JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол эффективно изолировать первичной человеческие кератиноциты от взрослых кожных тканей. Этот метод упрощает обычные процедуры с использованием ингибитора Y-27632 рок в средне-прививка спонтанно отделить эпидермальных клеток от кожных клеток.

Аннотация

Для лабораторных исследований и клинического применения основного человека кератиноцитов, изолированный от свежих кожных тканей и их расширение в пробирке широко использовались. Обычные изоляции метод человеческие кератиноциты включает в себя последовательное ферментативного пищеварения двухэтапная процедура, которая оказалась неэффективной в генерации начальных клетки от взрослых тканей из-за низкой сотовый скорость восстановления и сокращение клеток жизнеспособности. Недавно мы сообщили расширенный метод изолировать человека первичной эпидермальный прародитель клеток тканей кожи, использующий ингибитора киназы Ро Y-27632 в среде. По сравнению с традиционными протоколом, этот новый метод проще, легче и менее трудоемким и увеличивает урожайность эпителиальных стволовых клеток и усиливает их характеристики стволовых клеток. Кроме того новая методология не требует отделения эпидермис от дермы и, таким образом, подходит для изоляции клетки из различных видов тканей взрослого. Этот новый метод изоляции преодолевает основных недостатков традиционных методов и больше подходит для производства большого количества клеток эпидермиса с высокой потенции, как в лабораторных, так и для клинического применения. Здесь мы опишем новый метод в деталях.

Введение

Целью было разработать простой и эффективный протокол изолировать первичной человеческие кератиноциты (HKCs) от взрослых тканях, особенно для клинического применения. Эпидермальный стволовых клеток кожи, локализованные в базального слоя кожи, обладают высоким потенциалом размножаться и дифференциации кератиноцитов для поддержания функций кожи1,2,3, 4. HKCs, изолированных от кожи, ткани широко используются для кожи ткани инженерии и регенерации целей, особенно в ремонт поврежденной кожи и генной терапии для клинического применения5,6. Ключевым вопросом для приложений на базе HKC является эффективно изолировать и расширить большое количество HKCs с высоким потенциальным в vitro7,8. Хотя различные исследовательские группы разработали методы для производства культур стволовых как HKCs, эти методы являются иногда длительным и сложным для выполнения и другие ограничения, например урожайность низкая клеток и ограничиваясь типом кожи образца используемые9. К примеру традиционный метод, чтобы изолировать HKCs от кожных тканей предполагает двухэтапный ферментативного пищеварения с разделением эпидермис дерма6. Этот метод обычно хорошо работает для новорожденных тканей, но она становится очень трудно, когда используется для изоляции клетки от взрослых тканях.

Y-27632, ингибитора киназы Ро связанные белком (рок), сообщалось значительно повысить эффективность эпидермальный стволовых клеток изоляции и колонии роста10,11,12. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что Y-27632 облегчает клоновых рост клеток эпидермиса, но уменьшает доходность кожных клеток, дифференциально контролируя экспрессию молекул адгезии13. Мы также создали новое средство кондиционером прививка, называется G-средний, который поддерживает рост и урожайность первичных клеток эпидермиса. Объединив G-средний с Y-27632, этот новый метод может спонтанно отдельных клеток эпидермиса и дермы после Пищеварение энзима, удалив таким образом шаг эпидермис дерма разделения13,14. Основываясь на предыдущих докладах, мы теперь описывают подробные процедуры этот новый метод, чтобы изолировать HKCs от взрослых кожной ткани.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Человеческие ткани, используемые в настоящем Протоколе, обрабатывались в соответствии с руководящими принципами Комитета этики Института исследований человеческого (NO.2015120401, Дата: 12 мая 2015).

1. Подготовка

  1. Собирать свежие взрослых брюшной кожных тканей, отказаться от пластической хирургии в госпитале в 50-мл тюбик 10 мл ледяной Дульбекко модифицированная Eagle среднего (DMEM). Образец может храниться при температуре 4 ° C до 72 ч без значительно влияющих на жизнеспособность клеток.
  2. Подготовка реагентов и питательной среды, как описано ниже.
    1. Добавьте 50 мл раствора фосфатного буфера (PBS) подготовить моющего раствора 1 мл пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мг/Л).
    2. Подготовить два комплекта фермента пищеварение решения: (1) подготовить dispase (2,5 мг/мл в среде DMEM) 50 мл и 50 мл тип I коллагеназы (2,5 мг/мл в среде DMEM) отдельно для обычного метода; и (2) подготовить 50 мл смеси dispase и типа коллагеназы (растворить 125 мг порошка dispase и 125 мг I тип коллагеназы порошок в 50 мл DMEM) для нового метода.
      Примечание: Все фермента решения должны быть отфильтрованы с 0,22 мкм фильтром и держал at4 ° C.
    3. Подготовить пищеварение решения для обоих методов: 0,05% трипсина и трипсин 0.25% коммерчески были приобретены. Подготовка 10 мг/мл DNase I решения путем растворения 50 мг DNase я порошка в 5 мл PBS, фильтрация с помощью стрейнер 0,22 мкм и хранить его при-20 ° C.
    4. Подготовка 500 мл среды для нейтрализации ферментативного пищеварения: средний DMEM, дополненная плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллина/стрептомицина.
    5. Подготовка 500 мл средства прививок (рост фактор содержащих средний, называется G-средний): DMEM/F12 (3:1) среде, содержащей 1% пенициллина/стрептомицина, fungizone 40 мкг/мл, 40 нг/мл фактор роста фибробластов 2 (FGF2), 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), и Дополнение 2% B27.
    6. Предварительной обработки 100-мм клеточной культуры блюда с 2 мл покрытие матрицы, содержащие тип коллагена для 30 мин при комнатной температуре.

2. обычный метод

  1. Предварительная обработка ткани кожи
    1. Возьмите2 1,5 см ткани кожи и мыть его 1 x 10 мл PBS; затем промойте его с 10 мл, этанол 70% для 30 s и проинкубируйте его 2 x 10 мл моющего раствора (PBS, содержащий 2% пенициллина и стрептомицина), 5 мин.
      Примечание: Все моет выполняются в 100-мм ячейку культуры блюда внутри Ламинарный шкаф.
    2. Обрезка ткани с стерильные ножницы, чтобы удалить подкожный жировой слой в блюдо культуры 100-мм ячейку и затем, весят ткани кожи (вес составляет 1 g в этом протоколе).
      Примечание: Достаточно триммирование является очень эффективной сепарации эпидермис от дермы. Желтоватый жирового слоя можно легко отличить визуально.
    3. Передать другой 100-мм стерильные блюдо с стороны дермы ткани вниз и, затем, нарезать полосками 3 - до 4 мм широкий, с помощью скальпеля лезвие ткани кожи.
      Примечание: Стороны дермы с жировой слой легко распознается визуально.
    4. Добавить 10 мл 2,5 мг/мл dispase раствора на кожу тканей в 100-мм культуры блюдо и, затем, инкубировать блюдо на ночь при 4 ° C (не более 20 h).
      Примечание: Количество dispase раствора может рассчитываться с помощью 10 мл dispase раствора для пищеварения каждый грамм ткани.
  2. Разделение эпидермис от ткани кожи
    1. На второй день шелушиться эпидермис от дермы с помощью тонкой пинцета.
      Примечание: Если это трудно слезает эпидермиса, dispase пищеварение недостаточно, как это обычно из-за недостаточной обрезки ткани. В этом случае ткани нужно более длиннее время инкубации.
    2. Фарш очищенные эпидермиса с 500 мкл клеток питательной среды в ткани пульпы с помощью лезвия скальпеля; затем Ресуспензируйте с 10 мл 0,25% трипсина в 50-мл пробирку и проинкубируйте его 20 мин на водяной бане при 37 ° C, при встряхивании.
  3. Сбор и культивирования клеток первичного
    1. Нейтрализовать действие трипсина, добавляя равным объемом нейтрализации раствора (10 мл в этом протоколе).
    2. Отделить эпидермальных клеток, закупорить решение вверх и вниз 20 x с Серологические Пипетки 10-мл и пройти ячейки решения через стрейнер ячейки 100 мкм для удаления любого мусора остаточной ткани.
    3. Центрифуга клетки решение на 200 x g 5 мин после фильтрации; Ресуспензируйте Пелле клеток в среде нейтрализации для мытья и, затем, центрифуга его снова на 200 x g для получения гранул ячейки.
    4. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл низким кальций, сыворотка бесплатно кератиноцитов среды (УЛП). Возьмите 10 мкл этого решения для подсчета числа общей ячейки и, затем, пластины около 2 х 106 клеток с 10 мл в 100-мм ячейку культуры блюда, предварительно обработанных с покрытие матрицы УЛП (содержащий тип I коллагена).
      Примечание: Покрытие является необходимым шагом для обычного метода.
    5. Изменение культуры среднего каждые 2 d.
      Примечание: Проверьте адгезии клеток под микроскопом, до и после изменения питательной среды.
    6. Проход клеток, когда они достигают около 80% слияния.
      Примечание: Все блюда культуры являются предварительно обработанных с покрытие матрицы.

3 новый метод

  1. Предварительная обработка ткани кожи
    1. Собирайте ткани как описано выше (шаг 2.1) для обычного метода.
    2. Вымойте ткань кожи 1 x 10 мл PBS и, затем, взвесить его в стерильных пластиковых контейнеров, электронные весы (вес составляет около 1 g в этом протоколе).
      Примечание: Минимальный вес ткани, необходимые для этого протокола — 0,1 г, так как это трудно получить достаточное количество клеток, если используется образец ткани слишком мал. Существует не максимальный вес ткани для этого протокола, который в конечном счете зависит от пропускной способности оператора.
    3. Используйте щипцы для полоскания тканей кожи с 10 мл 70% этанол 30 s.
    4. Инкубировать ткани 2 x 10 мл моющего раствора (подготовленных на шаге 2.1.1), 5 минут каждый раз.
      Примечание: Все шаги Стиральная, отмечалось выше выполняются в 100-мм ячейку культуры блюда внутри Ламинарный шкаф (культуры ткани капот).
    5. Передать другой 100-мм ячейку культуры стерильные блюдо ткани.
    6. С помощью лезвия скальпеля, фарш ткани тщательно в ткани пульпы.
    7. Добавьте 200 мкл PBS каждые 5 мин держать влажной ткани.
      Примечание: Принимать шаги 3.1.5 - 3.1.7 около 15 мин. Все указанные выше действия выполняются при комнатной температуре.
  2. Пищеварение ткани кожи
    1. Передача решения гомогенизированные ткани в 50-мл пробирку. Добавьте 10 мл смеси ферментов для каждого 1 г ткани кожи. Тщательно перемешать ферменты с усредненной тканей.
    2. Инкубируйте в смеси с тряски в водяной бане при 37 ° C в течение 1 ч.
    3. Добавить 1/5 объем трипсин 0.25% (2,5 мл в этом протоколе) пищеварение смесь для еще 30 мин на водяной бане при температуре 37 ° C.
    4. Добавить DNase я решение фермент смесь в соотношении 1: 100 (v/v) (250 мкл в этом протоколе) и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре.
  3. Сбор и культивирования клеток первичного
    1. Остановите процесс пищеварения, добавив 12,5 мл нейтрализация среды в соотношении 1:1. Пипетка решение вверх и вниз для около 20 x, разбить ячейки с помощью Пипетки серологические 10-мл.
    2. Фильтр диссоциированных клетки через стрейнер ячейки 100 мкм для удаления мусора ткани. Центрифуга супернатант в 200 x g 5 мин наблюдать Пелле в нижней части трубки.
    3. Отменить супернатант и снова вымыть клетки лепешка с 10 мл нейтрализации средних и центрифуги на 200 x g 5 минут собрать клетки.
    4. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл средства прививок (G-средний шаг 1.2.5) с 10 мкм Y-27632.
    5. Возьмите 10 мкл раствора для подсчета числа общей ячейки и, затем, пластины около 2 х 106 клеток с 10 мл в 100-мм ячейку культуры блюдо G-среды.
      Примечание: Намывных шаг не является необходимым для нового метода, а не удаление дермального слоя требуется либо.
    6. После 3 d замените средства прививок с низким кальция УЛП среднего. Изменение культуры среднего каждые 2 d.
      Примечание: Проверьте клеточной адгезии, до и после изменения среды.
    7. Проход клеток, когда они достигают около 80% слияния.
      Примечание: При необходимости предварительной обработки клеток с 0,05% трипсина на 2 мин и вымыть клетки с PBS для удаления загрязнения кожных клеток перед trypsinizing клеток эпидермиса.

4. клетки пассированый

  1. Удалите носитель, вымыть клетки с PBS и, затем, добавить 2 мл 0,05% трипсина (за каждое блюдо 100-мм).
  2. Инкубируйте клетки в инкубаторе (37 ° C с 5% CO2) 5 мин.
  3. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки отделен от культуры блюдо.
  4. Добавить 8 мл DMEM с 10% FBS для нейтрализации ферментативной реакции и, затем, собрать клетки в 15 мл.
  5. Центрифуга на 200 x g 5 минут для получения гранул ячейки.
  6. Удалить супернатант медленно и, затем, Ресуспензируйте клетки лепешка с 10 мл среды УЛП и подсчитать количество ячеек.
  7. Пластина 1 х 106 клеток с 10 мл в каждую ячейку 100-мм блюдо УЛП.
  8. Изменение среднего каждые 2 d.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1представлены схемы нового метода (рис. 1A) и традиционным методом (рис. 1B). Традиционным методом является двухэтапный пищеварение, которая требует 2-день процедуры. Напротив новый метод это Одношаговая пищеваре...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Культивированный первичной HKCs широко использовались для лечения ран в клиниках для более чем трех десятилетий, и с того времени, он был всегда важно эффективно получить достаточное количество клеток для клинического применения своевременно. Таким образом на практике, обычные изоляци?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана национальной ключ научных исследований и развития программа Китая (2017YFA0104604), Генеральный программы национального фонда естественных наук Китая (NSFC, 81772093), Наука и технологии развития программа Сучжоу (ZXL2015128), Естественные науки фонд провинции Цзянсу (BK20161241) и премию ученый Taishan Шаньдун (tshw201502065).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Countess automated cell counterInvitrogen Inc. C10227Automatic cell counting 
CO2 IncubatorThermo Scientific51026333For cell incubating
Sorvall ST 16R CentrifugeThermo Scientific75004380Cell centrifuge
Constant Temperature ShakerShanghai Boxun150036For water bath
Electronic ScaleHarbin Zhonghui1171193For tissue weighing
Cell Culture DishEppendorf30702115For cell culture
50ml Centrifuge TubeKIRGEN171003For cell centrifuge
Cell StrainerCorning incorporated431792Cell filtration
Phosphate buffered solutionSolarbio Life Science P1020-500Washing solution
DMEMThermo ScientificC11995500Component of neutralization medium
Defined K-SFMLife Technologies10785-012Epidermal cells culture medium
Penicillin StreptomycinThermo Scientific15140-122Antibiotics
Fetal Bovine SerumBiological Industries04-001-1AC5Component of neutralization medium
0.05% TrypsinLife Technologies25300-062For HKC dissociation
0.25% Trypsin Beijing Solarbio Science & TechnologyT1350-100For HKC dissociation
Coating Matrix KitLife TechnologiesR-011-KFor coating matrix
DispaseGibco17105-041For HKC isolation
Collagenase Type ILife Technologies17100-017For HKC isolation
Deoxyribonuclease ISigma9003-98-9For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, HamsLife Technologies31765035Component of G-medium
B27 SupplementLife Technologies17504044Growth factor in G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595Growth factor in G-medium
Y-27632Sigma-AldrichY0503ROCK inhibitor
FungizoneGibco15290026Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human ProteinGibcoPHG0311Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8Thermo ScientificNC9864731cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5Hewlett-Packard Development CompanyMA-20142For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human LoricrinCovancePRB-145pFor immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human VimentinCell Signaling Technology3390For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3)Santa Cruz SC-19622flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITCSanta Cruz SC-2831negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis 

Ссылки

  1. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  2. Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383(2012).
  3. Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
  4. Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
  5. Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2(2013).
  6. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  7. Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
  8. Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
  9. Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
  10. Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
  11. Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  12. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
  13. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  14. Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
  15. Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
  16. Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
  17. Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
  18. Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

138Y 27632

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены