Imaging Ca2 + ответы во время инфекции Shigella эпителиальных клеток

Резюме

Здесь мы представляем протоколы визуализировать ответы кальция (Ca^{2 +}), вызвало НеЬа клетки, инфицированные Shigella. Путем оптимизации параметров бактериальной инфекции и изображений с Ca^{2 +} флуоресцентных зондов, характеризуются нетипичных глобальных и местных Ca^{2 +} сигналы вызванных бактериями в большом диапазоне кинетики инфекции.

Аннотация

CA^{2 +} является вездесущий Ион участвует во всех известных клеточных процессах. В то время как глобальные Ca^{2 +} ответы могут повлиять на судьбу клеток, местные вариации концентраций бесплатно Ca^{2 +} цитозольной, связан с освободить от внутренних магазинов или приток через каналы плазматической мембраны, нормализует процессы корковых клеток. Патогенов, придерживаться или вторгнуться принимающей ячейки триггер реорганизации Цитоскелет актина, лежащие в основе хост плазматической мембраны, которая скорее всего влияет как на глобальном, так и на местном Ca^{2 +} сигнализации. Потому, что эти события могут происходить на низких частотах в псевдо-стохастических образом над расширенной кинетики, анализ Ca^{2 +} сигналов, вызванных микроорганизмами, поднимает основные технические проблемы, которые необходимо решить.

Здесь мы приводим протоколы для обнаружения сигналов глобальных и местных Ca^{2 +} после инфекции Shigella эпителиальных клеток. В этих протоколах артефакты, связанные с длительного воздействия и фотоповреждения, связанные с возбуждением Ca^{2 +} флуоресцентных зондов возникновения, строго контролируя параметры приобретения за определенный период времени во время Бактерии Shigella вторжения. Процедуры осуществляются тщательно анализировать амплитуду и частоту сигналов глобальной цитозольной Ca^{2 +} во время расширенной инфекции кинетики, используя химические зонд Fluo-4.

Введение

CA^{2 +} регулирует все известные клеточных процессов, включая цитоскелета реорганизации, воспалительных реакций и пути смерти клетки, связанных с хост возбудитель взаимодействия^1,2,3. В физиологических условиях базальный цитозольной Ca^{2 +} концентрации являются низкими, в сотни Нм диапазона, но может подвергаться переходных увеличивается после стимуляции агонистов. Эти варианты часто показывают колебательной поведение через действие насосов и каналов на мембраны плазмы и эндоплазматического ретикулума. Эти колебания характеризуется период, продолжительность и амплитуды Ca^{2 +} увеличивается и расшифровывается клетками, которые, в свою очередь, вызывают конкретные ответы в то, что известно как Ca^{2 +} код^4,5 . Устойчивый рост в цитозольной Ca^{2 +} концентрации в патологических условиях может привести к смерти клетки, связанные с permeabilization митохондриальных мембран и выпуска pro-apoptotic или некротических факторов^{6, 7}.

Шигеллы, возбудитель бактериальной дизентерии, поражает эпителиальные клетки путем впрыскивать эффекторов в клетки хозяина, с использованием типа III секреторной системы (T3SS)^8,9. Шигеллы вторжения клеток хозяина ассоциируется с местными и глобальными Ca^{2 +} сигналы с T3SS. Что касается порами формирования токсинов, translocon T3SS, который вставляет узел клеточных мембран и требуется для инъекций эффекторов T3SS скорее всего отвечает за активацию PLC и инозитол (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-зависимых Ca^{2 +} релиз. Сочетание локализованных стимуляции PLC и накопление полимеризованной актина на участках в результате вторжения шигеллы в нетипово долгосрочного InsP3-зависимых Ca^{2 +} выпуск¹⁰. Тип III эффекторных IpgD, фосфатидилхолин 4,5 Бисфосфат (PIP2) -4-фосфатазы, ограничивает количество местных PIP2, таким образом контролируя количество доступных субстрат для PLC для создания InsP3, которая способствует сосредоточение местных Ca^{2 +} ответы бактерий вторжения сайтов^11,12. Эти местные Ca^{2 +} ответы могут способствовать актина полимеризации Shigella вторжения сайты¹⁰. Глобальные Ca^{2 +} ответы, которые также вызвало, шигеллы, однако, являются необязательным для процесса бактерий вторжения, но инициировать открытие connexin hemichannels на плазматической мембраны и выпуска АТФ в внеклеточного отсека. Выпущенные СПС, действуя в духе паракринными, в свою очередь, стимулирует Ca^{2 +} колебательных реакций в клетках рядом с инфицированной клетки. IpgD также отвечает за формирование глобальных Ca^{2 +} ответы в неустойчивой изолированных ответов с медленной динамики. В конце концов после длительной бактериальной инфекции, IpgD приводит к ингибированию InsP3-опосредованной Ca^{2 +} сигналов. Через свое вмешательство с Ca^{2 +} сигнализации, IpgD задержки Ca^{2 +}-зависимой calpain активации, ведущих к разборке адгезии координационных структур и преждевременная отслойка инфицированных клеток¹³.

В то время как Ca^{2 +} сигналы участвуют в критические аспекты патогенеза, использования микроорганизма поднимает ряд технических проблем, которые не встречаются в классической агонист исследований. Протоколы, описанные здесь использовать часто используемые флуоресцентные Ca^{2 +} химический индикатор Fluo-4, который мы спроектирован, чтобы характеризовать местных Ca^{2 +} сигналов во время инфекции Shigella . Обсуждаются шаги критических для обнаружения этих сигналов, а также процедуры для их количественного анализа, который необходим для характеризуют роли бактериальной эффекторов в Ca^{2 +} сигнализации.

протокол

1. Подготовка

1. Подготовка бактерий
   1. Пластина бактерии —шигелла одичал тип деформации выражая AfaE адгезина (M90T-AfaE) — на trypticase сои (TCS) агар пластины содержащий 0,01% Конго красный (CR) и инкубировать их в течение 18 часов при 37 ° C.
      Примечание: Для увеличения их воспроизводимость, шигеллы пластины, полученный на шаге 1.1.1 хранятся при температуре 4 ° C и должны использоваться в течение одной недели, потому что все колонии на носителе CR покраснеть в конечном итоге с течением времени.
   2. Прививать TCS бульон до культуры, выбирая 3 красные колонии от тарелки подряд.
      Примечание: Прививки с 3 колоний выполняется ограничить вероятность выбора одного клона, чьи вирулентности плазмида претерпела генетическая рекомбинация.
   3. Растут жидкого бактериальных культур в тряску инкубатор для 16 ч при 37 ° C и 200 об/мин. Добавление ампициллин в конечной концентрации 75 мг/мл. Концентрации антибиотиков не должен превышать 3 x минимальный тормозной концентрации, как избыток антибиотика может привести к потере большого вирулентности плазмиды.
      Примечание: Поддержание плазмида вирулентности Shigella должна проверяться путем покрытия бактериальных культур на CR пластины с соответствующей концентрации антибиотиков. Наличие белых колоний указывает на потерю плазмиды.
   4. Прививать культуру TCS с бактериальной культурой предварительно в разведении 1: 100. Проинкубируйте ее при 37 ° C в тряску инкубатор для 2 ч при 200 об/мин. Убедитесь, что оптическая плотность 600 Нм (OD_600nm) составляет 0,2 - 0,4.
   5. Центрифуга для бактериальной культуры на 2 мин на 13 000 x g при 21 ° C и Ресуспензируйте гранулы в эквивалентный объем EM среды (120 мм NaCl, 7 мм KCl, 1,8 мм CaCl₂, 0,8 мм MgCl₂, глюкозы 5 мм и 25 мм HEPES pH = 7,3).
   6. Разбавить бактериальных подвеска в буфере EM в заключительном ОД_600nm 0.1 и использовать его немедленно или храните его при температуре 21 ° C и использовать его в течение следующих 60 мин.
2. Подготовка клетки
   1. Культура клетки HeLa в среде DMEM с 1 г/Л глюкозы с 10% плода телячьей сыворотки (FCS) и вырастить их при 37 ° C с 10% CO₂. Растут TC-7 вырос в среде DMEM с 4,5 г/Л глюкозы, содержащие 10% FCS и несущественные аминокислот в инкубаторе 37 ° C, содержащие 10% CO₂.
   2. Для ячейки обслуживание, разбить ячейки регулярно, чтобы избежать ингибирование роста контакт связан с вырожденная государств; Это критически важно для высокой Ca^{2 +} зонд загрузки/трансфекции эффективности.
   3. Пластина НеЬа клетки на стерильные 25-мм диаметр круговой coverslips в 6-ну пластины на плотности 3 x 10⁵ клеток/хорошо за день до этого эксперимента для клеток HeLa.
   4. TC-7 клеток trypsinize и подсчитать ячейки. Семя их в 4 x 10⁵ клеток/Ну и инкубировать их 5-7 дней при 37 ° C в 10% CO₂-инкубатор перед эксперименты для поляризации.
      1. Обновление клеток культуры среднего каждый день до дня проведения эксперимента.
         Примечание: Стекло дно диаметром 35-мм одноразовые камеры также могут использоваться как альтернатива coverslips содержащих скважин. Если они используются, контроль температуры с помощью Подогреваемый столик или цель не является достаточным, и палата инкубации термостат установлен на микроскопа не требуется.
3. В день эксперимента, удалите среды и вымыть клетки 3 x с 1 мл Эм среднего на 21 ° C.
4. Тензометрические силоизмерители с 3 мм¹⁴ Fluo-4-ам в буфере EM за 30 мин при 21 ° C.
   Примечание: в то время как Загрузка югу вырожденная НеЬа клетки не вызывает серьезных проблем, Загрузка поляризованные TC-7 клеток часто гетерогенных и недостаточно эффективным. Для этих клеток, мы нашли, что эффективность загрузки усиливается добавлением диспергатор — плюрониевого кислота — в конечной концентрации 0,1% и АБС битор bromosulfophtalein анион транспортер в конечной концентрации 20 мкм до FLUO-4-AM-содержащих EM. Использование ratiometric химические датчики или генетически закодированный ладу зондами, которые требуют двойной приобретение не совместим с скорость приобретения необходимых для изображений местных Ca^{2 +} ответы.
5. Стирать образцы 3 x с EM буфер и далее инкубировать их в 1 мл Эм буфера при 21 ° C для гидролиза остаток утра. Использование Fluo-4 загружен клетки, немедленно или в течение следующих 90 мин (поддерживается при температуре 21 ° C).

2. инфекции и изображения приобретение местных Ca^{2 +} ответы

1. Место coverslip, содержащие Fluo-4 загружен клетки в тепловизионной камеры или стекло дно камеры. Стирать образцы в тепловизионной камере или одноразовые стекло дно камеры 3 x с EM буфер для удаления соединений, потенциально связанные с лизис клеток. Добавьте 1 mL EM буфера.
2. Камеры на сцене Перевернутый флуоресцентным микроскопом отопляемых на 33 ° C.
   Примечание: Эта температура выбирается в качестве компромисса между оптимальной температуры, совместимы с процессом вторжения Shigella и замедление Ca^{2 +} ответы для визуализации местных реакций. Мы используем 63 X погружения нефти цель (NA = 1,25) с фазы контраст кольца.
3. Выберите поле микроскопии и Настройка параметров получения, включая время экспозиции и биннинга если необходимо оптимизировать Fluo-4 флуоресцентного сигнала.
   Примечание: Основные проблемы местных Ca^{2 +} изображений низкой амплитуде и небольшой продолжительности ответов, требующих приобретение по крайней мере каждые 30 г-жа несколько коммерчески доступные задней подсветкой EM-CCD или C-MOS камеры представляют необходимые чувствительность для выявления местных Ca^{2 +} ответы с помощью Fluo-4. Чувствительность обнаружения также является важным вопросом для ограничения фотоповреждения или артефактов, таких как спонтанное ответы, связанные с флуоресцентные возбуждения флуоресценции-4 на высоких частотах. Здесь, на основе LED освещение 470 Нм, с 480 ± 40 Нм полосовой фильтр возбуждения, 505-нм Дихроичный фильтр и 527 ± 30 Нм полосовые выбросов на 5% от его максимальной интенсивности, в сочетании с 1,0 фильтр нейтральной плотности, были использованы для минимизации этих проблем под струей приобретения ограниченной длительности. Регулярно проводился анализ местных Ca^{2 +} сигналов партиями 120 s потоков. В этих условиях низкой освещенности Флюорофор Фотообесцвечивание не наблюдалось в течение 2 мин поток приобретений. Последовательных приобретений на том же образце могут выполняться, условии, что используются различные поля. Как правило поток первого приобретения осуществляется на поле элемента управления в отсутствие стимуляции бактерий для обеспечения отсутствия спонтанного ответов. Если наблюдаются спонтанной реакции, пробы промываются с EM буфера до тех пор, пока нет ответов наблюдаются.
4. Чтобы добавить бактерий в образце, удалите 500 мкл буфера EM из камеры и 500 мкл бактериальных подвески на шаге 1.1.6 готовы получить окончательный ОД_600nm 0,05, с соответствующей осторожностью, чтобы избежать перемещения поля выбранного микроскопии; объемы обеспечить надлежащее смешивание бактерий и равномерное распределение бактерий на образцы клетки.
5. Выполните приобретения на бактериальных сложения. Кроме того выполните приобретения 10 мин после бактериальной Добавление, которое соответствует времени, необходимого для бактерий отложений на клетки в условиях использования. В конце потока приобретения приобрести фазово контрастной изображение выбранного поля для визуализации бактерий, клеток и оборками мембраны, связанные с сайтами бактерий вторжения.
6. Повторите процедуру приобретения как шаг 2.5, интервалы, которые поддаются продолжительность приобретений изображения, файлы сбережений и выбор нового поля, чтобы покрыть весь процесс.
   Примечание: Для шигеллы, мы нашли что приобретение потоков каждые 5 минут за 20 мин, после 10 мин бактериальных седиментации, позволило охватить большинство событий вторжения.
7. В конце процедуры приобретения добавьте конечная концентрация 2 мкм Ca^{2 +} ionophore ionomycin образцов для определения максимальной амплитуды Ca^{2 +} сигналов. Получение изображений каждые 3-5 s до стабилизации сигнала, обычно менее чем за 10 мин.
8. Следовать за путем добавления Ca^{2 +} хелатором EGTA в конечной концентрации 10 мм для определения сигнала флуоресценции в отсутствие Ca^{2 +}. Получение изображений каждые 3-5 s до стабилизации сигнала, обычно менее чем за 10 мин.
   Примечание: Из-за относительно медленной динамики глобального Ca^{2 +} вариации, выполните эти приобретения каждые 3-5 s (не в потоковом режиме), позволяя для Ca^{2 +} изображений на том же микроскопическом поле во время последовательных процедур.

3. анализ

1. Экспресс цитозольной Ca^{2 +} вариации со временем как процент ΔF/Ф₀, где ΔF представляет собой вариации интенсивности средний флуоресценции региона интерес (ROI) и F₀ базовых флуоресценции в же ROI, к которому без соответствующего региона поля лишенный клетки вычитается.
   1. Удалить уровень базальной флуоресценции для каждой ячейки в различных областях, соответствующей исходных уровней; Эти уровни могут недвусмысленно определены из-за низкой частоты и сравнительно короткая продолжительность местной Ca^{2 +} ответы в приобретении данного потока.
      Примечание: Количественно яркие черты ответы на вопросы, относящиеся и патогенных модель учился. Классически различные параметры учитываются для анализа Ca^{2 +} сигналов, включая частоту клеток, показаны локальные или глобальные Ca^{2 +} ответы, а также продолжительность, амплитуду и частоту этих ответов. В случае Shigella и местные реакции еще одним важным аспектом анализа является пространственной ассоциацией ответов с бактерий вторжения сайтов.
2. Для количественного определения процент клеток реагировать, показаны глобальные или локальные ответы, нарисуйте ROIs в клетках, в ряды соответствует вариации интенсивности флуоресценции-4.
   1. Установить строгие параметры для выявления местных Ca^{2 +} ответы, например амплитудой трехкратное выше фона вариации исходных клеток интенсивность средняя флуоресценции или продолжительностью по крайней мере 200 мс, чтобы избежать скоринга ложный положительный.
      Примечание: Как правило, даже небольшие местные Ca^{2 +} ответы можно отличить от любого фонового шума в их профиле. ROIs должно быть достаточно большим, чтобы интегрировать сигналы достаточно флуоресценции для выявления местных вариаций. В зависимости от интенсивности флуоресценции-4 обнаружения эти ROIs могут соответствовать круги диаметром от 2-5 мм.
   2. Измерьте изменения средней интенсивности флуоресценции Fluo-4 в 2 регионах в различные области той же ячейке, чтобы определить, являются ли ответы локальные или глобальные.
      Примечание: Анализ большого числа клеток облегчается использование изображений программное обеспечение, позволяющие он-лайн экран вариации интенсивности средний флуоресценции со временем для отдельных регионов. Коммерчески доступных изображений программное обеспечение имеет такую возможность, но это может также производиться с использованием Icy freeware, используя плагин ROI интенсивности эволюции .
   3. Определите процент клеток, показаны местных реакций.
      Примечание: Этот процент вычисляется исходя из общего числа клеток, анализа в микроскопии поле, которое должно быть в достаточном количестве для поддержки статистически значение с использованием непараметрических тестов.
   4. Определите продолжительность местных реакций.
      Примечание: Местные Ca^{2 +} ответы можно далее выделить по диапазонам продолжительность (то есть, менее чем 500 мс, между 5 и 10 s, или выше 10 s) и их связь с шигеллезом вторжения сайтов.
3. Количественно амплитуда ответов. Во-первых калибровки максимальная Ca^{2 +} и ячейки фоновых уровней определяется как шаг 2.1.7. Поскольку нагрузка Fluo-4 могут отличаться для каждой ячейки, выполните эти решения для отдельных ячеек в области.
   1. Экспресс амплитуда ответов как относительный процент максимальной реакции.
   2. Проверка статистических с помощью теста нормальной жизни, следуют параметрические испытания для анализа потенциальных различий между выборками в амплитуде ответов.
   3. Определите ассоциацию этих ответов относительно бактерий вторжения сайты, их соответствующих локализации для оборки индуцированного бактериальной мембраны, визуализируется в соответствующей фазе контрастность изображения.

Результаты

Шигеллы вторжения ассоциируется с нетипичным долгосрочные местные Ca^{2 +} ответы:

После протокол, упомянутых выше Fluo-4-загружен НеЬа клетки были оспорены с WT Shigella и поток приобретений были исполнены анализировать сигналы Ca

Обсуждение

Эта рукопись описывает протокол, который мы спроектирован, чтобы следовать местные Ca^{2 +} сигналов в течение относительно короткого кинетика Shigella вторжения, а также глобальные Ca^{2 +} ответы во время расширенной кинетика Shigella. Ниже ключ можно найти проблемы, которые необ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin