  3. Добавьте 0,0108 г глюкозы в 11.880 мл PBS для конечной концентрации 5 мм. 120 мкл 10 мм DPIP для окончательного концентрации 100 мкм.
  4. При мониторинге аскорбат участие в tPMET, решение разделите два 6 мл аликвоты. Один Алиготе 6 мкл diH2O и для других Алиготе мкл 6 ку/2мл AO для конечной концентрации 2 ед/мл.
  5. При мониторинге супероксид участие в tPMET, решение разделите два 6 мл аликвоты. Один Алиготе 55 мкл буфера4 КПО 0,1 М и для других Алиготе мкл 55 6,5 ку/мл SOD для конечной концентрации 60 ед/мл.
  6. Аспирационная СМИ и вымыть клетки в 150 мкл PBS. Аспирационная PBS и 100 мкл раствора (-) DPIP SOD или (-) АО столбцы 1-6 и добавить 100 мкл раствора (+) SOD DPIP или (+) AO столбцы 7-12 в 96-луночных пластины. Использовать строки G и H будет в качестве фона элементов управления (например, для мониторинга изменений в поглощения в одиночку реагента в скважинах без клетки).
  7. Измерение оптической плотности на 600 нм с помощью спектрофотометра каждые 10 мин на 1 ч. количественно изменения поглощения относительно управления на 60 мин аналогичные шаги 1.9-1,13.

3. определение того, являются ли снижение электрона акцепторов субстратов АО или SOD

  1. 5.436 мл PBS или HBS 240 мкл 10 мм WST-1 для конечной концентрации 400 мкм и 24 мкл 5 мм PMS для конечной концентрации 20 мкм.
    1. Для DPIP добавьте 60 мкл 10 мм DPIP, для окончательного концентрации 100 мкм, 5.940 mL HBS или PBS.
  2. 100 мкл раствора для каждой хорошо в квартиру-96-луночных днище в отсутствие клеток и измерения поглощения в спектрофотометром в 438 Нм, для WST-1, или 600 Нм, для DPIP.
  3. 1 мкл 10 мм аскорбат, половина из скважин для конечной концентрации 100 мкм. Следить за поглощения, до тех пор, пока она стабилизируется.
  4. После стабилизации мкл 1 200 ед/мл AO для конечной концентрации 2 ед/мл для каждой скважины или 1 мкл 6 ку/мл SOD конечная концентрация 60 ед/мл для каждого Ну и контролировать поглощения за 1 час.

Результаты

Статистические данные были выполнены с ANOVA неоднократные меры с использованием статистического программного обеспечения RStudio25. Размеры выборки, указаны в рисунке легенды.

Для контроля за tPMET, C2C12 myotubes были использованы нар...

Обсуждение

Мы представили два метода для использования внеклеточного электрон акцепторов, WST-1 и DPIP, в спектрофотометрические анализов для мониторинга tPMET в C2C12 myotubes. С ростом клеточных линий в стандартных культуры процедурах и читатель спектрофотометр пластины можно контролировать tPMET с этих акц?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Томас Белл, Lyn Mattathil, Марк Манино и Neej Patel за их техническую поддержку. Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения США награду R15DK102122 из Национального института диабета и пищеварения и заболевания почек (NIDDK) Джонатан Fisher. Рукопись содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIDDK или национальных институтов здравоохранения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
C2C12 myoblastsAmerican Type Culture Collection CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucoseSigmaD6046
Fetal Plex animal serum complexGemini Bio-Products 100-602
penicillin-streptomycinSigma516106
horse serumGibco Technologies16050-130
Dulbecco's phosphate buffered salineSigmaD8537
trypsin-EDTASigmaT4049
15 cm culture dishesTPP93150
96 well culture platesTPP92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
phenazine methosulfate SigmaP9625
L-ascorbic acidSigmaA5960
ascorbate oxidase SigmaA0157
superoxide dismutase SigmaS5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt ICN Biomedicals215011825
D-(+)-glucoseSigmaG7528
HEPES sodium saltSigmaH3784
sodium chlorideSigmaS7653
potassium chlorideFisher Scientific BP366
magnesium sulfate heptahydrateSigmaM5921
calcium chloride dihydrateSigmaC7902
potassium phosphateFisher Scientific BP363
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Powerwave X-I spectrophotometerBiotek Insturmentsdiscontinued 
Spectronic Genesys 5 SpectrophotometerThermo Scientific336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterileMidSci781602
Iron (II) chloride tetrahydrateSigma220299
Iron (II) sulfate heptahydrateSigma215422
hypoxanthineSigmaH9636
xanthine oxidaseSigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Insturmentsdiscontinued 

Ссылки

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234, 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. . . R: A language and environment for statistical computing. , (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135tPMETWST 1DPIPC2C12 myotubes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены