JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол визуализировать клетки иммунной системы, внедренные в матрицу трехмерного (3D) коллагена, с помощью микроскопии свет лист. Этот протокол также рассматриваются как отслеживать миграции клеток в 3D. Этот протокол может использоваться для других типов клеток подвеска в матрице 3D.

Аннотация

В естественных условиях, активации, распространением и функции всех иммунокомпетентные клетки происходят в трехмерных (3D) среде, например в лимфатических узлах или тканей. До даты большинство систем в vitro полагаются на двухмерный (2D) поверхности, такие как культура клетки пластин или coverslips. Чтобы оптимально мимических физиологических условиях в пробиркемы используем простой 3D коллагеновой матрицы. Коллаген является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса (ECM) и широко используется в качестве 3D матрицы. Для 3D визуализации, недавно разработанных свет лист микроскопии технологии (также называется один самолет освещения микроскопии) отличен с высокой скоростью, большие глубины, низкий отбеливания и photocytotoxicity. Кроме того свет лист микроскопии является особенно выгодным для долгосрочных измерений. Здесь мы описываем оптимизированный протокол как создать и обработать человека иммунные клетки, например первичного человека цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и природные убийца (НК) клетки в 3D коллагеновой матрицы для использования с свет лист микроскопии для живых клеток и фиксированных выборок. Процедура приобретения изображений и анализа миграции клеток представлены. Особое внимание уделяется выделить важные шаги и факторы для пробоподготовки и анализа данных. Этот протокол может использоваться для других типов клеток подвеска в 3D коллагеновой матрицы и не ограничивается иммунных клеток.

Введение

Большинство знаний о миграции клеток происходит от 2D экспериментов1,2,3, которая обычно проводится в стеклянные или пластмассовые поверхности культуры/изображений блюдо. Однако, в большинстве случаев, физиологические сценарий требует 3D микроокружения, в котором внеклеточного матрикса (ECM) играет решающую роль. ECM не только обеспечивает эфирное 3D структуры для поддержания надлежащего клеток морфологии, но также предлагает выживания сигналов или направленного подсказки для оптимального функционирования многих клеток4,5 . Таким образом 3D окружающей среды требуется для лучшего определения клеточных функций и поведения в среде, лучше отражающие физиологических контекст.

В человеческом теле большинство клеток особенно иммунных клеток, оказывают свои функции согласно сценарию 3D. К примеру активированные Т-клетки сторожевые тканей, поиск для клеток-мишеней, наивно T-клетки мигрируют через лимфатические узлы в поисках их родственных антиген представляющих клеток, во время которых режим миграции и машины адаптированы к соответствующим внеклеточного окружающей среды3,6,7. Геля 3D коллаген широко использовался как устоявшихся и хорошо изученных 3D клеточной культуры системы8,9,10. Наши предыдущие работы показывает, что основной лимфоцитах человека мобильны и мигрируют со средней скоростью около 4,8 мкм/мин в 0,25% коллагена основе матрицы11. Перестановка цитоскелета играет ключевую роль в миграции клеток12. Накопление доказательств показывает, что лимфоциты не применяется только один режим миграции еще можно переключаться между определенное поведение миграции в зависимости от местоположения, микроокружение, цитокины, эозинофилов градиенты, и внеклеточных сигналов какой мотив мигрирующие поведение в 3различными способами.

Для надежного анализа иммунных клеток функции и поведение, например, миграция, формирования протрузии или везикулярный транспорт, это большое преимущество, чтобы иметь возможность получить изображения в относительно больших объемах 3D быстрым и надежным способом. Для 3D визуализации, недавно разработанных свет лист микроскопии технологии (также называется один самолет освещения микроскопии) предлагает удовлетворительного решения13,14. Во время визуализации приобретения, тонколистовой статический свет генерируется для освещения образца. Таким образом, на плоскости фокуса большой площади может быть освещен одновременно не затрагивая-плоскости клетки. Эта функция позволяет высокой скоростью с резко сниженным отбеливания и photocytotoxicity. В этой статье мы описываем, как визуализировать первичного человека иммунные клетки, с помощью микроскопии свет листа и как для анализа миграции в сценарии 3D.

протокол

Исследования, проведенные для этого исследования с человеческого материала (лейкоцитов сокращения системы камер от человеческой крови доноров) уполномоченным местным этике (декларация от 16.4.2015 (84/15; Профессор д -р Rettig-Stürmer)) и соответствующие руководящие принципы.

1. Подготовка нейтрализованы коллагена раствор (500 мкл)

  1. Передача 400 мкл охлажденные коллагена раствор (10,4 мг/мл) в стерильных 1,5 мл трубку под капотом культуры клеток. Медленно добавьте 50 мкл охлажденные 10 x PBS (рН 7,0-7.3) до 400 мкл охлажденные коллагена раствор. Mix решение, нежно черепица трубки.
    Примечание: Все шаги в части 1 должно быть сделано под капотом культуры клеток.
  2. Мкл 8 0,1 М NaOH в 500 мкл раствора коллагена от 1.1. для регулировки рН 7,2-7,6. Используйте рН тест-полоски (pH диапазон: 6-10) для определения рН смеси.
    Примечание: Объемы могут отличаться для различных пакетов коллагена. Раствор NaOH должен смешиваться медленно, чтобы избежать воздушных пузырей. Смесь должны храниться на льду, чтобы избежать гелеобразования коллагена.
  3. Добавить 2 мкл стерильных ddH2O сделать окончательный объем 500 мкл. хорошо перемешать и хранить это решение коллаген (8.32 мг/мл) на льду или на 4 ° C до дальнейшего использования.
    Примечание: Согласно этому условию, нейтрализованные коллаген может использоваться для 24 h. аликвоты не рекомендуется чтобы избежать воздушных пузырей.

2. Пробоподготовка для микроскопии флуоресцирования свет листа с помощью капилляров

  1. Дневно обозначить живой клетки интерес с желаемой первичной флуоресцентных красителей15 или флуоресцентные белки11 как описано ранее.
  2. Передача 1 × 106 клеток в стерильных 1,5 мл трубку под капотом культуры клеток. Центрифуга трубки на 200 x g 8 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл питательной среды.
    Примечание: Плотность клеток 5 × 106 клеток/мл рекомендуется для визуализации иммунных клеток человека миграции, особенно для цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и естественных киллеров (НК).
  3. Мкл 85.9 нейтрализованы коллагена решения от 1.3. в суспензию клеток от 2.2. и правильно смешивать достичь коллаген концентрации 2,5 мг/мл. Оставьте смесь мобильный/коллагеновые на льду в капюшоне.
    Примечание: Предположим, желаемой концентрации коллагена N мг/мл, объем нейтрализованы коллагена раствор (для 200 мкл суспензии клеток) = 200 × N /(8.32-N)
  4. Далее, поместите соответствующий поршень в капилляр (внутренний диаметр ~ 1 мм) до тех пор, пока поршень составляет 1 мм из капилляра. Влажные поршень путем погружения в питательной среды (рис. 1A).
    Примечание: Этот шаг может помочь предотвратить воздушные пузыри, когда капилляра погружается в мобильный/коллагеновые микс. Капилляр и поршень не должны быть стерильными.
  5. Окунитесь в мобильный/коллагеновые микс от 2.3 капилляра. Медленно потяните поршень обратно на 10-20 мм (рис. 1B). Протрите наружной стенки капилляра с бумажным полотенцем, смоченным 70% этанол спрей для удаления оставшихся решения коллагена.
  6. Маунт капилляра с глина моделирования на внутренней стенке трубки 5 мл и нажмите мобильный/коллагеновые смеси к краю капиллярные (рис. 1 c).
  7. Держите капилляр при 37 ° C с 5% CO2 на 1 ч для полимеризации коллагена.
  8. Добавьте 5 мл питательной среды (около 1-2 мл). Аккуратно нажмите полимеризованной коллаген стержень, в средне-и около 3/4 коллагена, висит в среде (рис. 1 d).
  9. Держите капилляра, как это, при 37 ° C с 5% CO2 для еще 30 минут, чтобы сбалансировать коллагена стержень с носителя.
    Примечание: Впоследствии, коллаген стержень может быть вытащил обратно в капиллярной и культивировали до дальнейшего использования.

3. изображение приобретение с помощью микроскопии свет лист

  1. Ассамблея палаты образца согласно инструкции производителя.
  2. Включите инкубации и микроскоп для нагрева образца камеры до 37 ° C (для живых клеток изображений только).
  3. Капилляр в палате образец и найдите пример найти область интереса для захвата изображений.
  4. Активируйте соответствующий laser(s). Задайте следующие параметры: Лазерные власти, выдержка, шаг размер z стек, начальное и конечное положение z стека, и интервал времени для живых клеток.
    Примечание: например, образец в рисунке 2 был воспроизведен образ каждые 40 s для 6 ч при 37 ° C с шагом размером 1 микрон (Общая толщина: 538 мкм). Мощность лазера был 1% с Выдержка 30 г-жа размер пикселя в направлении x-y 0.23 мкм.
  5. Начало захвата изображений.

4. Автоматическое отслеживание анализ

  1. Откройте конвертер файлов, нажмите кнопку Добавить файлы для выбора изображений файлов преобразовываться в формат файлов программного обеспечения (*.ims). Нажмите кнопку Обзор и выберите папку для сохранения преобразованных файлов. Нажмите кнопку выполнить все.
  2. Откройте программное обеспечение для анализа. Нажмите кнопку, превзойти. Перейдите к файлу и нажмите кнопку Открыть, затем выберите изображения файл для анализа.
    Примечание: Если большой размер файла этот шаг может занять время. Файлы размером более 1 терабайт (ТБ) не рекомендуются для одного эксперимента как процесс такие большие файлы являются весьма вычислительные мощности требованием.
  3. Нажмите кнопку Добавить новые места. Установите флажок Процесса весь образ окончательно. Нажмите кнопку Далее.
  4. Введите координаты x и y (в пикселях) для определения области интереса. Введите число кадров (время и позиции z) для анализа. Нажмите кнопку Далее.
  5. Выберите целевой канал, который содержит объекты, которые необходимо отслеживать, в раскрывающемся списке Источник. Введите xy Ориентировочная диаметр (в мкм). Нажмите кнопку Далее.
    Примечание: Диаметр оценкам xy – средний диаметр в измерении x-y объектов, которые необходимо отслеживать.
  6. Выберите качество. Установите порог, в котором большинство клеток (объекты) должны быть включены. Нажмите кнопку Далее.
  7. Выберите нужный алгоритм (Авторегрессии движения рекомендуется). Введите расстояние Макс (рекомендуется20 мкм ) и Макс разрыв размера (рекомендуется 3 или 2). Нажмите кнопку весь процесс окончательно изображение.
    Примечание: Максимальное расстояние и Макс размер интервала являются два пороговых значения сломать треков. Говоря более конкретно в двух кадров непрерывной когда расстояние между того же объекта превышает максимальное расстояние, этот объект в кадре позднее будет рассматриваться как новый объект. Иногда во время приобретения тот же объект может исчезнуть в течение нескольких фреймов и показать снова. В этом случае только тогда, когда этот объект появляется в пределах Макс разрыв размера, он будет рассматриваться как тот же объект.
  8. Выберите Тип фильтра и выберите параметр, чтобы исключить нежелательные треков.
    Примечание: Этот шаг является необязательным.
  9. Нажмите кнопку Далее и затем нажмите кнопку Готово.
    Примечание: Этот шаг может занять часов до суток в зависимости от вычислительной мощности.
  10. Нажмите кнопку Редактировать треки и выбрать Правильный дрейфа. Выберите соответствующий алгоритм (Поступательные смещения рекомендуется). Выберите желаемый Размер результирующего набора данных (Новый размер, равным текущему размеру рекомендуется). Нажмите кнопку ОК.
    Примечание: Этот шаг является лишь требуется, когда коллаген дрейфовал во время захвата изображений.
  11. Нажмите Статистика и выберите Настроить список видимых значений статистики. Проверить параметры интерес быть экспортированы (например, координаты, скорость и т. д). Нажмите кнопку ОК.
  12. Нажмите кнопку Экспорт всех статистических данных в файл и введите имя файла.

5. Фиксация и иммунофлюоресценции окрашивания клеток в Коллагеновые матрицы

  1. Передачи 1000 мкл параформальдегида 4% (ПФА, в PBS) в 5 мл трубку под химические вытяжки.
    Примечание: PFA должны быть сбалансированы до комнатной температуры.
  2. Окуните капилляра с полимеризованной коллагена от 2,9. в раствор PFA (за ~ 5 мм) и монтировать капилляр на внутренней стенке трубки 5 мл с пластилин (как показано на рисунке 1 c).
  3. Аккуратно нажмите поршень, до тех пор, пока половина коллагена стержня висит в решении PFA (рис. 1 d). Держите трубку при комнатной температуре в течение 20 мин.
  4. Вытяните назад поршень, чтобы получить коллаген стержня внутри капилляра. Взять из капилляра и отбросить PFA.
  5. Маунт капилляра в свежий трубку и добавьте 1 mL PBS. Убедитесь, что капилляр погружается в PBS.
  6. Аккуратно нажмите поршень, до тех пор, пока половина коллагена стержня висит в решении. Смонтируйте капилляр на внутренней стенке с глина моделирования.
  7. Держите трубку при комнатной температуре в течение 5 мин.
  8. Повторите 5.4. -5.7 для еще 2 раза.
  9. Вытяните назад поршень, чтобы получить коллаген стержня внутри капилляра. Выбросите PBS. Передача 1-2 мл буфера блокирование/permeabilization (PBS + 1% BSA + 0.1% неионные ПАВ) в трубку и повторите 5.6.
    Примечание: BSA (1%) могут быть заменены 5% сывороточного животного, вторичные Ab был поднят в.
  10. Держите трубку при комнатной температуре за 30-60 мин.
  11. Вытяните назад поршень, чтобы получить коллаген стержня внутри капилляра. Удалить в буфер permeabilization. Перевести 200-500 мкл основное антитело в буфере блокирование/permeabilization и изгоняет стержня в раствор.
  12. Держите трубку при комнатной температуре в течение 1 ч.
  13. Вымойте коллагена стержня 3 раза с PBST (PBS + 0.1-% неионные ПАВ), как описано в 5.4. -5.8.
  14. Инкубируйте жезл в вторичное антитело в буфере блокирование/permeabilization за 1 ч при комнатной температуре. Держите его от света.
  15. Вымойте коллагена стержня 3 раза с PBS, как описано в 5.4. -5.8.
  16. Вытяните назад поршень, чтобы получить коллаген стержня внутри капилляра. Сохранить образцы в PBS до изображений.
  17. Сканировать образцы, как описано в разделе 3.

Результаты

Формирования протрузии во время миграции клеток T является весьма динамичный процесс, который является актина зависимых. Чтобы визуализировать выступ формирование первичных человеческих CTL, мы временно transfected mEGFP плавленый белка на этикетке Цитоскелет актина в CTL как ...

Обсуждение

Большинство анализов в vitro осуществляется на 2D поверхности, например в культуре клеток тарелки, чашки Петри или на coverslips, тогда как в естественных условиях клетки, особенно иммунные клетки, опыт работы главным образом 3D микроокружения. Новые свидетельства показывает, что мигр?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют финансовые или коммерческие конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим институт клинической Hemostaseology и трансфузионной медицины для предоставления донорской крови; Кармен Hässig и кора Ходжа за отличную техническую помощь. Мы благодарим Jens Реттиг (Университет Саарленд) для модифицированных pMAX вектора, Roland Ведлих-Söldner (Университет Мюнстер) для оригинальной конструкции рубиново-LifeAct и Кристиан Юнкер (Университет Саарленд) для генерации LifeAct-mEGFP конструкции. Этот проект финансировался 1027 Sonderforschungsbereich (проект A2 до B.Q.) и 894 (проект A1 м.г.). Микроскоп свет лист был финансируемых DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Fibricol, bovine collagen solutionAdvanced Biomatrix #5133-20MLCollagen matrix
0.5 M NaOH SolutionMerck1091381000for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agaroseAffymetrix32821-10GMSample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells KitThermo Fisher11348DIsolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher11132DActivation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2Thermo FisherPHC0023Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kitLonzaV4XP-30XXTransfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgGAbcamab124904IF
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284IF
CellMask Orange Plasma membrane StainThermo FisherC10045Fluorescent cell label
Tween 20SigmaP1379-250mLIF
Triton X-100Eurobio018774IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered salineThermo Fisher14190250IF
Bovine serum albuminSigmaA9418-100GIF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbitThermo FisherA-11011IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)ZeissN.A.
Cell culture hoodThermo FisherHeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i Thermo FisherN.A.
Centrifuge 5418 and 5452EppendorfN.A.
PippettesEppendorf3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tipsVWR89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubesSarstedt 62.554.002
Capillaries 50 µLVWR (Brand)613-3373Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillariesVWR (Brand)BRND701934"Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stipsMerck1095430001to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringesBDZ230723 ALDRICHAlternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)Play-DohN.A.
Imaris file converterBitplaneavailable at http://www.bitplane.com Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)Bitplaneavailable at http://www.bitplane.com Analysis of 3D and 4D imaging data

Ссылки

  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
  3. Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
  4. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
  5. Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
  6. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
  7. Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
  10. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
  11. Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
  12. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
  13. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
  14. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  15. Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
  16. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  17. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
  18. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  19. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
  20. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
  21. Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  22. Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
  23. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  24. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  25. Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
  26. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  27. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  28. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1363D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены