Одноклеточных Quantitation мРНК и поверхности белков в инфицированных Обезьяний вирус иммунодефицита CD4+ T клетки изолированы от макак резус

Резюме

Описал представляет собой методологию для quantitate экспрессии генов, 96 и 18 поверхностных белков в одиночных клетках ex vivo, позволяя для идентификации дифференциально выразил генов и белков в инфицированных вирусом клеток по отношению к неинфицированных клеток. Мы применяем подход к изучению SIV-инфицированных CD4⁺ T клетки изолированы от макак резус.

Аннотация

Сингл элементный анализ является важным инструментом для рассечения гетерогенной популяции клеток. Выявление и изоляция редких клеток может быть затруднено. Для решения этой задачи, методология сочетания индексируются проточной цитометрии и высок объём мультиплексированных количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) была разработана. Цель заключалась в выявлении и характеризуют обезьяний иммунодефицита (СИВ)-инфицированные клетки присутствуют в пределах макак резус. Через количественный поверхностных белков путем активации флуоресценции клеток сортируя (FACS) и мРНК, ПЦР инфицированные вирусом клетки определяются выражением вирусных генов, который в сочетании с принимающей генов и белков измерений для создания многомерных профиля . Мы называем подход, целенаправленных одноклеточных Proteo-transcriptional оценки или tSCEPTRE. Для выполнения метода, жизнеспособных клеток запятнаны с флуоресцентных антител специфических для поверхностных маркеров, используемых для изоляции СУИМ подмножества ячеек и/или течению фенотипического анализа. Отдельные ячейки сортируются после немедленного лизиса, мультиплекс обратная транскрипция (RT), предварительно амплификации PCR и ПЦР высокую пропускную способность до 96 стенограмм. СУИМ измерений записываются во время сортировки и впоследствии связан с данными выражения гена хорошо позиции для создания комбинированного белка и транскрипционный анализ профиля. Для изучения SIV-инфицированных клеток непосредственно ex vivo, клетки были определены ПЦР обнаружение нескольких видов вирусной РНК. Сочетание вирусных стенограммы и количество каждого обеспечивают основу для классификации клеток в различных стадиях вирусный жизненного цикла (например, производственной и непроизводственной). Кроме того tSCEPTRE SIV⁺ клеток были по сравнению с неинфицированных клеток, изолированные от же образца для оценки дифференциально выраженной хост генов и белков. Результаты анализа показали ранее непонятыми вирусной РНК выражение гетерогенность среди инфицированных клеток, а также в естественных условиях регулирования SIV-опосредованной post-transcriptional гена с одной ячейкой резолюции. Метод tSCEPTRE является актуальной для анализа любой популяции клеток, поддаются идентификации выражением поверхности белка marker(s), принимающих или патогена gene(s) или их комбинации.

Введение

Многих внутриклеточных возбудителей полагаются на принимающей ячейки механизма репликации, часто изменяя хост клеточной биологии или ориентация весьма специфические субпопуляции клеток хозяина, чтобы максимизировать шансы распространения. В результате биологические процессы клеток обычно разрушаются, пагубные последствия для общего состояния здоровья хоста. Понимание взаимодействий между вирусами и клеток хозяина, в которых они повторить будет выяснить механизмы заболеваний, которые могут помочь в разработке улучшения лечения и стратегий для предотвращения инфекции. Прямые аналитические инструменты, которые позволяют изучение взаимодействия хост возбудитель важное значение этой цели. Сингл элементный анализ обеспечивает единственным средством однозначно отнести клеточном фенотипу в частности генотип, или инфекции статус¹. К примеру патогенных инфекций часто вызывают прямые и косвенные изменения в клетки хозяина. Таким образом, различие инфицированных клеток от их неинфицированных партнеров необходимо для изменения атрибутов принимающей ячейки прямой инфекции или вторичные эффекты, такие как обобщенные воспаления. Кроме того для многих патогенов, таких как Сив и вирусам иммунодефицита человека (ВИЧ), принимающей ячейки инфекции проходит через несколько этапов, таких как рано, поздно, или скрытая, каждый из которых может характеризоваться отдельных генов и белков выражение профили^{2 , 3 , 4 , 5}. анализ сыпучих смесей клеток удастся захватить это неоднородность⁶. Напротив, весьма мультиплексированных одноклеточных анализирует возможность количественно оценить выражение как вирусный и принимающих гены предлагают средства для устранения инфекции конкретных клеточных возмущений, включая вариации через стадии инфекции. Кроме того анализ взаимодействия хост возбудителя в физиологически соответствующие параметры имеет решающее значение для выявления событий, которые происходят в зараженных организмов. Таким образом методы, которые могут быть применены непосредственно ex vivo , скорее всего, в лучший захват в естественных условиях процессы.

Сив и ВИЧ целевых CD4⁺ T клетки, в которых они противодействовать хост противовирусное «ограничение» факторы и помощью антиген представляющих молекул по созданию продуктивной инфекции и избежать иммунной наблюдения^{7,8, 9,10,11}. Без лечения, инфекция приводит к массовой гибели CD4 клеток⁺ T, в конечном итоге кульминацией приобретенного иммунодефицита (СПИД)¹². В параметре антиретровирусной терапии, скрытно инфицированной клетки водохранилищ сохраняются на протяжении десятилетий, что создает серьезное препятствие для лечебной стратегиями. Понимание свойств в vivo ВИЧ/SIV-инфицированных клеток имеет потенциал раскрыть принимающей ячейки особенности важную роль в патогенезе и настойчивость. Однако это весьма сложным, прежде всего благодаря low frequency инфицированных клеток и нехватка реагентов возможность легко идентифицировать их. Клетки, которые транскрибировать вирусной РНК, оцениваются присутствовать на 0,01 – 1% CD4⁺ T-клеток в крови и лимфоидной ткани^13,14,15. При подавляющей терапии скрытно инфицированные клетки даже реже, 10^-3– 10^{-7 16,17,18}. Вирусных белков пятнать assays, что хорошо работать для изучения в пробирке инфекций, таких как внутриклеточных кляп, субоптимальный вследствие окрашивания фона 0,01 – 0,1%, аналогичные или больше, чем частота инфицированных клеток^{13, 14}. Пятнать поверхности для Env протеина используя хорошо изученных SIV ВИЧ/Env-моноклональные антитела также было доказано быть трудно, вероятно, по тем же причинам. Недавно, Роман инструменты призваны улучшить обнаружение клеток, выражая кляп, либо включения assays для кляп РНК или с помощью альтернативных изображений технологий^14,15,19. Однако такие подходы по-прежнему ограничены в число количественных измерений выполняется для каждой ячейки.

Здесь мы описываем методологии (1) идентифицирует отдельные инфицированные вирусом клетки непосредственно ex vivo чувствительных и конкретных вирусных генов Количественная ПЦР и (2) количественное выражение до 18 поверхностных белков и 96 генов для каждого инфицированных (и неинфицированным) клеток. Эта методология сочетает поверхности белка одноклеточных измерение СУИМ, следуют лизис немедленного клеток и с помощью анализа выражения гена мультиплексированных целевых ПЦР на системе Biomark. Микросхема аэрогидродинамических (МФК) технология позволяет мультиплексированных количественный генов 96 из 96 образцов одновременно, проделанную матрицу 9216 камер, в которых выполняются отдельные ПЦР-реакции. Живой клетки СУИМ Сортировка записей высоким содержанием белка изобилие измерений при сохранении всей транскриптом для анализа сразу же вниз по течению. Для выявления инфицированных вирусом клеток, конкретных анализов для вирусной РНК альтернативно сращивания и unspliced (vRNA), включены в анализ ПЦР, вместе с группой определяемых пользователем анализов, на общую сумму до 96 генов, максимальное количество анализов, в настоящее время размещены в МФК. Экспрессия генов и белков информацию, собранную для каждой ячейки связаны также позиции. Мы сообщалось ранее результаты этого анализа других²⁰. Здесь, мы предоставляем более подробные методологические руководящие принципы, а также дополнительные описательные фенотипирование SIV-инфицированных CD4⁺ T клетки.

Этот подход, который мы называем tSCEPTRE, могут применяться к суспензии любых жизнеспособных клеток населения реактивной дневно обозначенные антитела и выражая транскриптом совместим с доступных ПЦР-анализов. Например она может использоваться для характеристики дифференциальных генов и белков в редких ячейки или ячейки, не легко отличают поверхности белка маркеров. Подготовка образца опирается на стандарт пятнать протокола с использованием коммерчески доступных антител. Цитофлуориметрами с возможностью сортировки одноклеточных коммерчески доступны, но биобезопасности дополнительные меры предосторожности, необходимые для обработки инфекционных живых клеток. Запись одноклеточного белка выражение профиль для каждой ячейки по позиции, а также упомянутые в настоящем документе как индексированных сортировки, является общей чертой всех коммерчески доступных СУИМ, сортировка программного обеспечения. Вычислительный анализ генов дифференциально выраженной хост среди популяции клеток интерес не описано здесь, но ссылки предоставляются для опубликованных ранее методов.

протокол

Примечание: Схема протокола рабочего процесса показан на рисунке 1. Он состоит из трех основных этапов: СУИМ, RT и предварительно амплификация cDNA и ПЦР для до 96 генов одновременно. Две версии протокола, сортировка клеток в ограничении разведений и сортировка единичных клеток, описаны более подробно в шаге 5 и 6, соответственно. Эти стратегии различные исследовательские вопросы, но следовать аналогичным процедурам.

1. предварительные или предварительного анализа

1. Проверка всех анализов выражение гена использоваться как описано⁶.
   Примечание: Этот шаг делается заблаговременно эксперимент. Проверка всех анализов, коммерческих и пользовательских, необходимые для обеспечения эффективного и линейные усилители соответствующих РНК до уровня одной ячейки. Многие коммерчески доступных и пользовательских анализов не отвечают этим требованиям. Обработка и автоматизированного построения кривой для одновременного квалификации выражение анализов до 96 генов предоставляются в Дополнительного кодирования файлов 1 – 5, но отдельные анализы могут быть квалифицированы с помощью R² и наклон линейной fit. Представитель успешные и неудачные пробы квалификации участков приведены на рисунке 2.
2. Разработка потока гранулярных группа антител к запятнать клетки поверхностных маркеров, представляющих интерес.
   1. Титруйте антитела путем пятнать соответствующий образец, например, резус периферической крови мононуклеаров (получения), с каждого антитела. Начать с 20 мкл антител на тест в 100 мкл пятнать реакции и создание восьми серийных разведений два раза. Определите оптимальную концентрацию, обладающая максимальной пятнать интенсивности при сохранении четкое разделение между населением негативные и позитивные.
   2. Оцените, комбинированные окрашивания на представленном(ых) дополнительные ячейки, используя смесь всех антител в оптимальной концентрации, определенный на шаге 1.2.1. Убедитесь, что окрашивание близка к соотношению для отдельных антител пятна. Если окрашивание меньше, чем то, что наблюдается, когда любой антитела был использован в изоляции, рассмотрите альтернативные флюрохром конъюгатов для замены таких антител.

2. ген выражение анализа подготовка

1. Комбинат 96 экспрессии генов assays в РНКазы/DNase бесплатно 1-15 мл (размер может варьироваться с количество сортировка пластин). Группа анализов, используемые в данном исследовании указывается в таблице 1 и таблице 2. Полученный материал называется «Assay микс». Добавить калибровочных в конечной концентрации 180 Нм праймеров вперед и назад. Добавьте буфер подвески ДНК для достижения соответствующей разбавления смеси Assay.
   Примечание: Для практических целей, пользовательские (пользователя генерируемые) пробирного запасы могут быть готовы на 18 мкм согласовываться с концентрацией коммерчески доступных «x 20» ген выражение ПЦР анализов (Таблица материалов). 18 мкм смеси пользовательских прямого и обратного грунтовка для каждого гена, сделаны из запасов решений в буфере подвески ДНК. Коммерчески доступных анализов (Таблица материалов) также включают датчики, но зонды не требуются для RT или предварительно амплификация cDNA и может таким образом быть опущен для пользовательских анализов. Рекомендуется включать один или более уборка генов для использования контроля качества для оценки эффективности сортировки, восстановления клеток и синтез cDNA. Использование случайных праймеров для создания cDNA не была определена, но, как ожидается, будет менее эффективным, чем гена специфические праймеры.
2. Подготовьте 2 x пробирного пластины для использования на этапе 7.1 (мультиплексной ПЦР). Для каждого массива чип 96 x 96, предполагалось Пипетка 6 мкл калибровочных в каждый места для хорошо из 96-луночных ПЦР-планшете. Например для 5 фишек, 30 мкл калибровочных будет занимать один колодец в 96-луночных пластины. При использовании 96 анализов, каждый хорошо 96-луночных пластины будет содержать assay. Уплотнение пластину с клеевой прокладкой.
   Примечание: В идеале, 2.1 и 2.2 выполняются действия одновременно, чтобы избежать нескольких циклов замораживания оттаивания для анализов выражения гена. Все гены в пластину пробирного должны также были в Assay Mix (шаг 2.1). Сочетание пробирного и пробирного пластина может храниться при-20 ° C или 4 ° C для долгосрочного или краткосрочного использования, соответственно.

3. поверхностные пятна жизнеспособных клеток

Примечание: Внутриклеточный пятнать, permeabilization и фиксация не совместимы с помощью этого метода как они компромисс РНК.

1. Подготовьте образцы компенсации путем добавления каждого антитела, перечисленных в Таблица материалов до 40 мкл компенсации бусины в 2,5 раза более высокой концентрации, чем используется для окрашивания клеток. Проинкубируйте втечение 20 мин при 25 ° C, защищать от света. Добавить 3 мл PBS бусы и центрифуги на 500 x g 3 мин при 25 ° C. Аспирационная PBS и Ресуспензируйте бисер в ~ 300 мкл PBS.
2. Подготовьте потока гранулярных клеток сортировщик для обработки образца: получить компенсацию трубы, создание матрицы компенсации и применять матрицы на приобретение файлы для экспериментальных образцов.
3. Подготовка мастер смесь флуоресцентные антитела коктейль, объединяя соответствующие объем каждого антитела, как указано в Таблице материалов, в 1,5 мл янтаря трубки для всех образцов быть запятнано. Вортекс и центрифуги коктейль в 21000 х g на 2 мин при 25 ° C для пеллет антитела агрегатов.
   Примечание: Антитела, используемые здесь перечислены в Таблице материалов.
4. Криоконсервированных клеток в ванну воды 37 ° C на 2 мин добавить 0,5-2 мл суспензии клеток до 12 мл PBS в 15 мл трубку, центрифуги на 500 x g 3 мин при 25 ° C, оттепель и аспирационная PBS. Ресуспензируйте в 3 мл PBS и передачи в 5 мл трубку из полистирола. Центрифуга как выше и аспирационная PBS, оставляя ~ 20 мкл остаточного PBS.
   Примечание: Окрашивание температура может быть адаптирована к теплее или холоднее температуры, необходимые для конкретных приложений, изменив антитела титрования, окрашивание условий соответственно (см. шаг 1.2).
5. Ресуспензируйте до 2 x 10⁷ промывают клетки в 80 мкл антител коктейль и проинкубируйте втечение 20 мин при 25 ° C, защищать от света. Для проб, превышающих 2 x 10⁷ клеток, увеличьте окрашивание реакции соответственно для поддержания < 2 x 10⁷ клеток/100 мкл.
6. Вымыть клетки путем добавления 3 мл PBS, центрифугирование на 500 x g на 3 мин и аспирационных супернатант.
7. Тщательно Ресуспензируйте клетки в 300 – 500 мкл PBS и фильтра, закупорить через крышкой ситечко нейлон ячейки 35 мкм. Держите клетки на льду и защищены от света до сортировки.

4. Подготовьте ячейки коллекции пластины, выполнения сортировки СУИМ и генерировать cDNA

1. Объединить компоненты смеси реакции RT-предусилитель (Таблица 3), дозирование в единый стерильную пробирку РНКазы/DNAse бесплатно.
   Примечание: Этот шаг может производиться до или во время окрашивания в шаге 3. Чтобы определить вклад шаблон ДНК, ПЦР сигнал здесь можно опускать RT фермента.
2. Используйте многоканальные пипетки обойтись 10 мкл RT-предусилитель реакция смеси в желаемое количество 96-луночных ПЦР сортировка коллекции пластины. Печать пластины с липкой пленкой и поместите пластины на предварительно охлажденные 96-луночных алюминиевых блоков цилиндров.
3. Создание ячеек, сортировка стробирования схема на проточный цитометр путем приобретения данных из примерно 20 000 клеток окрашенных образца. Убедитесь, что матрица компенсации применяется для собранных данных. Нарисуйте ворота и определить стробирования дерево, которое идентифицирует ячейку группе(ах) интерес быть изолированы для анализа выражения гена.
   Примечание: Стробирования дерево, используемое для коллекции потенциальных SIV vRNA⁺ клеток показана на рисунке 3.
4. Введите соответствующий инструмент настройки для указания числа и подмножество ячеек должен быть отсортирован в каждой скважине. Дополнительные подробные инструкции для сортировки либо ограничивающих серии разрежения ячейки или отдельные ячейки предоставляются в шаги 5 и 6, соответственно.
5. СУИМ сортировать клетки в подготовленных 96-луночных ПЦР коллекции пластины. Удалить клей уплотнение до сортировки и заменить свежим печать после сортировки.
   Примечание: Держите пластины на предварительно охлажденные алюминиевых блоков во все времена, в том числе во время сортировки.
6. Сразу же после сортировки, вихрь и центрифуги коллекции пластины на 2000 x g 1 мин при 4 ° C.
7. Thermocycle пластины в машину ПЦР с разогретой крышкой, с использованием следующих условий: 50 ° C 15 мин (RT), 95 ° C в течение 2 мин, после чего 18 циклов 95 ° c 15 s и 60 ° C в течение 4 мин (предварительного усиления).
8. Разбавьте cDNA 1:5 путём перевода 5 мкл cDNA в 20 мкл буфера подвески ДНК в новой 96-луночных ПЦР-планшете. Разреженных cDNA могут храниться при 4 ° С или 20 ° C на неопределенный срок на данный момент. CDNA теперь готов для использования в качестве шаблона для ПЦР (шаги 5.2, 7,4).
   Примечание: Этот разрежения гарантирует, что в реакции RT-предусилитель праймеры не способствуют течению ПЦР.

5. вариант A: СУИМ сортировки клеток в серию разрежения ограничения для определения частоты vRNA⁺ клеток или выполнить экспериментальный контроль качества

Примечание: Перед выполнением сортировки одной ячейки, он может быть полезным для определения частоты клеток интерес, путем сортировки клеток в серийных разведений в репликации. Этот шаг также предоставляет ценные качества контроля для сортировки эффективность, лизис клеток, восстановления РНК и синтез cDNA, как описано в шаге 5.3. Предварительное определение частоты vRNA⁺ клетки позволяет для более точной оценки числа одиночных камер, которые должны быть отсортированы для достижения достаточного размера выборки для анализа выражения гена надлежащим питанием vRNA⁺ клеток.

1. СУИМ сортировать клетки в 96-луночных пластины, подготовленных как в шагах 4.1-4.2 и собирать 1 – 1000 ячеек на хорошо в нескольких реплицирует.
   Примечание: Количество реплицировать скважин при разбавлении каждой ячейки обычно обратно, связанные с концентрацией клеток в колодец. Когда частота инфицированной клетки значительно ниже 1%, ячейка разведений должна сосредоточиться на 100 – 1000 ячеек на хорошо. Пример сортировки пластины карты приводится в Рисунок 1, слева сверху. Свыше 1000 ячеек на колодец следует избегать из-за результирующего увеличения объема реакции и вмешательства с синтеза cDNA вниз по течению и количественной оценки.
2. Объединить ПЦР реактивы в растворе мастер смесь в таблице 4. Для тома реакции 25 мкл 22,5 мкл мастер смеси в сочетании с 2,5 мкл разбавленного cDNA шаблон с шагом 3,9. Выполнять ПЦР с использованием стандартных Велоспорт условий (например, 94 ° C за 5 мин, после чего 40 циклов 94 ° C 15 s и 60 ° C в течение 1 мин).
   Примечание: Singleplex реакций ПЦР с помощью обычных ПЦР в реальном времени инструмент рекомендуются как экономичный предварительный анализ одного или нескольких анализов для демонстрации эффективного ячейку Сортировка, восстановления РНК и синтез cDNA. Он также может использоваться для вычисления частоты vRNA⁺ клеток. Мультиплексной ПЦР-реакции, с помощью Biomark обычно более подходящим для крупномасштабных одноклеточных анализов.
3. Для контроля качества, участок Et значения (Et = Ct_Макс − Ct) по сравнению с количеством клеток сортируются в а в масштабе₁₀ журнала и применять линейный регрессионный анализ.
   Примечание: Последовательное реплицирует, линейной регрессии склоне 3.3 (± 0,3) и R² > 0,9 свидетельствует об эффективной эксперимента. На рисунке 4приведены примеры оптимальных и субоптимальные рода, RT-предусилитель эксперименты.
4. Чтобы определить частоту vRNA⁺ клеток, участок числа клеток, отсортированных в колодец на оси x (журнал₁₀ масштаба) и часть скважин позитивным для vRNA в каждой ячейке разрежения на оси y. В качестве примера см. Рисунок 1 (нижний левый, распределение Пуассона). Применить модель линейной регрессии к данным определить количество ячеек, которые гавани один положительный клеточный в среднем соответствует 63,2% скважин положительный (0.632 на оси y)²¹. Преобразуйте это число клеток разрежения (оси x перехват) частота в процентах. Например одна клетка vRNA⁺ за 48 клетки эквивалентен частотой 2,1%.

6. вариант B: СУИМ сортировки клеток для анализа одной ячейки

1. Выполните шаги 4.1 – 4,8 и укажите одну ячейку Сортировка в хорошо функция проточный цитометр индекс сортировки для создания отдельных файлов FCS для каждой ячейке Сортировка, сопоставлены хорошо позиции.
   Примечание: Если количество пластин сортировки коллекции превышает количество имеющихся thermocyclers, Велоспорт может быть остановлена после этапа инактивации обратной транскриптазы (95 ° C на 2 мин) и cDNA могут храниться при температуре 4 ° C до thermocyclers доступны. В этом случае начать предварительное усиление в первом цикле 95 ° C 15 s.
2. Дополнительно: Создание cDNA «бассейны» состоящий из cDNA от определяемых пользователем партий одиночных клеток экран для редких клетки интереса, используя остаточного неразбавленном cDNA. Перенести 2 мкл неразбавленном одноклеточных предварительно усиленный cDNA, многоканальные пипетки в новую плиту 96-луночных. Повторите, дозирования 2 мкл cDNA от всех дополнительных единичных клеток назначенный бассейн в то же хорошо. Экран cDNA бассейны для gene(s) интерес (например, vRNA) для определения тех, которые содержат позитивные клетки, с использованием обычных ПЦР. Поскольку пул требуется только небольшая Алиготе cDNA от каждой ячейки, оставшиеся ~ 8 мкл cDNA-прежнему доступен для анализа одной ячейки.
   Примечание: Объединение стратегий, рекомендуется перед выполнением анализа выражение гена одноклеточных в попытке уменьшить количество единичных клеток, допрашивали ресурсоемких мультиплексной ПЦР. Это подходит для ситуаций, в которых клетки интереса (например, Сив мРНК +) могут быть определены путем анализа ПЦР предварительного сингл plex. Простой стратегии высокой пропускной способности для создания cDNA бассейны, сочетающие 2 мкл неразбавленном cDNA от пластины сортировка коллекции строк (то есть, все 12 ячеек в строке A) или столбцы (то есть, все 8 ячеек в столбце 1), в одну скважину в новой пластинкой. Чтобы определить оптимальную стратегию объединения, рассмотрим ожидаемая частота клетки интереса от шага 5.4. Например если 10% клеток, как ожидается, будет положительным, бассейны, состоит из шести образцов одноклеточных cDNA часто будет отрицательным и клетки, представленных в этом пуле таким образом могут быть исключены из вниз по течению одноклеточных анализы.

7. мультиплексной ПЦР на платформе Biomark

Примечание: Этот раздел может следовать версии A или B, описанных выше. В исследовании, описанные здесь он применяется исключительно к анализу одной ячейки.

1. Подготовьте пластину анализа ПЦР дозирования 4 мкл калибровочных от 2 x пробирного пластины (подготовленных на шаге 2.2) в новой 96-луночных ПЦР-планшете, содержащий 4 мкл пробирного загрузки реагента в каждой скважине. Поддерживать пробирного пластины при 4 ° C.
   Примечание: Пластину пробирного стабилен при 4 ° C до одной недели и при-20 ° C на один месяц. Таким образом это может быть полезным для подготовки достаточного материала для фишек и храните надлежащим образом.
2. Отказаться от управления линии жидкости от грунтовки шприцы в двух впускных клапанов чипа. Удалите защитные пластиковые из-под плиты. Установите фишку на контроллере МФК с зубчатой стороной на позиции A1. Из главного меню выберите сценарий «Prime». Запустите сценарий.
3. Подготовка смесь реального времени реакции путем смешивания 50 мкл пример загрузки реагента с 500 мкл ПЦР Мастер микс (Таблица материалов) для каждого microfluidic чипа. Пипетка 4.4 мкл в каждой скважине новой пластинкой 96-луночных PCR, отныне назначен пластину «образец».
4. Пипетка 3.6 мкл разбавленного cDNA 1:5 от шага 4.8 в пластину образцы, содержащие смесь реального времени реакции.
   Примечание: Если вниз выбор ПЦР была выполнена на экран для редких (например, vRNA⁺) клетки для анализа ниже по течению, как описано в шаге 6.2, включают только те ячейки, которые представлены в положительных бассейнов.
5. После завершения чип грунтовки Загрузите чип заливов дозирования 5 мкл от пробирного пластины в соответствующий хорошо на v-образный вырез (проба) стороне чипа, и 5 мкл из образца пластины в соответствующий хорошо на другой стороне (образец) чипа. Вставьте контроллер МФК чип и запустите сценарий «Загрузить набор».
6. Передача чип на Biomark платформу для выполнения мультиплексной ПЦР. Продолжите инструмент установки и программирования ПЦР, следуя шаг за шагом инструкции, предоставляемые Real-Time PCR анализа программного обеспечения и с использованием стандартных V.1 выражение гена (GE) 96.96 протокола с 40 циклов PCR. Сохраните файл ChipRun в папку.
   Примечание: Может выполняться несколько фишек в день и в течение нескольких дней.
7. Проанализируйте данные и ПЦР.
   1. Откройте программное обеспечение для анализа ПЦР в реальном времени. Откройте файл «ChipRun.bml» от «файл | Откройте» меню.
   2. Найти «Чип исследователь» и «Чип запустить резюме» в левом верхнем углу окна программного обеспечения. Определить три компоненты запуска резюме чип: анализ представления, образец установки и установки детектора.
   3. Нажмите на «Детектор Setup». «Задача» нажмите кнопку «Создать» и выберите тип контейнера «SBS пластины» и формат контейнера «SBS96». Рядом с «Сопоставление», щелкните на... и выбрать «M96-Assay-SBS96.dsp».
      1. Дополнительно: Назначьте каждое детектор (проба) номер или имя в разделе «Имя» каждой скважины, дважды щелкнув на 1^st хорошо. Перейти к следующей хорошо, нажав клавишу «F2».
   4. Нажмите на «Установка образцов». Под «Задачи» рядом с «Сопоставление», нажмите кнопку... и выбрать «M96-образец-SBS96.dsp».
   5. Нажмите на «Анализ мнения». В разделе «Задачи» в закладке «ПЦР», выберите «Коррекция базовой линии для линейных (производная)» и «Ct порог метод для пользователя (детекторы)». На вкладке «Ct пороги» проверьте «Initialize с автоматической коробкой». Нажмите на кнопку «Анализировать» выше.
   6. В верхнем правом квадранте «Анализ взглядов» нажмите кнопку на второй вкладке «Таблица результатов». Из раскрывающегося меню выберите «Вид карты тепла». Тепловая карта с данными появится.
      1. Дополнительно: Для обеспечения единообразного ROX флуоресценции через чип, выберите «Просмотр изображения» вместо «Тепловой карте вид» из того же меню. Во втором из правой части окна выше тепловой карте выберите «ROX». В первом из правой части окна выберите один из 1-40 циклов. Нажмите на четвертый от окна справа для переключения в черно-белый дисплей ROX флуоресценции. Изображение будет отображаться, сообщает брызжет, частицы, или дефектов на чипе. Если грубо закрывается ROX единообразия, повторно запустите чипа.
   7. Под тепловые карты нажмите кнопку «Порог» и «Журнал граф». Настройте пороги Ct вручную для каждого детектора, нажав на анализы (столбцы тепла карта) и перетащив порог, необходимые для пересечения кривых амплификации в экспоненциальной фазе. Когда это сделано, нажмите кнопку «Анализировать».
8. Экспорт данных ПЦР в виде файла .csv. Импорт данных в таблицу или статистический анализ программного обеспечения (например, СПМ) и сопоставить результаты выборки и анализа позиций на чипе. Группировать ячейки основе экспрессии вирусных генов, создав новый столбец и с помощью условной формулы. В разделе «Анализировать» выберите «Fit Y от X» и участок экспрессии генов против группы. Применить статистического анализа.
   Примечание: Представитель одноклеточных количественное выражение четырех видов РНК SIV изображен в двумерных участков в Рисунок 5A. Количественные хост экспрессии генов в клетках SIV РНК⁺ показано на рисунке 5B.
9. Извлечение количественных белка выражение значения из одной ячейки данных СУИМ.
   1. Открыть .fcs файлов с СУИМ сортировки (шаг 6.1) соответствует 96-луночных пластину, используя FlowJo версии 9. С выделенным именем файла, выберите «платформа | Число событий ворота | Создание индексированного сортировки ворота». Отдельные ячейки появится отображаются построчно.
   2. Выделите все 96 клетки (не строк) и выберите «область | Экспорт | Выберите все компенсируется fluors.» Под «Тип данных» выберите «FCS файл», нажмите «Экспорт» и выберите нужную папку.
   3. Перетащите новый .fcs файлов для отдельных ячеек в новой рабочей области FlowJo. Выделить все ячейки, нажмите кнопку «Добавить статистика» («Σ» кнопка в левом верхнем углу) «| Значит | Все параметры Флуор».
   4. Откройте «редактор таблиц», нажав кнопку четвертый слева в верхнем левом углу. Выделите все тей первой ячейки и перетащить их в окно редактора таблиц. В окне Редактор таблицы нажмите ту же кнопку в верхней части «Создание и просмотр таблицы». Это создаст таблицу 96 клеток и числовой параметр для каждого Флуор.
   5. Скопируйте вывод в программное обеспечение базы данных (например, MS Excel, JMP), либо копирования/вставки или, нажав кнопку «Сохранить и запустить приложение» (четвертый из левой кнопкой над таблицей).
      Примечание: Эта процедура является специфичным для FlowJo версии 9. FlowJo версии 10 использует различные процедуры для импорта индексированных данных. Индексированные потока данных можно также скопировать/вставить в JMP непосредственно из CSV-файлов, созданных клеток сортировщик.
10. Слияние данных СУИМ одноклеточных и ПЦР по количеству пластины и хорошо позиции. Выполнить графический и статистический анализ на комбинированных одноклеточных ген (ПЦР) и белок выражение (FACS) данных.
    Примечание: Примеры одной ячейки объединены ПЦР и СУИМ данные приведены на рисунке 6 (принимающей поверхности белка выражение профили для SIV-инфицированных, сращивания vRNA⁺ резус макака клетки), рис (CD4 экспрессии генов по сравнению с поверхности CD4 белков в клетках макак резус сращивания vRNA⁺ ) и ранее опубликована²⁰. Для выявления дифференциально выразил генов в клетки группе(ах) интереса, одноклеточных анализ методов описанных ранее рекомендованные^20,22,23,24, которые приходится Доля положительных генов, а также значение выражения непрерывной гена клеток.

Результаты

Рабочий процесс для весь протокол изображен на рисунке 1. Он состоит из двух вариантов определяется количество клеток сортировка: либо ограничивающих разрежения или как одной клетки, как описано в тексте. На рисунке 2приведены примеры а...

Обсуждение

Протокол описано здесь, называется tSCEPTRE, интегрирует поверхности белка одноклеточных количественный, многопараметрических проточной цитометрии с количественное выражение mRNA одноклеточных, высоко мультиплексированных RT-ПЦР. Объединение этих двух технологий позволяет высоким содер?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction and PCR reagents and consumables
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-well PCR Plate	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Glass Distilled Water	Teknova	W3345
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (if separate from kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagents
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000736
Sample Loading Reagent	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagents
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Polystyrene tube with strainer cap	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	dilute 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	dilute 1:40
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	dilute 1:83
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8	Biolegend	302048	dilute 1:167
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7	Biolegend	302340	dilute 1:37
Anti-CD38-R PE clone OKT10	NHP reagent recource	N/A	dilute 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50	BD Biosciences	564364	dilute 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6	BD Biosciences	561358	dilute 1:20
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A	Biolegend	313528	dilute 1:80
Instruments
BioPrptect Containment Enclosure	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences
ProtoFlex Dual 96-well PCR system	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
IFC controller HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD