На Ситу Микроскопия для определения одноклеточной морфологии в биопроцессах в режиме реального времени

Резюме

Для мониторинга размеров одиночных клеток непосредственно в клеточной подвеске было разработано фото-оптическое устройство для микроскопии. Измерение в реальном времени проводится путем соединения фотооптического стерилизационного зонда с автоматизированным анализом изображений. Морфологические изменения появляются с зависимостью от состояния роста и условий культивирования.

Аннотация

При наблюдении в микробных биопроцессах в основном ограничиваются химическими и физическими свойствами среды(например,значение рН и концентрация растворенного кислорода). Тем не менее, морфология клеток может быть подходящим индикатором для оптимальных условий, так как она меняется с зависимостью от состояния роста, накопления продукта и клеточного стресса. Кроме того, распределение одноклеточных размеров дает не только информацию об условиях культивирования, но и о неоднородности популяции. Для получения такой информации было разработано фото-оптическое устройство микроскопии¹ для мониторинга распределения размеров одноклеточных элементов непосредственно в клеточной подвеске в биореакторах. Автоматизированный анализ изображений связан с микроскопией на основе модели нейронной сети, которая обучается с аннотированными пользователями изображениями. Несколько параметров, которые приобретаются из захватов микроскопа, коррелируют с соответствующими особенностями процесса клеток, такими как их метаболическая активность. До сих пор, представленные на месте микроскопии зонд серии был применен для измерения размера гранул в нитевидных грибов суспензии. Он был использован, чтобы различать одноклеточные размеры в микроводорослей культивирования и связать его с липидным накоплением. Форма клеточных частиц была связана с бутонизации в дрожжевых культурах. Анализ микроскопии, как правило, можно разделить на три этапа: i) приобретение изображения, (ii) идентификация частиц и (iii) анализ данных, соответственно. Все шаги должны быть адаптированы к организму, и поэтому для достижения надежных результатов необходима конкретная аннотированная информация. Способность контролировать изменения в морфологии клеток непосредственно в строке или в режиме (в обходном проходе) обеспечивает в режиме реального времени значения для мониторинга и контроля, в разработке процесса, а также в производственном масштабе. Если данные в автономном режиме коррелируют с данными в реальном времени, то текущие утомительные измерения вне очереди с неизвестными влияниями на размер ячейки становятся ненужными.

Введение

Морфологические особенности клеток часто связаны с физиологическим состоянием, связь между формой и функцией существует для многих применений. На морфологию одной клетки влияет состояние роста, возраст клетки, осмотические и другие потенциальные клеточные стрессы или накопление продукта. Морфологические изменения клеток часто являются мерилом жизнеспособности роста культуры. Синтез внутриклеточного продукта, накопление липидов в водорослях и включение тела в бактериях, среди прочего, связаны с размером клеток, а также. Клеточная агломерация может быть еще одним фактором, который стоит исследовать, как обобщено недавно².

Неоднородность популяции может быть количественно определена на основе морфологических особенностей отдельных клеток. Исследования показали, что неоднородность в рамках культуры может быть значительным, например,в крупномасштабных производственных условиях³ общая урожайность может быть затронута низкой производительностью субпопуляций⁴.

Как правило, оценка морфологических особенностей клеток проводится путем ручного отбора проб или с помощью камеры потока в сочетании с фотооптическим устройством. Это приводит к нескольким ограничениям: ограниченное количество полученных данных вряд ли может обеспечить статистически достоверные измерения; задержка между выборкой и доступностью результатов может быть слишком длительной по сравнению с динамикой процесса; и самое главное, процедура отбора проб (расположение порта выборки, предварительная обработка образца до измерения, неблагоприятные условия в выборке или шунтирование) может вызвать предвзятую ошибку, поскольку сама процедура выборки уже может повлиять на клетку Морфология. Наконец, всегда существует высокий риск загрязнения во время отбора проб или в обходных растворах, если они не стерилизованы на месте.

Применение микроскопии на месте (ISM) может обойти некоторые из этих проблем. Если клетки обнаружены автоматически, то можно обследовать правильное определение их морфологических особенностей^5. До сих пор основными ограничениями этого метода были (i) время оценки изображений, которое было слишком длинным для приложений situ, и ii) плохое разрешение изображений, особенно при высокой плотности клеток. Хотя первые решения ISM включали механическую пробы, разбавление зонда, или были ограничены системой обхода^6,7, дальнейшие подходы позволяют захват ячейки подвески непосредственно 8 .

Последние достижения в ISM позволяют в линии или на линии мониторинга клеток на одноклеточной основе, которая обеспечивает распределение морфологических параметров в режиме реального времени непосредственно в клеточных суспензий при значительно высоких концентрациях клеток. Через офлайн-анализ ключевых параметров клеток можно определить корреляции с информацией, предоставляемой совмещенный автоматизированным обнаружением клеток и ISM. Затем достигаются новые конструкции мягких датчиков, в которых неизмеримый параметр оценивается с помощью одноклеточной морфологии.

В этом отчете ISM проводится путем соединения фотооптического зонда с автоматизированным анализом изображений. ISM состоит из однородчатого датчика зонда, который позволяет захват изображения в пределах известного диапазона фокусов в регулируемом зазоре измерения с камерой CCD высокого разрешения «MM-Ho » CCD GT2750 (2750x2200) и MM 2.1 CMOS G507c (2464x2056)». Освещение вспышки света осуществляется путем передачи. Таким образом, свет исходит от противоположной стороны камеры⁹ и его интенсивность может быть скорректирована. Клетки проходят непрерывно через этот зазор с жидким потоком. Таким образом, получается репрезентативная выборка населения. Зонд может быть установлен непосредственно на биореактор, так что он достигает в ячейки подвески, или он может быть использован в стерилижаемый обходной. Оболочка датчика подключена к системе до стерилизации, оптические части затем устанавливаются в оболочку.

До сих пор, соответствующие промышленные микроорганизмы, например,нитевидные грибы (диаметр до более 200 мкм), гетеротрофные микроводоросли Crypthecodinium cohnii (средний диаметр ячейки 20 мкм), и дрожжи Saccharomyces cerevisiae (средний диаметр ячейки 5 мкм), были исследованы с помощью этого или аналогичных устройств, которые описаны в ближайшее время.

Filamentous грибы, как правило, образуют гранулы при определенных условиях выращивания. Они имеют размер до нескольких сотен мкм. Гифы грибковых клеток развивают различную длину в зависимости от гидродинамического стресса в фазе жидкости. Это влияет на метаболическую и ростовую активность, поглощение субстрата и высвобождение продукта. ISM применялся для определения распределения размеров гранул и ширины зон с более низкой плотностью биомассы по краям гранул (собственные неопубликованные данные).

Размер C. cohnii изменяется между 15 и 26 мкм, когда клетки накапливают полиненасыщенную жирную кислоту докозагексаеновой кислоты (ДГК) под ограничением азота. Этот биотехнологический процесс производства ДГК состоит из двух частей: фазы роста, в которой клетки делятся и становятся меньше, и фазы производства, в которой клетки накапливают продукт и таким образом становятся больше. Таким образом, размер ячейки был использован для определения состояния процесса, в котором либо рост или производство ДГК было благоприятным. Наконец, была обнаружена корреляция между размером ячейки и содержанием ДГК. В этом случае ISM позволяет контролировать внутриклеточное накопление ДГК в режиме реального времени без необходимости отбора проб, нарушения клеток и общего анализа газовой хроматографии^10.

Начинающие дрожжи, как правило, размерот 3 до 8 мкм. Доля клеток, которые находятся в состоянии созревания в то время, как описано с начинающим индексом (BI), предоставляет информацию о жизнеспособности роста^11,12, и даже связь с рекомбинантной секреции белка было доказано¹³. С помощью ISM, подающий надежды и не-бутонизации дрожжевых клеток (клетки с и без бутона) были отмечены¹⁴. Стресс овечие условия могут также привести к более широкому изменению размера клеток в популяции дрожжей, как недавно показано в масштабе вниз культивирования, в котором условия крупномасштабных питательных ограниченных кормления-пакет культивирования были передразнил³.

Таким образом, ISM имеет потенциал для мониторинга жизнеспособности роста и формирования продукта на одноклеточном уровне на всех этапах биопроцесса для определения оптимальных условий культивирования, или для целей контроля процесса. Методы, описанные здесь, сосредоточены на микробных применениях с одиночными клетками, но также применимы к более крупным частицам, таким как клетки человека и животных, клеточные агломераты и гранулы нитевидных организмов.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги необходимы для адаптации параметров к соответствующим условиям микроорганизмов и культуры. Настройка настроек зонда длится около 20 минут для опытного пользователя. Подробное описание инструментов и шагов приведено в соответствующем руководстве по зондированию от SOPAT GmbH. В целом, инструменты, представленные в следующем протоколе, необходимы: i) контроллер зонда для регулировок зонда и приобретения изображения; ii) Фиджи (ImageJ) для аннотации на приобретенных изображениях; iii) поддержка SOPAT для обучения и создания искусственных нейронных сетей (ANN); iv) Batcher для обработки пакетов данных с использованием уже приобретенных изображений с рабочим процессом; v) Анализатор результатов для визуализации результатов и оценки пакетных обработанных изображений; и (vi) монитор для автоматизированного измерения в реальном времени и визуализации результатов.

1. Установка параметров оборудования

1. Подготовьте культуру с самой высокой концентрацией клеток, которая может быть достигнута в ходе эксперимента или центрифуги, и повторно приостановите гранулы для достижения этой концентрации. В этом случае для выращивания S. cerevisiae было выбрано 65 г L^-1 концентрации сухой биомассы.
2. Подготовьте различные разбавления, которые варьируются от самой высокой до самой низкой концентрации, так что ожидаемый диапазон полностью покрыт. Минимум 4 различных концентраций рекомендуется.
3. Определите диапазон размеров клеток микроорганизма с помощью обычной микроскопии. Определите ожидаемый максимальный диаметр (d_max)соответствующих ячеек. Это значение установлено до 8 мкм в случае S. cerevisiae.
4. Выберите два пробела измерения 5x и 10x ожидаемого d_max из ячеек.
5. Выберите максимальную интенсивность стробоскопа. Выберите интенсивность стробоскопа для обоих зазоров с самой высокой концентрацией клеток, чтобы клетки все еще были видны на изображениях с наименьшей интенсивностью света (самые темные изображения).
6. Выберите минимальную интенсивность стробоскопа, а затем выберите интенсивность стробоскопа для обоих пробелов, чтобы клетки все еще были видны на изображениях с наивысшей интенсивностью света (самые яркие изображения). Используйте самую низкую концентрацию клеток, которая, вероятно, появляется в период измерения.
7. Выберите одну позицию фокусировки, которая дает самые острые изображения для каждого разрыва измерения, как для интенсивности стробоскопа, так и для диапазона концентрации, который необходимо протестировать (см. шаг 2 для получения подробной информации о фокусировке). Фокус ячейки надлежащим образом, так что данные изображения могут быть аннотированы после этого (см. шаг 4).
8. Измерьте ранее подготовленную серию разбавления концентрации клеток (см. шаг 2) как с шириной разрыва, так и интенсивностью стробоскопа.

Рисунок 1: Инструмент калибровки концентрации. Левый графический интерфейс: набор каталогов изображений (минимум 3) с известными концентрациями; центральный графический интерфейс: выберите функции, которые будут рассчитаны по каталогу изображений; правый графический интерфейс: выберите взвешенную исходную среднее квадратную ошибку (WRMSE) для определения минимума. WRMSE и лучшая корреляция между любой функцией изображения и концентрацией клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

9. Оцените эксперимент серии разбавления.
   1. Используйте инструмент калибровки концентрации (CoCa) (см. рисунок 1),чтобы определить оптимальную корреляцию между извлеченными объектами изображения (яркость или резкость) и ранее измеренными концентрациями, предоставляемыми пользователем, например,сухой биомассой или количеством клеток. Следуйте инструкциям в руководстве по программному обеспечению для получения дополнительной информации.
   2. Определите оптимальную корреляцию между извлеченной информацией из объектов изображения в различных концентрациях по сравнению с любыми отлинейными измерениями. Смотрите легенду рисунок 1.
   3. Выберите наиболее разумный разрыв измерения и интенсивность стробоскопа при рассмотрении кривой корреляции концентрации с функциями, которые приводят к наименьшей взвешенной корневой средней квадратной ошибке (WRMSE).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зазор измерения фиксируется во время эксперимента, в то время как интенсивность стробоскопа может быть адаптирована в соответствии с концентрацией клеток.

2. Измерение вне линии

1. Отрегулируйте желаемый зазор измерения в соответствии с шагом 1 с помощью датчика толщины.
2. Откройте графический пользовательский интерфейс Probe Control на панели мониторинга SOPAT.
3. Подключите нужный зонд к усилительу в подразделе программного обеспечения Действия и нажмите Connect.
4. Нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать потоковуюпередачу (Live View).
5. Очистите зазор измерения путем распылять этанол в зазор и тщательно протрите любую пыль или грязь с оптической бумагой. Убедитесь, что стекло датчика не имеет частиц с Live View в CamControl.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частицы и пыль нарушают измерения и автоматическую идентификацию клеток.
6. Поместите сухую оптическую бумагу в зазор измерения. Откройте контроль зонда вкладки и отрегулируйте интенсивность стробоскопа, чтобы визуализировать бумагу. Поверните связывающий винт до тех пор, пока не будут четко видны одноволочные волокна бумаги.
7. Заполните трубку культивайным бульоном. Опустите микроскоп в культурный бульон так, чтобы зазор полностью покрылся клеточной подвеской. Откройте управление зондом вкладки и отрегулируйте нужную интенсивность стробоскопа в соответствии с разделом 1. Сосредоточьтесь на клетках, тонко настраивая связывающий винт фокусировки. Фокус больше не должен меняться во время эксперимента
   ПРИМЕЧАНИЕ: 5-6 мл культового бульона добавляют в коническую центробежную трубку 50 мл, чтобы достаточно поплавкаизировать измерительный зазор.
8. Определите количество кадров в точке времени в пользовательском интерфейсе в меню Триггерирование в GUI кадры на триггер. Установите количество кадров до 200 кадров на спусковой крючок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество кадров может быть уменьшено до самого низкого значения, которое необходимо для получения статистического достоверного результата. Это зависит от размера выборки, необходимого для получения репрезентативного распределения размеров морфологических клеток (см. также шаг 5).
9. Определите частоту кадров в меню Triggering в частоте GUI Frame. Выберите частоту кадров, которая гарантирует, что движущиеся частицы из предыдущего кадра не будут отображаться в следующем кадре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть доказано с помощью тестового триггера с 200 кадрами. Осмотрите изображения на наличие частиц, которые захватываются неоднократно. Если это так, уменьшите частоту кадров. Для отливных измерений рекомендуется 1 Гц.
10. Установите каталог, в котором будут сохранены приобретенные изображения, в меню General.
11. Выполните приобретение изображения, активировав кнопку приобретения триггера start image. Перемещение трубки с культурой подвески осторожно вверх и вниз, чтобы вызвать поток через измерительный разрыв.
12. Повторите шаг 2.5 после каждого измерения.
13. Проверьте приобретенные изображения. Клетки должны быть достаточно острыми для аннотации. Осмотрите изображения на наличие частиц, которые захватываются неоднократно. Если это так, уменьшите частоту кадров.
14. Сохраните настройки, выбрав следующий путь: C: «Программные файлы»SOPAT GmbH»MonitoringPrograms-camcontrol, и нажмите Сохранить.

3. Идентификация частиц

1. Аннотировать частицы для тренировки искусственной нейронной сети (ANN) (учебный набор).
   1. Загрузите приобретенные изображения в инструмент аннотации «Фиджи, ImageJ», перетащив и сбросив файл в окно Main «ImageJ» (см. GUI «Фиджи» инструмент на рисунке 2)
   2. Откройте менеджера roI, выбрав: Анализ Инструменты Менеджер roI.
   3. Выберите инструмент выбора. Рекомендуется инструмент wand (отслеживание), от руки, овальный или эллиптический выбор.
   4. Нарисуйте круг вокруг частицы, которая должна быть аннотирована с инструментами отбора, упомянутыми ранее, а затем уточнить его с помощью инструмента кисти.
   5. Добавьте аннотацию менеджеру ROI, нажав на добавить .
   6. Отметьте все объекты, представляющие интерес (клетки, которые будут идентифицированы) примерно на 15 изображениях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы охватить всю необходимую информацию, т.е. различные формы, размеры, концентрацию клеток, яркость и т.д.,используйте пять изображений с самого начала, пять изображений между ними и пять изображений с конца эксперимента.
   7. Решите, нужно ли классифицировать клетки в разных подклассах из-за их формы(например,различных фаз клеточного цикла), или если все клетки одного класса.
   8. Измените название каждой выбранной частицы соответственно. Установите одно имя или аббревиатив для каждого класса и счетчик для каждой частицы класса(например,cell_1, cell_2 и т.д.). Аннотировать не менее 50 частиц в классе.
   9. Не анонсировать объекты, которые не должны быть обнаружены, потому что они не имеют отношения к процессу, такие как пузырьки газа или другие частицы, такие как нерастворенные компоненты мультимедиа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти события не будут включены в процедуру обучения для ANN и будут рассматриваться в качестве фона.
   10. Не аннотировать клетки, которые находятся вне фокуса.
   11. Аннотировать изображения как можно более последовательной. Если есть сомнения, ярлык Игнорировать могут быть применены. Настоятельно рекомендуется не злоупотреблять его использованием, так как ANN будет распознавать только структуры, которые помечены.

Рисунок 2: Интерфейс пользователя инструмента Фиджи. Создается учебный набор с аннотированными изображениями. Изображена ручная аннотация, состоящая из двух классов, список аннотированных частиц показан в ROI Manager. Для разных классов можно установить различные названия и цвета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Сохраните аннотированные объекты и изображение в формате ЗИП и отправьте файл в сеть обучения либо через загрузку на платформу, либо отправив файл по электронной почте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для определения адекватных прогнозов классифицированных объектов на изображениях требуется ряд итеративных учебных раундов. Каждый учебный раунд приводит к рабочему процессу, который возвращается по программе.
3. Используйте рабочий процесс (кв.wf) с обученным алгоритмом распознавания объектов для анализа тестовых изображений с помощью программы,прогрессирующей пакет данных Batcher, которая может быть запущена в панели мониторинга.
4. Проверьте обнаружение объектов на тестовых изображениях с помощью количественной оценки ложноположительных и отрицательных событий.
   1. Количественное обнаружение ложноположительных событий: частицы ошибочно обнаружены как клетки, клетки, которые неправильно классифицированы, и клетки которых контур не был хорошо идентифицирован.
   2. Количественная оценка ложных негативных событий (ячеек, которые не признаются в качестве таковых).
5. Визуализируйте результаты в анализаторе результата инструмента, закрутив программу в панели мониторинга.
   1. Импортируйте файлы желаемых результатов с помощью файла Импортный файл или файл Импортные папки.
   2. Визуализируйте результаты по диаграмме Создайте диаграмму на графическом интерфейсе диаграмм.
   3. Выберите один из следующих вариантов: диаграмма распределения, график чувствительности, характеристика с течением времени, характеристика над точками опроса и функция против функции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Руководство по использованию анализа тона поставляется с системой, а также доступно из поддержки.
   4. Если результаты приемлемы, запустите рабочий процесс в Batcher на всех приобретенных изображениях эксперимента. В то же время программа мониторинга может быть создана путем объединения сохраненных настроек из контроллера зонда ('.pcfg) с рабочим процессом (к.wf), см. также руководство.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс также может быть использован для мониторинга будущих экспериментов для этого мультимедиа культуры.
   5. Если результаты неприемлемы, проверьте аннотацию на учебном наборе и/или продолжайте другой итеративный учебный раунд (см. шаг 4.2).

4. Количественная оценка размера выборки

1. Установите стандартное отклонение, которое приемлемо среди обнаруженных частиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартное отклонение изменяется параллельно однородности размера ячейки. Максимальное стандартное отклонение указывает на образец с наивысшей степенью неоднородности размера.
2. Установите амплитуда доверительного интервала или желаемую точность по отношению к ожидаемой дисперсии измерений (e).
3. Установите допущенную погрешность (я) между 5% (z_1-з/2 и 1,96) и 10% (z_1-з/2 и 1,64).
4. Рассчитайте количество клеток, которые будут идентифицированы из каждого класса из уравнения 1.
   (Уравнение 1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества ячеек, количество изображений, которые должны быть приобретены могут быть определены для каждой точки данных.
5. Выполните анализ чувствительности на случайных точках времени эксперимента, чтобы проверить, что анализ n частиц приводит к изменчивости среднего диаметра Feret и Dv90 менее 5%. Он может быть вычисляться автоматически в анализаторе результата.

5. На линии (By-Pass) или В линии измерения

1. Выполните процедуру измерения вне строки сначала (см. шаг 2) для того, чтобы установить аппаратные и программные настройки в качестве функции организма и процесса (концентрация или средства массовой информации).
2. Загрузите сохраненные настройки из предыдущего раздела, выбрав кнопку Нагрузка и выберите следующий путь: C: »Программные файлы»SOPAT GmbH'monitoringPrograms.camcontrol.
3. Подключите зонд к ячейке потока или к биореактору.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На месте измерения могут быть выполнены с щепоткой фланга.
4. Выполните стерилизации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Только увлажненный зондом материал инструмента стерилизован через паровую стерилизацию. Длина зонда смачиваемым может составить от 6 до 222 мм(рисунок 3).

Рисунок 3: Эскиз устройств ISM. Зонд MM-Ho(A) устанавливается непосредственно в биореакторе, в то время как зонд MM 2.1 (B) может быть использован в качестве объездного прохода. Циркули культового бульона отмечены стрелками на каждой картине. Коэффициенты конверсии 0,166 мкм пикс^-1 для MM-Ho и 0,087 мкм пикс^-1 для ММ 2.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

5. Определите скорость приобретения изображения в GUI Triggering в интервале триггерав поле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от динамики процесса, скорость приобретения изображения может быть адаптирована. Например, если ожидается период отставания в 3 часа, скорость приобретения может быть ниже, чем при смене метаболизма или накоплении продукта. Как правило, это требует гораздо меньше времени приобретения в минутном диапазоне. Например, последовательность приобретения изображения между 5 и 10 минутами во время выращивания пакетных дрожжей обеспечивает достаточную информацию для захвата динамики процесса.
6. Определите частоту кадров, как это объясняется в шаге 2.10.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В он-лайн и в линии измерений, частота кадров может быть увеличена, так как механическое перемешивание может увеличить скорость потока через зазор.
7. Начало приобретения изображения путем активации кнопки Начало потоковой передачи выбранного зонда.
8. Остановить приобретение, когда эксперимент закончен с кнопкой Остановить потоковое выбранного зонда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для^1-й перспективе, начать приобретение непосредственно перед прививкой культуры и приступить к шагу 4. Для следующих запусков откройте мониторинг программы в панели мониторинга и выберите созданный рабочий процесс (см. шаг 4). Начните мониторинг непосредственно перед прививкой культуры, нажав кнопку Play.

Результаты

Обнаружение размера клеток в дрожжевых культурах с ISM и автоматизированным обнаружением изображений для разграничения между бутонизации и не-бутонизации клеток была успешно проведена. И интенсивность stroboscope и выбор зазоризмерения имеют ряд допускаемости, в котором ?...

Обсуждение

ISM, представленный здесь с теми же или очень похожими устройствами, использовался для измерения морфологической динамики грибов, микроводорослей и дрожжевых клеток, что позволило определить активность роста, а в случае водорослей, внутриклеточного накопления продукта. Датчик не имеет...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensor MM 2.1 - MFC	SOPAT GmbH, Germany	n.a.	Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell
Sofware version v1R.003.0092	SOPAT GmbH, Germany	n.a.
Thickness gauge	n.n.		It can be any supplier, DIN 2275:2014-03
Ethanol 70%	n.n.		It can be any supplier
SOPAT manual Version 2.0.5	SOPAT GmbH, Germany
Optical lense paper	VWR	470150-460
Fiji, ImageJ	open source
50 mL conical centrifuge tubes			It can be any supplier