Подход, основанный на капельки Microfluidic и микросферы ПЦР-амплификации для одноцепочечной ДНК ампликонов

Резюме

Эта работа предоставляет метод для изготовления на основе капелька microfluidic платформ и применение полиакриламида микросферы для микросфер ПЦР-амплификации. Микросфера PCR метод делает возможным получить одноцепочечной ДНК ампликонов без разделения двуцепочечной ДНК.

Аннотация

На основе капелька микрофлюидика возможность надежного производства однородных микросфер в канале microfluidic, предоставляя контролируемый размер и морфология полученные микросфер. Микросфера Сополимеризованная с acrydite ДНК-зонд был успешно сфабрикованы. Различные методы, такие как асимметричное PCR, при exonuclease пищеварение и изоляции на стрептавидина покрытием магнитные бусы может использоваться для синтеза ДНК одноцепочечной (ssDNA). Однако эти методы не могут эффективно использовать большие объемы высокоочищенных ssDNA. Здесь мы описываем микросферы ПЦР протокола, детализируя как ssDNA можно эффективно усиливается и отделены от dsDNA просто дозирование из трубки реакции PCR. Амплификация ssDNA может применяться как потенциальные реагенты для microarray ДНК и ДНК-SELEX (систематической эволюции лигандов на экспоненциальное обогащения) процессов.

Введение

Одноцепочечной ДНК (ssDNA) широко рассматривается как элемент молекулярного распознавания (MRE) из-за его внутренние свойства для ДНК-ДНК гибридизации^1,2. Разработка ssDNA синтетических систем может привести к биологических приложений, таких как ДНК microarrays³, oligotherapeutics, диагностика и комплексной молекулярной зондирования на основе взаимодополняющих взаимодействия^4,5.

На сегодняшний день, Микрометр шкала полимерные частицы были успешно продемонстрированы используя microfluidic приборы. Несколько методов microfluidic доказали быть мощным для производства весьма однородной микросфер на непрерывный поток в микроканальные среды^6,7.

В исследовании Lee et al. ⁸, на основе капелька microfluidic платформа для microfluidic синтеза copolymerizable oligo микросферы и ssDNA амплификации было сообщено. Microfluidic платформа состоит из двух слоев PDMS (полидиметилсилоксан): Верхняя часть с microfluidic канала сети для генерации микросфер и дно плоской части. Они состоят из трех видов PDMS аэрогидродинамических каналов: 1) поток канал для поколения капелька, 2) серпантином канал для смешивания двух решений и 3) последовательных полимеризации канал для микросфер затвердевания. После того, как в один канал аэрогидродинамических PDMS вводятся две Несмешивающиеся потоков, потоков может быть принужден через узкие отверстия структуру. Потока поведения, таких как канал геометрии, скорость потока и вязкость влияет на размер и морфология микросфер. Таким образом основной поток жидкости можно подразделить микромасштабной monospheres^9,10.

Здесь подробные микросферы ПЦР протокола предоставляется для амплификации ssDNA. Во-первых описан процесс проектирования устройств на базе капелька microfluidic. Затем объясняется способ, в котором полиакриламида микросферы можно функционализированных с случайных ДНК шаблон на взаимодополняющей основе. Наконец показана микросферы ПЦР протокола для усиления ssDNA.

протокол

1. Изготовление PDMS Microfluidic платформа

1. Подготовка 20 мл жидких PDMS форполимера путем смешивания базового полимера и катализатором в том соотношении 10:1. Залейте 10 мл жидкости PDMS на подготовленной прессформы Су-8 на кремниевой пластины для верхней части microfluidic сети. Для нижней равнинной части Налейте такой же объем жидких PDMS на кремниевой пластины без структуры формы.
   Примечание: Сеть microfluidic разработан в программе CAD и затем преобразуется в фотошаблонов для того, чтобы изготовить мастер, с помощью процесса типичный фотолитографии (см. Дополнительные цифры). Этот мастер состоит из негативного фоторезиста Су-8 плесень на кремниевых пластин¹¹.
2. Место два кремниевых пластин с покрытием с жидким PDMS форполимера на горячей пластине и лечения при 75 ° C за 30 мин.
   1. Вручную слезает вылечить PDMS слой от плесени Су-8. Совместите диаметром 1,5 мм круглые отверстия перфорации инструмент для нефтяной порт в реплицированной microfluidic сети для интерфейсов каналов потока микрон шкала с образцами жидкости макрос. Выбивать через отверстие вручную.
   2. Повторите это штамповка процесс три раза для формирования двух решений и выход порта.
3. Выполните гидрофильные обработка поверхности на верхней и нижней PDMS слои с помощью ручных Корона Протравливатель¹² на несколько секунд на сэмпл.
   1. Стек две плазмы лечение PDMS слои и тепла на 90 ° C за 30 минут с помощью плита для процесса склеивания PDMS-PDMS. Снабжения водой под давлением, с использованием шприцевый насос в три входе портов для Структурное склеивание и утечки тестирование готовых устройства.

2. производство полиакриламида Oligo микросферы

1. Подготовьте шарик смесь, подробно изложены в таблице 1.
2. Вихрь и кратко центрифуги acrydite Стандартный ssDNA помечены зонд (Ap, 100 мкм) и acrylamide:bis (19:1) раствор.
3. Приготовляют раствор я путем смешивания 25 мкл 40% акриламида бис решение, 10 мкл ssDNA (acrydite зонд), 10 мкл буфера 5 x TBE (1,1 М трис; 25 мм ЭДТА, Борат 900 мм) и 5 мкл воды. Готовят раствор II с 50 мкл Персульфат аммония 20%.
4. Подготовить два шприцы индивидуально заполнены раствором решение II и я и смонтировать их на насос, чтобы внедрить решение потоки в microfluidic платформа. Подготовить минерального масла, смешанного с 0,4% TEMED для поверхности затвердевание микросфер.
   Примечание: TEMED известен как стабилизатор свободных радикалов. Свободные радикалы могут ускорить скорость образования полимера с Персульфат аммония (APS) для того, чтобы стимулировать полимеризации акриламида.
5. Заполните стеклянной бутылке с 4 мл минерального масла для создания постоянного потока.
6. Вставьте две трубы для двух портов в Крышка стеклянная бутылка как microfluidic водохранилище: пневматические порт для применения сжатого воздуха в стеклянной бутылке от воздушный компрессор и жидкости порта для подачи под давлением масла микро канала сети из стеклянной бутылке. Соедините трубы между стеклянной бутылки и нефтяной порт в microfluidic устройства.
   1. Подключите трубы к портам два решения в microfluidic устройство для того чтобы поставить два решения от шприца насосов. Вставка трубы выход порта для передачи сгенерированный микросфер в стакан.
7. Установите скорость потока насоса шприца до 0,4 - 0,7 мл/ч. Отрегулируйте давление сжатого воздуха компрессора с помощью регулятора (82-116 кПа). Задайте скорость вращения (500 об/мин) Магнитная мешалка бар в стеклянный стакан на горячей плите. Управлять шприцевый насос и подачи сжатого воздуха, порожденных внешнего компрессора в стеклянной бутылке с помощью элемента управления вкл/выкл электромагнитный клапан¹³.
8. Наблюдать за формирование микросфер в поток упором геометрии и затвердевания сгенерированный микросфер в стеклянный стакан с цифровой микроскоп.
   Примечание: Размер и производство скорость Микросфера зависит от расхода растворов и давление потока минерального масла (таблица 2).

3. выполнение полиакриламида Oligo микросферы графов

1. Горяева количественной оценки взять небольшое количество (около 100 мкл) водный раствор полиакриламида oligo микросферы и место на Горяева стекла и аккуратно заполнить Микросфера подвеска хорошо Счетной палаты.
   Примечание: Для получения более подробной информации, смотрите http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.
2. Использование микроскопа и ручной подсчет счетчик для подсчета микросфер в одном наборе 16 квадратов. Затем переместите Горяева к следующему набору камеры и вести подсчет до тех пор, пока все четыре свода 16 углы отсчитываются.
3. Определить средний микросфер и рассчитать количество микросфер в оригинальные подвески из бисера.
4. Передавать 100 мкл микросфер пробки microcentrifuge 1,5 мл. Удалите супернатант через мягкое центрифугирование (400 x g) и закупорить.

4. выполнение гибридизации ДНК на поверхности полиакриламида Oligomicrosphere

Примечание: Идентичные ДНК зонд с 5'-NH₂-группа вместо 5'-acrytide модификации добавляется в решение, я и испытаны для Ap содержащих микросферы параллельно. ДНК гибридизации результаты показаны на рисунке 2. Cy3-меченых взаимодополняющих олигонуклеотида зонды (Кап) решение должно находиться в темной комнате.

1. Ресуспензируйте Cy3-колпачок с использованием 100 мкл буфера 1xTE (TE буфера: 10 мм трис и 1μM ЭДТА, рН 8,0) для достижения конечной концентрации 100 мкм. Например Ресуспензируйте 1 пмоль Кап в 100 мл TE буфера и передачи microcentrifuge трубки покрыта алюминиевой фольгой.
   Примечание: Для стренги последовательностей, см. таблицу 3.
2. Добавьте 100 мкм Cy3-Кап в стерильных 1,5 мл microcentrifuge трубка, содержащая Ap Сополимеризованная микросфер.
3. Нажмите трубке несколько раз перемешать и инкубировать в темноте за 1 ч при комнатной температуре.
4. Отменить супернатант и удалить остаточные буфера через закупорить.
5. Промойте три раза с 500 мкл буфера TE.
6. Ресуспензируйте микросферы, осторожно нажав пробки microcentrifuge. Затем повторите шаг 4.4.
7. Место микросфер на стеклянное скольжение (75 x 50 мм) и накрыть алюминиевой фольгой до изображений.

5. Асимметричное PCR для усиления ssDNA

1. Подготовьте асимметричной смеси реагентов ПЦР для усиления ssDNA для анализа. Оттепель реагентов в таблице 4 на льду. Не держите энзима полимеразы Taq (50 U/мкл) на льду, но скорее хранить его при-20 ° C до тех пор, пока требуется.
2. Аккуратно водоворот все реагенты и затем кратко центрифуга трубы на 10000 x g 10 s.
3. Объединить все реагенты, как описано в Таблица 4.
4. Поместите образцы в Термоциклер и начать Асимметричное PCR при следующих условиях: 25 циклов (95 ° C за 30 s, 52 ° C за 30 s и 72 ° C для 30 s), 85 ° C за 5 мин, удерживайте при 4 ° C.

6. микросферы-ПЦР для усиления ssDNA

Примечание: Этот раздел описывает протокол для усиления ssDNA в пробке реакции PCR. Микросфера-ПЦР-реакции были исполнены в 50 мкл реакции тома. В таблице 5перечислены подробные последовательностей, используемых для того чтобы усилить ssDNA. В этом случае Ap на поверхности микросферы можно отжига для случайных ДНК шаблоны на взаимодополняющей основе. Это очень важный шаг для производства дополнительных нитей ДНК (антисмысловых стренге дна, рис. 3). Продлен ДНК используется в качестве шаблона для микросфер ПЦР-амплификации.

1. Подготовка смеси реагентов микросферы PCR. Оттепель реагентов в таблице 6 на льду; Однако не держите энзима полимеразы Taq на льду. Храните его при 20 ° C до тех пор, пока требуется.
2. Аккуратно водоворот все реагенты и затем кратко центрифуга трубы на 10000 x g 10 s.
3. Получите примерно ~ 25 микросферы через микроскопические подсчета.
   Примечание: Количество микросфер в одном реакция трубки рассчитываются с использованием световой микроскоп с увеличением 40 X. Около ~ 25 микросферы применяются для микросфер ПЦР-амплификации. Более подробная информация содержится в шаге 3.
4. Объединить все реагенты, как описано в Таблица 6.
5. Поместите образцы в Термоциклер и начать Асимметричное PCR при следующих условиях: 25 циклов (95 ° C за 30 s, 52 ° C за 30 s и 72 ° C для 30 s), 85 ° C за 5 мин, удерживайте при 4 ° C.
6. Следующие амплификации, добавить 8 мкл 6 x загрузки буфера и загрузить 15 мкл каждого образца в 2% агарозном геле. Затем выполните электрофорез на 100 V 35 минут в 1 x TAE (Tris ацетат ЭДТА, 40 мм ацетата Tris, 1 мм ЭДТА, рН 8,2) буфера.

7. confocal микроскопии приобретение

Примечание: Под конфокального микроскопа отражаются результаты микросферы ДНК гибридизации зонда. Анализ изображений осуществляется с помощью ImageJ.

1. Исправьте гибридизированные микросфер на этап микроскопа в держатель.
2. Выберите лазер (гелий/неоновый лазер, 543 Нм линия) и включите его в лазерной управления.
3. Выберите объектива микроскопа управления.
4. Выберите требуемый фильтр для Cy3 и канала в конфигурации управления.
5. Запустите эксперимент и наблюдать за образец. Параметры для confocal микроскопа резюмируются в таблице 7.

Результаты

Готовых полимерных на основе капелька microfluidic платформа состоит из двух слоев PDMS (рис. 1a). Три вида microfluidic канала сети используются для генерации микросферы: 1) потока упором геометрии, как показано на рис. 1b, 2) серпантином канал для смешив?...

Обсуждение

Загрязнители dsDNA являются серьезной проблемой в ssDNA амплификации. Он по-прежнему трудно свести к минимуму dsDNA амплификации в обычных Асимметричное PCR амплификация¹⁵. Кроме того хотя технические усовершенствования для генерации ssDNA позволили нам увеличить эффективность обр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres