JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы показываем три методы приготовления различных тканей для визуализации иммуногистохимических сетчатки микрососудистой pericytes крыса, т.е., крио секций, всего монтирует и гипотонической изоляции сосудистой сети.

Аннотация

Сетчатки pericytes играют важную роль во многих заболеваний глаза. Иммуногистохимическое окрашивание методы сосудов сетчатки и микрососудистой pericytes являются центральными для офтальмологических исследований. Важно выбрать подходящий метод визуализации микрососудистой pericytes. Мы описываем сетчатки микрососудистой перицит иммуногистохимическое окрашивание в крио секции, всего кронштейны и гипотонической изолированных сосудистую, с использованием антител для тромбоцитарный фактор роста рецепторов β (PDGFRβ) и нерва/глиальных антигена 2 (NG2). Это позволяет нам подчеркнуть преимущества и недостатки каждого из трех ткани препаратов для визуализации сетчатки микрососудистой pericytes. Крио разделы обеспечивают transsectional визуализация всех слоев сетчатки, но содержат только несколько иногда поперечные срезы microvasculature. Целом гора обеспечивает обзор всей сетчатки сосудистую, но визуализация microvasculature может быть хлопотно. Гипотонический изоляции обеспечивает метод визуализировать всю сосудистую сетчатки, удаление нейрональных клеток, но это делает ткани очень хрупкие.

Введение

Сетчатки pericytes находятся в центре внимания многих научно-исследовательских лабораторий, как эти клетки играют важную роль в целостности сосудистую. Патологических состояний, таких как диабетическая ретинопатия1, ишемия2и глаукомы3 имеют сосудистой характеристики, которые включают функцию pericytes. Pericytes находятся в внутренний сетчатки капиллярной сплетения. Центральной артерии сетчатки, которая поставляет внутреннюю сетчатки разветвляется на два слоя капиллярного сплетений. Внутренняя сосудистого русла находится между клеток ганглия и внутренние ядерного слои. Глубокий слой более плотным и сложных и локализуется между внутренней и наружной ядерных слои4,5. Кроме того некоторые части сетчатки также содержат третья сеть называется радиальной parapapillary капилляров. Эти длинные, прямые капилляров, которые лежат среди нервных волокон и редко анастомозируют с друг с другом или другие два сплетения6. В стенке капилляров pericytes встраиваются в базальной мембраны и линии с abluminal стороны сосудистой эндотелиальных клеток.

К этой дате существует не уникальный биологический маркер эти pericytes, которые могут дифференцировать их от других сосудистых клеток. Часто используемых маркеров, которые представляют на pericytes, но и другие сосудистые клетки тромбоцитарный фактор роста рецепторов β (PDGFRβ) и нерва/глиальных антигена 2 (NG2). Выявление pericytes еще больше осложняется существование перицит подмножеств, которые различаются по морфологии и белка выражение7. В настоящее время лучшие идентификации опирается на комбинацию белковых маркеров и характерным позиционирования перицит в сосудистой стенке. Мы демонстрируем здесь три методы приготовления различных тканей для иммуногистохимическое окрашивание PDGFRβ/NG2 сетчатки микрососудистой pericytes крыса, т.е., крио секций, всего монтирует и гипотонической изоляции сосудистой сети.

С крио секции сетчатки и склера прорваться через зрительный нерв. Это позволяет для визуализации всех слоистых структур нейронов. Собственный десяти слоев сетчатки являются очевидными как Перепутывание ядерного и аксональной/дендритных структуры, которые могут быть визуализированы с пятнами как гематоксилином/эозином или флуоресцентные ядерной 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. Метаболические требования отличаются между слоями9 и он предоставляет метод для определения толщины или полное отсутствие конкретного слоя (например, потеря клеток сетчатки ганглия является одной из отличительных особенностей сетчатки ишемии10, 11). Сосудистую очевиден, как поперечный прорезает сетчатки, что делает его возможным отдельно изучить капиллярного сплетения в соответствующих слоях сетчатки12,13.

Традиционно в целом сетчатки-монтирует проводятся исследования сетчатки сосудистую сеть. С подготовкой этой ткани Сетчатка вырезать и уплощенная как цветок shaped структуры. Метод представляет собой метод подготовки сравнительно быстро ткани, который можно выделить общую архитектуру сетчатки сосудистую и поэтому он часто применяется в расследовании неоваскуляризация в мышиных сетчатки. Успешной визуализации microvasculature в целом монтируется сетчатки также сообщается в развивающихся неонатальной мыши и крысы сетчатки14,,1516,17,18, 19. Эти исследования выявили более определенным pericytic активности с больших капиллярно свободно OBLASTей в взрослого, по сравнению с новорожденным сетчатки14.

Еще один способ визуализации является microvasculature сетчатки после гипотонический изоляции. Этот метод подготовки ткани приводит к сетчатки кровеносных сосудов и капилляров, освобождается нейрональных клеток. Этот тип двумерных изображений изолированной сетчатки сосудистой сети обычно выполняется после переваривания трипсином сетчатки20 и использованы для оценки сосудистые аномалии диабетической ретинопатии, включая потерю перицит и капиллярные 20,дегенерация21,22. Гипотонический изоляции метод предлагает расследования сетчатки сосудистого генов и белков регулирования ответы, как они было сделано с RT-PCR и западных blotting23,24,25. Здесь мы предоставляем протокол для свободно плавать иммуногистохимическое окрашивание гипотонический изолированных сетчатки сосудистую как альтернатива Пищеварение трипсина для изучения микрососудистой pericytes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Протокол был оптимизирован и продемонстрировал на мужских особей взрослых белых крыс. Во всех экспериментальных процедурах согласно регламенту в операторе Арво для использования животных в глазной и видение исследований относились животных. Животные были умерщвлены двуокиси углерода и последующих шейки матки дислокации.

1. крыса ткани сетчатки препараты

  1. Крио Секция
    1. Сделайте задний и передний ~0.5 см прорези в веко крыс с помощью скальпеля.
      1. Дополнительно: Использование диатермии горелки, Марк глаз на внутренний угол для того чтобы ориентироваться в глаза в едином моды во время внедрения и позволяют для разрезания вертикальных криостата через зрительный нерв.
    2. Схватить глаз с щипцами и тщательно наклон в сторону, чтобы разоблачить окружающие ткани. Enucleate глаза, распилы Рассечение ножницами в мышечной и соединительной ткани.
      Предупреждение: Не тянуть глаза слишком трудно, как чрезмерное давление на зрительного нерва может вызвать отслоение сетчатки.
    3. Коротко говоря глаз в 4% формальдегида в фосфат амортизированное saline (PBS) для стабилизации до принятия первоначального отверстие в лимба роговицы, применяя давления света с кончика скальпель.
    4. Под микроскопом, разрезать вдоль лимба роговицы с Рассечение ножницами удалить роговицы и удалить объектив с щипцами перед погружаясь в 4% формальдегида в PBS для 2 – 4 ч.
    5. Промыть последовательно, в Sörensen и фосфатного буфера с 10%-ая сахароза и 25%-ая сахароза.
    6. Внедрите в Yazulla среде, подготовленный с 3% желатина из свиной кожи и 30% альбумина с куриное яйцо белого.
      Примечание: Протокол может быть здесь приостановлена с ткани хранения при температуре-20 ° C.
  2. Целом гора
    1. Сделайте разрезы см задний и передний ~0.5 в веко крыс с помощью скальпеля.
    2. Схватить глаз с щипцами и тщательно наклон в сторону, чтобы разоблачить окружающие ткани. Enucleate глаза, распилы Рассечение ножницами в мышечной и соединительной ткани.
      Предупреждение: Не тянуть глаза слишком трудно, как чрезмерное давление на зрительного нерва может вызвать отслоение сетчатки.
    3. Коротко говоря глаз в 4% формальдегида в PBS для стабилизации до принятия первоначального отверстие в лимба роговицы, применяя давления света с кончика скальпель.
    4. Под микроскопом разрезать вдоль лимба роговицы Рассечение ножницами удалить роговицы и удалить объектив с щипцами.
    5. Отделяйте сетчатки от сетчатки пигментного эпителия к зрительному нерву с щипцами, используя небольшое отверстие движения, чтобы избежать крупных разрывов.
    6. Бесплатный сетчатки в зрительном нерве Рассечение ножницами и сделать четыре прорези несколько миллиметров длиной от периферии сетчатки к голове зрительного нерва.
    7. Распространения сетчатки на слайд стекла и разрешена сушка для 5 – 10 мин.
    8. Исправьте в 4% формальдегида для 20-30 мин, капает формальдегида на сетчатку.
      Предупреждение: Не применяется непосредственно на сетчатке, как он может отсоединиться от стекла.
    9. Промойте с PBS. Для получения оптимальных результатов, иммуно пятно сразу после полоскания.
  3. Гипотонический изоляции
    1. Сделайте разрезы см задний и передний ~0.5 в веко крыс с помощью скальпеля.
    2. Схватить глаз с щипцами и тщательно наклон в сторону, чтобы разоблачить окружающие ткани. Enucleate глаза, распилы Рассечение ножницами в мышечной и соединительной ткани.
      Предупреждение: Не тянуть глаза слишком трудно, как чрезмерное давление на зрительного нерва может вызвать отслоение сетчатки.
    3. Сделайте первоначальный отверстие в лимба роговицы, применяя давления света с кончика скальпель.
    4. Под микроскопом разрезать вдоль лимба роговицы Рассечение ножницами удалить роговицы и удалить объектив с щипцами.
    5. Отделяйте сетчатки от сетчатки пигментного эпителия к голове зрительного нерва с щипцами, используя небольшое отверстие движения, чтобы избежать крупных разрывов.
    6. Бесплатный сетчатки в зрительном нерве Рассечение ножницами, место сетчатки в 1 мл деионизованной воды в пластине 24-Ну и погрозит 200 об/мин с орбитой вибрации 1,5 мм на 1 ч при комнатной температуре.
      Примечание: Далее, сетчатки появится менее определены на краях.
    7. Добавьте 200 DNAse U 1 отмежеваться лизированных ячейки мусор от сетчатки сосудистую и встряхнуть для еще 30 минут при комнатной температуре.
      Примечание: Мусора может начать форме в скважинах.
    8. Промывайте минимум 3 раза в дейонизированной воде 5 минут с встряхивания на 150 – 300 об/мин для удаления мусора нейрональных клеток. Сетчатки должна стать более транспарентной, с каждого полоскания свидетельствует о удаление нейронов сотовой мусора.
      1. В пластину 24-ну ясно видеть просвечивающий изолированных сетчатки сосудистую используйте темный фон.
      2. (Необязательно): Если сосудистую не появляются бесплатно нейрональных слоёв (полупрозрачным) на данный момент либо добавить больше промойте шаги, увеличить скорость встряхивания или используйте пипетки для аспирационная жидкость на сосудистую.
        ВНИМАНИЕ: Любой из дополнительных шагов может повредить сосудистую.
    9. Fix 10 мин в 1 мл 4% параформальдегида в PBS при комнатной температуре и промывки 3 раза в PBS.
      Примечание: Протокол может быть здесь приостановлена с хранения тканей при 4 ° C.

2. иммуногистохимии

  1. Пятнать крио-секций
    1. Вырезать 10 мкм крио секций желатин встроенный сетчатки как вертикальное секционирование через зрительный нерв и место крио разделы на стекло и высушить (минимум 1 час).
    2. Погрузите слайд стекла в PBS с 0,25% Тритон X-100 (PBS-T) за 15 мин.
    3. Капельно 1: 100 PDGFRβ и первичных антител 1: 500 NG2 разводят в PBS-T + 1% BSA на крио секции и инкубировать в камерах инкубации при температуре 4 ° C на ночь.
    4. Погрузите слайд стекла 2 раза в PBS-T 15 мин и капать масштаба 1: 100 анти Alexa Fluor 594-связаны и 1: 100 анти кролик FITC-связанные вторичные антитела мыши разводят в PBS-T с 3% BSA на крио секций.
    5. Инкубируйте стеклянное скольжение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
    6. Промойте стекло слайд в PBS-T 2 x 15 мин.
      Примечание: Необязательно: для двух- и трехместные immunofluorescent окрашивание, последовательные окрашивания могут быть выполнены, повторив процедуру от 2.1.3 2.1.6 два и три раза, соответственно.
    7. Крепление окрашенных крио секции с анти выцветанию монтажа средних содержащие DAPI и coverslip.
  2. Окрашивание в целом гора
    1. Стекать PBS-T на целом гора и инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
    2. Слить и капельно 1: 100 PDGFRβ и первичных антител 1: 500 NG2 разводят в PBS-T + 1% BSA и инкубировать в влажные камерах при температуре 4 ° C на ночь.
    3. Слить и капать на PBS-T для ополаскивания стеклянных слайд в 2 x 15 мин.
    4. Слить и капать по 1: 100 анти кролик Cy2 - и 1: 100 анти мыши связанный с Cy3 вторичное антитело разводят в PBS-T с BSA 3% для инкубировать 1 час во влажной камере при комнатной температуре в темноте.
    5. Слить и капать на PBS-T для полоскания в 2 x 15 мин в темноте.
      Примечание: Необязательно: для двух- и трехместные immunofluorescent окрашивание, последовательные окрашивания могут быть выполнены, повторив процедуру от 2.2.2 2.2.5 два и три раза, соответственно.
    6. Крепление окрашенных целом гора с анти выцветанию монтажа средних содержащие DAPI и coverslip.
  3. Окрашивание гипотонический изолированных сосудистую
    1. Блокировать гипотонический изолированных сосудистую 1 час с встряхивания на 100 об/мин и комнатной температуре с 500 мкл/хорошо 10% сыворотки осла разводят в PBS.
    2. Инкубируйте на ночь при комнатной температуре и погрозит 100 об/мин с 600 мкл/хорошо 1 PDGFRβ: 100 и 1: 500 первичных антител NG2 разводят в 10% осла сыворотки в PBS.
    3. Промыть сетчатки сети 3 x 5 мин в PBS и инкубировать в масштаба 1: 100 анти Alexa Fluor 594-связаны и 1: 100 анти кролик FITC-связанные вторичные антитела мыши разводят в 10% сыворотки осел в PBS тряску при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте 100 об/мин.
    4. Промыть в PBS-T 5 мин и инкубировать в 0.2 нг/мл DAPI в PBS-T 15 мин, следуют полосканий 3 x 5 мин в PBS-T в темноте.
    5. Вырезать кончик пластиковой Pasteur накапайте, смачивают PBS-T и использовать его для передачи сетчатки сети к слайду камеры 4-ну стекла.
      Примечание: Увлажнением шаг имеет важное значение для избежания сетчатки сосудистую, придерживаясь внутри Pasteur накапайте.
    6. Разворачиваться сетчатки сосудистую. Не прикасайтесь сетчатки сосудистую пинцетом, как это может вызвать сосудистую в клубок.
      Примечание: Разворачивается может быть сделано путем наклона камеры слайд взад и вперед или аспирационных капель жидкости на сосудистую сетчатки.
    7. Удалите носитель из скважин. Поверхностное натяжение жидкости будет выравниваться сосудистую на нижней части слайда.
    8. Обеспечить правильное разворачивается под микроскопом, прежде чем удаление пластиковых колодцев от камеры слайд.
    9. Смонтируйте окрашенных сосудистую с анти выцветанию монтажа средних и coverslip.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Успешный протоколы обеспечивают три различных препаратов сетчатки для визуализации микрососудистой pericytes. Каждый из этих методов использует PDGFRβ и NG2 иммунореактивности со локализации и уникальное положение pericytes, обернуть вокруг foridentification эндотелия капилляров.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы представляем три сетчатки подготовка техники, которые могут быть применены в исследовании микрососудистой pericytes сетчатки. Ниже мы предлагаем сравнение между каждым из методов и выделить важные шаги в протоколах.

С крио секционирование, сетчатки режется в сагиттально...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Исследование финансировалось Lundbeck фонд, Дания.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Geletin from porcine skinSigma-AldrichG2625-500G
Albumin from chicken egg whiteSigma-AldrichA5253-500G
Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreasSigma-AldrichD5025-15KUDissolved in 0.15 M NaCl
Bovine serum albumin (BSA)VWR0332-100G
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121, lot 129348
Rabbit anti-PDGFRβSanta Cruzsc-4321:100
Mouse anti-NG2Abcamab500091:500
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-585-1521:100
Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-095-1511:100
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-225-1521:100
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-165-1501:100
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542-1MGDissolved in DMSO
Anti-fading mounting mediumVector LaboratoriesH-1000
Anti-fading mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slideThermo Fisher Scientific154526

Ссылки

  1. Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
  2. Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
  3. Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20(2016).
  4. Ramos, D., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. Lagali, N. , InTech. (2013).
  5. Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
  6. Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
  7. Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte? Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
  8. Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
  9. Yu, D. -Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
  10. Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
  11. Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
  12. Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
  13. Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
  14. Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
  15. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. , e50546(2013).
  16. Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296(2017).
  17. Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
  18. Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
  19. Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
  20. Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. , e50489(2013).
  21. Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
  22. Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
  23. Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
  24. Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
  25. Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699(2010).
  26. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
  27. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

140PDGFRNG2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены