JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы опишем стандартный протокол для выявления активности β-галактозидазы в начале всего мыши эмбрионов и метод для парафина секционирование и counterstaining. Это простая и быстрая процедура для мониторинга экспрессии генов в процессе разработки, которые могут также применяться для разделов ткани, органов или культивируемых клеток.

Аннотация

Кишечная палочка LacZ гену, β-галактозидазы, в основном используется как репортер экспрессии генов и как трассировщик клеток линии исследований. Классическая гистохимические реакция основана на гидролиз субстрата X-гал в сочетании с ионами железа и черных, который производит нерастворимых синий осадок, который легко визуализировать. Таким образом активность β-галактозидазы выступает в качестве маркера для выражения гена интереса по мере развития. Здесь мы опишем стандартный протокол для выявления активности β-галактозидазы в начале всего мыши эмбрионов и последующий метод для парафина секционирование и counterstaining. Кроме того процедура для уточнения весь эмбрионов предоставляется лучше визуализировать X-Гал пятнать в более глубоких зонах эмбриона. Согласованные результаты получаются путем выполнения этой процедуры, хотя оптимизация условий реакции необходима для сведения к минимуму фоновой активности. Ограничения в assay должны рассматриваться также, особенно в отношении размера эмбриона окрашивания всю гору. Наш протокол обеспечивает чувствительной и надежный метод для обнаружения β-галактозидазы в процессе разработки мыши, который может применяться в криостата секций, а также целые органы. Таким образом динамический ген выражение шаблоны разработки может быть легко проанализирован с помощью этого протокола в целом эмбрионов, но также подробные выражение на клеточном уровне может оцениваться после разрезания парафин.

Введение

Для того чтобы описать картин выражения определенного гена, использование репортер генов как маркеры был исключительно от дрозофилы до млекопитающих. В экспериментах с участием нокаут и трансгенных животных гена бактериальной β-галактозидазы (LacZ) Escherichia coli (E. coli) является одним из наиболее широко используемых в1,2,3, 4. β-галактозидазы (β-gal) катализирует гидролиз β-galactosides (например, лактоза) в моносахариды (глюкозы и галактозы)5. Его наиболее часто используемые субстрата является X-Гал (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), гликозид, гидролизуется по β-галактозидазы приведшего к 5-бромо-4-хлоро-3-гидроксииндол и галактозы. Первый окисляется в димер, когда используется в сочетании с Ферри калия- и Ферро цианид, производит характерный нерастворимые, синий цвет осадок (рис. 1)6.

Ген LacZ начал использоваться как репортер ген более тридцати лет назад7,8. Обычно, вставляется LacZ вниз по течению от эндогенных промоутер месте открытой чтении кадра, поэтому она может использоваться в культуре бактерий и клеток для визуализации ячеек, содержащих определенного Вставка, а также в трансгенных животных как трассировщик эндогенных картин выражения гена во время развития9. В этой связи визуализация активности β-галактозидазы широко применяется в дрозофилы для понимания развития и клеточных процессов от единичных клеток во всей ткани. Генетики дрозофилы пользу поколение стабильной линий, в которых изменение P-элемент конструкции, содержащие Репортер ген LacZ , вставляется наугад мест в геноме. Таким образом когда под влиянием усилитель элементы он может диск свое выражение определенным образом ткани, которая позволила систематический анализ структуры выражения многих генов в течение последних двух десятилетий10. Кроме того использование трансгенных мышей для мониторинга LacZ экспрессии генов также позволяет обнаружение событий рекомбинации генов, КРР loxP при посредничестве рекомбинации и локализации производных мутант эмбриональных стволовых клеток в химерных анализа 11, которая облегчает контроль LacZ выражения в определенных тканях также как височно. Кроме того в целом эмбрионов, обнаружение активности β-галактозидазы может производить дифференцированного окрашивания моделей на различной интенсивности, которые можно удобно наблюдать через различные этапы развития проанализировать временные изменения в экспрессии генов 8,12.

В этой статье мы представляем протокол для визуализации экспрессии генов через X-Гал пятнать в целом гора ткани на ранних этапах своего развития зародышей мыши. Мы представляем этот гистохимический метод как весьма деликатного и недорогой техники, которая выступает точное обнаружение помеченных клеток в целом гора образцов или на клеточном уровне, после того, как парафин-врезанных тканей или эмбрионов. Метод позволяет для прямого визуализации окрашивание ткани мыши с минимальное образование по сравнению с другими методами13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все экспериментальные процедуры были утверждены Комитетом по этике животных эксперименты CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) и Autónoma Comunidad де Мадрид для обеспечения минимальной животное страдает.

1. сбор эмбрионов от беременных мышей (от E8.5 до E12.5)

  1. Пожертвуйте беременных мышей шейки матки вывих или CO2 ингаляции. Первый день Вагинальные вилка считался эмбриональных день 0,5 (E0.5).
  2. Положите животное в лежачем положении на абсорбирующей прокладки и очистить брюшной кожу мыши с 70% этиловом спирте.
    Примечание: Стерильность не требуется в следующих шагах.
  3. Пинч и поднимите брюшной кожи с помощью мыши зуб щипцами.
  4. Сделайте надрез через кожу и брюшной стенки, 2-4 см вертикально по всей средней линии живота, используя Ножницы хирургические.
  5. Подвергать брюшной полости и удаление матки рога от матери с щипцами резки кровеносных сосудов вдоль внутренней кривизны матки с Ножницы хирургические.
  6. Удалите строку эмбрионов и перенести его на чашку Петри на льду, содержащие 10 мл ледяной 0,01 М фосфатного буфера физиологический рН 7,4 (PBS).
  7. Тщательно анализировать эмбрионов, из матки под стереомикроскопом в чашке Петри с 10 мл свежего ледяной PBS. Возьмите мышц стенки с щипцами расфиксировать подвергать Амниотический мешок и затем разрыв амниотической мембраны для удаления закрытых эмбриона и желточного мешка, используя советы щипцы.
  8. Собрать эмбрионов помёте от беременных мышей на ранних этапах (от E8.5 до E12.5) (рис. 2).
  9. Передать блюдо свежих эмбрионов с 10 мл холодной 1 x PBS с помощью Изогнутый пинцет или, для очень мелких эмбрионов (E8.5-E9.5), используйте пипетки пластиковые передачи для сбора образцов без повреждения эмбриона.
  10. Перед началом фиксации, принимать эмбриональных образцов в пробки microcentrifuge для генотипирования резки небольшой кусок эмбриона или принимая амниотической мембраны в маленьких эмбрионов (от E8.5 до E9.5) с расфиксировать щипцами.
    Примечание: LacZ генотипирования определяется праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР): вперед, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; обратный, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2. Фиксация зародышей мыши

  1. Перевод каждого эмбриона в 2-мл пробирку microcentrifuge с закругленными база, содержащая 1 мл ПБС.
    Примечание: Выполните все шаги в протоколе в эти трубы с перемешиванием с помощью подвижного шейкер.
  2. Вымойте эмбрионы в однократном ПБС за 1 мин при комнатной температуре для ликвидации оставшихся крови. Использование пипетки пластиковые передачи изменить жидкости в трубах.
  3. Исправьте эмбриона в 1 мл глютаральдегид 0,125% на льду.
    Примечание: Время фиксации зависит от размера эмбриона: 20 мин для E8.5-E9.5 эмбрионы, 30 мин E10.5 эмбрионов и 1 час для E12.5 эмбрионов.
  4. Снимите фиксатор и мыть эмбрионы в однократном ПБС дважды за 10 мин при комнатной температуре перед обработкой образца для X-Гал пятнать.

3. Вся гора β-галактозидазы гистохимии зародышей мыши

  1. Подготовка X-Гал полоскания буфер и X-Гал окрашивание раствора до начала процедуры (см. таблицу 1 и Таблица материалов). Использование эмбрионов помёте (WT) одичал тип как негативный контроль для ферментативной реакции.
  2. Инкубируйте эмбрионов в X-Гал полоскания буфер 10 мин при комнатной температуре (рис. 2).
  3. Инкубируйте эмбрионов в X-Гал окрашивание раствора от 2 h для ночевки при 37 ° C, защищать от света. Монитор цветной реакции периодически через рассечения микроскопа до достаточной интенсивности синего окрашивания наблюдается без фона в эмбрион. Держите рН раствора между 8 и 9 для уменьшения фона в целом окрашивание. Если окрашивание раствора начинает свою очередь, свет, замените его свежий субстрат решение продлить ферментативной реакции.
  4. Остановите реакции, когда желаемый сигнал получается путем промывания эмбрионов в пробки microcentrifuge с PBS 1 x 1 мл два раза за 10 мин при комнатной температуре.
  5. Передавать параформальдегида 4% 1 мл (PFA) повторно исправить их, окрашенных эмбрионов за 1 ч до на ночь при 4 ° C.
    Примечание: Эмбрионы могут храниться в 4% PFA/PBS для более длительное время при температуре 4 ° C или могут обрабатываться немедленно для разрезания. Этот шаг окончательной фиксации имеет решающее значение для долгосрочного сохранения окрашивание шаблон.
  6. Вымойте эмбрионы в PBS 1 x 1 мл два раза за 10 мин при комнатной температуре.
  7. Вариант 1: Очистить эмбрионов, погружение в серии решений с увеличением концентрации глицерина (20%, 40%, 60% и 80% глицерина в однократном ПБС) за 1 ч при комнатной температуре в каждом решении.
    Примечание: Мыть эмбрионов в 80% глицерина для больше времени, даже дней, до тех пор, пока они очищаются, а затем сохранить их в 80% глицерина на 4 ° C на этот шаг (рис. 2). Добавление эмбрионов, хранить при 4 ° C в глицерин или 1 x очень небольшое количество кристалл Ора азид натрия тимола PBS рекомендуется для предотвращения плесени. После очистки, вся гора эмбрионов может использоваться для фотографирования (шаг 4).
  8. Вариант 2: Процесс эмбрионов для парафина встраивание и секционирование, используя микротом (рис. 2). Документ шаблона выражения в целом окрашенных эмбрионов перед секционирование (шаги 4 и 5).

4. фотография вся гора эмбрионов

  1. Фотографировать всю гору, окрашенных эмбрионов до секционирование, передавать их на Петри блюдо, приготовленное с базой затвердевших агарозы 1-2% в однократном ПБС.
  2. Обложка эмбриона полностью с 10 мл ПБС блюдах агарозы покрытием для предотвращения обезвоживания и отражение во время фотографирования через жидкость.
  3. Ориентировать зародыш погружен в 1 x PBS с помощью щипцов. Для старых эмбрионов (E10.5-E12.5) сделайте небольшое отверстие в агарозном пинцетом место и положение образца в пределах его под разными углами и избежать свободного плавания в течение фотографии.
  4. Поместите блюдо на сцене стереомикроскопом, используя переданные (заместитель) свет. Переключение между «темно поле» и «ярко поле» корректировок для установки желаемого освещения в фотографии и оптимизировать прозрачность образца.
    Примечание: Использование волоконно оптические освещение для поздней стадии эмбриона избежать отражения на поверхности эмбриона. При фотографировании очищается эмбрионов, следовать той же процедуре, но передавать их на чашку Петри, содержащий 100% глицерина и полностью погрузить их.

5. Парафинотерапия встраивание и секционирование X-Гал окрашенных эмбрионов

  1. Встраивание парафина
    1. Удаление X-Гал, окрашенных эмбрионов от 4 ° C (шаг 3.5) и вымыть их с PBS 1 x 1 мл три раза, чтобы устранить избыток фиксатором.
    2. Перевод каждого эмбриона гистология кассету с помощью щипцов.
    3. Место кассеты, содержащие эмбрионов в стакан и затем обезвоживает, передавая их через серию градуированных этанола при комнатной температуре: 70% этанол, один раз в течение 30 мин; Этанол 96%, дважды за 30 минут каждый; 100% этанола, дважды за 30 мин.
      Примечание: Эмбрионы могут храниться в 70% этанол на неопределенное время при температуре 4 ° C до начала процесса обезвоживания.
    4. Инкубируйте всю кассету в изопропаноле на 30 минут при комнатной температуре.
    5. С помощью щипцов, передача кассеты на стакан, окрашивание корыта, содержащие подогретым изопропанол и оставить в духовке при температуре 60 ° C за 30 мин.
    6. Место кассеты в новое стекло, окрашивание корыта, содержащие смесь из 50% изопропиловый спирт / 50% расплавленный парафин и оставить на 4 ч в 60 ° C духовке.
    7. Инкубируйте кассеты с эмбрионов с двумя изменениями расплавленного парафина, 30 мин при 60 ° C.
    8. В конце заключительного парафин мыть откройте кассету и передавать отдельные ткани, встраивание формы для просмотра образца под стереомикроскопом каждого эмбриона.
    9. Заполнить колодец с расплавленный парафин при температуре 60 ° C. Используйте с подогревом щипцы для держать расплавленный воск и тщательно ориентироваться эмбриона в плесени.
      Примечание: Правильную ориентацию образца является важным шагом для разрезания эмбриона в плоскости желаемого.
    10. Прежде чем парафин застывает в форме, установите кассету без крышки на верхней части блока и заполнить его с расплавленного парафина. Пусть оставшиеся воска прохладно пока затвердевает на ночь при комнатной температуре.
    11. После того, как парафин полностью затвердевает, удалите твердого блока от плесени и хранить парафиновых блоков при комнатной температуре или при температуре 4 ° C до разрезания14.
  2. Парафин секционирование
    1. Ориент лезвие на микротома и настроить 5-7 мкм толщиной. 5.2.2. холодный парафин блок на льду и обрезать его производить куб или пирамиды.
    2. Прикрепите блок к держателю микротом, используя небольшое количество расплавленного воска.
    3. Восточный блок для оптимального раскроя. Раздел парафиновых блоков толщиной ломтиками 5-7 мкм при комнатной температуре с помощью стандартных микротома.
    4. С помощью тонкой кистью, поместите эти разделы в водяной бане при комнатной температуре для манипулирования и выбора фрагментов.
    5. Подобрать разделы из водяной бани с микроскопа и перенести их в водяной бане при 42 ° C для растяжения.
    6. Удалите разделы из водяной бани и осторожно поместите их на скольжениях микроскопа адгезии.
    7. Сухие слайды в духовке при 37 ° C на ночь, чтобы разрешить секций полностью придерживаться, в противном случае, они могут получить потеряли во время окрашивания.
      Примечание: Храните слайды при температуре 4 ° C до начиная пятнать процедур.
  3. Депарафинизации и Counterstaining из X-Гал окрашенных парафиновых срезах
    1. Поместите слайды на подносе микроскопа в духовке при 60 ° C для по крайней мере 45 минут сделать парафина больше жидкости.
    2. Перенести слайды на решетку и использовать стекло, окрашивание блюда для выполнения следующих шагов: погружать стойки в окрашивание банки, содержащие спирты снижения концентрации для удаления полностью парафина и гидратации тканей: изопропиловый спирт для 5 минут 60 ° C; Изопропиловый спирт на 3 мин; 100% этанола на 2 мин; Этанол 96%, за 1 мин; 70% этанола за 1 мин при комнатной температуре.
    3. Полоскания разделы в дистиллированной воде дважды, чтобы убедиться, что есть нет остатков спирта.
    4. Изображение секции с пятно (например ядерное-Fast Красного раствора) за 5 мин (обычно между 3-8 мин) при комнатной температуре (рис. 2).
      Примечание: Это окрашивание помогает выявить общую структуру ткани в разделах.
    5. После окрашивания, мыть слайды в дистиллированной воде в течение 1 мин и проверьте раздел пятнать в микроскопе.
      Примечание: Если желаемого окрашивания слишком слаб, изображение разделы снова на более длительное время.
    6. Обезвоживает секций в следующих сериях с увеличением концентрации этанола: две автомойки в 95% этаноле за 2 мин, два моет в 100% этанола за 2 мин, и, чтобы избежать растворения синий цвет осаждает, только одна быстрая стирка в ксилоле.
    7. Удалите слайды из стойки один за другим и разместить их на листе бумаги. Горе и coverslip сдвиньте с использованием синтетических, постоянного монтажа средних.
      Примечание: Ксилол является продуктом легковоспламеняющихся паров которого раздражающих и вредных для здоровья человека и водных организмов. Он должен управляться в рамках Худ и требует использования надлежащего защитного оборудования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Здесь мы показываем результаты от применения стандартный протокол для β-галактозидазы гистохимические реакции с помощью X-Гал как субстрат в целом мыши эмбрионов (рис. 1 и рис. 2). Используя этот протокол, осматриваем мембраны типа 4-матри...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

E. coli ген LacZ широко используется как репортер в исследованиях картин выражения гена из-за его высокой чувствительностью и легкости обнаружения. Настоящий Протокол описывает классический метод для обнаружения β-Гал выражение на основе ферментативные реакции, которая легко и быстр?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие финансового интереса.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить службу гистопатологические их технической помощи в Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Мы также благодарим д-р Motoharu Seiki для любезно предоставление Mt4-ММЗLacZ мышей и д-р Алисия G. Арройо, для поддержки нашего проекта и для ее критического чтения рукописи. Мы хотим поблагодарить Питера Бонни для корректуры этой статьи. Эта работа была поддержана Europea Мадридский посредством гранта (# 2017UEM01) в ЦСК

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
2-PropanolSIGMA-ALDRICH24137-1L-R
AgaroseSCHARLAU50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting mediumVECTOR LABSH-5501
Synthetic mounting mediaMERCK100579
96% EthanolPROLABO20824365
99.9% Ethanol absoluteSCHARLAUET00021000
50% Glutaraldehyde solutionSIGMA-ALDRICHG6403-100ml
85% GlycerolMERCK104094
99.9% GlycerolSIGMA-ALDRICHG5516
Magnesium chloride hexahydrateSIGMA-ALDRICH63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40)SIGMA-ALDRICH542334
Nuclear Fast Red counterstainSIGMA-ALDRICHN3020
Paraffin pastillesMERCK111609
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICH158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets)SIGMA-ALDRICHP4417-50TAB
Potassium ferrocyanateMERCK1049840500
Potassium ferrocyanideMERCK1049731000
Sodium azideSIGMA-ALDRICHS8032
Sodium deoxycholateSIGMA-ALDRICH30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateSIGMA-ALDRICH106346
Sodium phosphate dibasic dihydrateSIGMA-ALDRICH71638
ThymolSIGMA-ALDRICHT0501
Tris hydrochloride (Tris HCl)SIGMA-ALDRICH10812846001 (Roche)
X-GALVENN NOVAR-0004-1000
XyleneVWR CHEMICALSVWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mmSAKURA4566
Rotatory MicrotomeLeicaRM2235
CassettesOxford TradeOT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mmVWRECN631-1575
Microscope slidesThermo Scientific, MENZEL-GLÄSERAGAA000001#12E
Adhesion microscope slidesThermo Scientific, MENZEL-GLÄSERJ1820AMNZ
Flotation Water bathLeicaHI1210
Disposable Low Profile Microtome BladesFeatherUDM-R35
Paraffin ovenJ.R. SELECTA2000205
Wax Paraffin dispenserJ.R. SELECTA4000490
StereomicroscopeLeicaDM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mLSIGMA-ALDRICHT2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mLSIGMA-ALDRICHT9661
Orbital shakerIKA LabortechnikHS250 BASIC
Stirring Hot PlateBibbyHB502
Vortex ShakerIKA LabortechnikMS1
Laboratory scaleGRAMFH-2000
Precision scaleSartoriusISO9001
pHmeterCrisonBasic 20
Optic fiberOptechPL2000

Ссылки

  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182(1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767(2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797(2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937(2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

136LacZ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены