Быстрое на основе образа бактериальных вирулентности Assay, используя амебы

Резюме

Здесь мы представляем протокол для оценки вирулентности планктонные или придает поверхности бактерий, используя D. discoideum (амебы) в качестве хоста. Вирулентность измеряется в течение 1 ч и принимающих убийство количественно с помощью флуоресцентной микроскопии и изображения анализа. Мы демонстрируем это протокол, с помощью бактерий P. aeruginosa.

Аннотация

Традиционные вирулентности бактерий анализы включают длительное воздействие бактерий в течение нескольких часов, чтобы клетки хозяина. В это время бактерии могут претерпеть изменения в физиологии вследствие воздействия среды размещения роста и наличие клеток хозяина. Мы разработали assay быстро оценить состояние вирулентности бактерий, которые сводят к минимуму степень которой бактерий расти в присутствии клетки хозяина. Бактерии и амебы смешиваются и иммобилизованные на одной плоскости изображения с помощью площадку агар. В процедуре используется одноклеточных флуоресценции изображений с Флуорексон acetoxymethyl эфира (Флуорексон ам) в качестве показателя здоровья принимающей ячейки. Флуоресценции клеток хозяина анализируется после 1 h воздействия клеток хозяина бактерии с помощью эпифлуоресцентного. Программное обеспечение для анализа изображений используется для вычисления индекса убийство хоста. Этот метод был использован для измерения вирулентность в течение планктонных и придает поверхности синегнойной палочки подгрупп населения на начальном этапе биопленки и могут быть адаптированы для других бактерий и других стадий роста биопленки. Этот протокол обеспечивает быстрый и надежный метод измерения вирулентности и позволяет избежать многих сложностей, связанных с ростом и обслуживание линий клеток млекопитающих. Вирулентности фенотипов измеряется здесь, с помощью амёбы также были проверены с помощью мыши макрофагов. В частности создать что вирулентности upregulates поверхности насадку в P. aeruginosaбыл использован этот assay.

Введение

Бактериальная инфекция является одной из ведущих причин смертности в человека и животных^1,2. Возможность измерения вирулентности бактерий в культурах или биоплёнки имеет важное значение в настройки здравоохранение и исследований. Здесь мы описываем универсальный, быстрое и относительно простой метод количественной оценки вирулентности бактерий. Эукариотические организм сапротрофные discoideum (амебы) используется в качестве модели организм хозяина. D. discoideum используется в качестве узла для определения факторов вирулентности синегнойной палочки (P. aeruginosa)^3,,45 и другие бактерии^{6,7 ,8} и подвержены значительной же факторы вирулентности, которые убивают mammalian клеток, включая тип III секрецию^9,10. Предыдущих анализов вирулентности, используя D. discoideum участвовали длительного воздействия бактерий с D. discoideum клетки в течение часа^3,4,5. Протокол, здесь, представляет быстрый метод определения вирулентности, используя этот амебы. Этот протокол (рис. 1) описывает как: (1) растут амёбы axenically (в отсутствие бактерий), (2) растут бактерий для assay, (3) подготовить бактерий и клеток хозяина для микроскопии, (4) выполняют эпифлуоресцентного и (5) анализировать амебы флуоресцирование.

Амёб первоначально прожилками из замороженных запасов и выращенных на лужайке Escherichia coli (E. coli), где амёбы производят споры. Эти споры взял и прививку в обогащенных среду для стерильных роста. Амебы поддерживаются через стерильных роста в условиях питательн-богатые люди, пока они не готовы быть смешанной с бактерий для оценки вирулентности бактерий. Выживание или смерть амёбы количественно измеряя флуоресценции Флуорексон acetoxymethyl (Флуорексон AM), который расщепляется на внутриклеточную эстераз и, таким образом, активированный для флуоресценции^11,12. Живой амёбы проявляют мало или вообще не флуоресценции в то время, как подчеркнул и умирающие клетки флуоресцировать интенсивно. Этот результат обусловлен немного или не включение Флуорексон-ам в здоровых амеб и включения и расщепления субстрата в подчеркнул амёбы¹³. Это поведение особенно отличается от Флуорексон ам флуоресценции в mammalian клетках^11,14,,1516.

Бактерии, которые будут оцениваться для вирулентности выращивается отдельно. Здесь мы опишем, как измерить вирулентности оппортунистических патогенов P. aeruginosa и подробно, как количественной оценки вирулентности планктонных (плавание) и придает поверхности подгрупп населения. Этот протокол может быть адаптирована для проверки вирулентности других бактерий. В разделе представитель результаты, мы показывают, что вирулентности активируется в придает поверхности клетки и низка в планктонных клеток, который было сообщено ранее,¹³. Придает поверхности активированного вирулентности P. aeruginosa убивает амёбы пока не вирулентные планктонных клетки потребляются амёбы. Если является исключительно быть assayed вирулентности бактерий, планктонные, бактерии могут быть культивировали в обычных культуры трубы, а не с помощью Петри, как описано в протоколе.

Рост амеб и P. aeruginosa культур должна координироваться таким образом, что P. aeruginosa культур достичь этапа предполагаемого роста, в то время как амёбы растут в устойчивом состоянии в условиях питательн-богатые люди. Это условие обычно требует амёбы культур быть разведен по крайней мере за 1 день до, когда они смешиваются с бактериями. Амебы и бактерий карданной передачи были заблокированы с помощью агар колодки, совместно инкубирован за 1 ч и образы, используя низкое разрешение (10 X, числовая апертура 0,3), объективной, зеленый флуоресценции белков (ГПУП) фильтры и тепловизионной камеры. Анализ может быть выполнена с использованием свободно доступных ImageJ программного обеспечения или настроить программное обеспечение для анализа изображения. Наш анализ проводился с использованием собственного программного обеспечения, написанные с использованием научного анализа пакета¹³. Программное обеспечение должно создать маску с использованием фазы контраст изображения и извлекать значения флуоресценции из замаскированные области в изображении флуоресценции. Флуоресценции значения усредняются над по крайней мере 100 клетки, в результате в индексе убийство численные хоста.

протокол

Все экспериментальные процедуры проводились в университете Калифорнии в Ирвине.

1. буферов и решения

1. Подготовка бульон Lysogeny (LB) в стеклянной бутылке 1 Л, добавив 25 g LB-Миллер смеси в 1 Л двойного дистиллированной воды (ddH₂O). Для чашек Петри добавьте дополнительные 20 г агара. Автоклав для стерилизации. Налейте в 10 см диаметр Петри 25 мл расплавленный агар среды и позволяют укрепить при комнатной температуре. Хранилище жидких сред при комнатной температуре и плиты агара при 4 ° C.
2. Подготовить Пептон дрожжи глюкозы (мошенник) пластины в стеклянной бутылке 1 Л, смешивая 1 g D-глюкозы, 2 g Пептон, 0,25 г дрожжей экстракт, 4.2 g KH₂PO₄, 5.1 g Na₂HPO₄7 H₂O и 25 г агара в 1 Л ddH₂ O. автоклав для стерилизации. Налейте в 10 см диаметр Петри 25 мл расплавленный агар и позволяют укрепить при комнатной температуре. Хранить при 4 ° C.
3. Подготовка среднего Пептон S (PS) в стеклянной бутылке 1л путем смешивания 10 g Пептон, 7 г дрожжей экстракт, 15 g D-глюкозы, 0,12 г Na₂HPO₄7 H₂O, 1.4 g KH₂PO₄, 40 мкг витамин B₁₂ , и 80 мкг фолиевой кислоты в 800 мл ddH₂O. калибровки электронных pH-метр, с помощью рН 4 и рН 7 стандартов, если pH метр не был использован в течение дня.
   1. Измерение pH среды PS с помощью рН метр. Добавьте 5 M Кох или 5 М H₃PO₄ для регулировки рН 6,5. Окончательного громкость до 1 L с помощью ddH₂O. фильтр стерилизации с помощью вакуумного фильтра 0.22 мкм и хранить при 4 ° C.
      Примечание: Осторожно приступить корректировки рН, надевая защитное оборудование включая перчатки, Спецодежда, средства защиты глаз и защита лица.
4. Подготовка 10 x буфер премьер развития (DB') буфера в стеклянной бутылке 1 Л, добавив 3.4 g KH₂PO₄, 13.4 g Na₂HPO₄ 7 H₂O и ddH O₂общий объем 800 мл. Калибровка электронных pH-метр, с помощью рН 4 и рН 7 стандартов, если pH метр не был использован в течение дня.
   1. Измерение pH буфера с помощью электронных pH метр. Регулировка рН 6,5, осторожно добавив 5 M Кох или 5 М H₃PO₄ при необходимости. Измените конечный объем до 1 Л, с использованием ddH₂O и стерилизация автоклавированием. Хранить при комнатной температуре.
      Примечание: Осторожно приступить корректировки рН, надевая защитное оборудование включая перчатки, Спецодежда, средства защиты глаз и защита лица.
5. Сделать 1 x развития буфера (DB), смешивая 100 мл 10 x DB' буфер с 1 мл раствора стерилизованное MgCl 2 M₂, и 1 мл стерилизованные CaCl 1 М₂. Отрегулируйте окончательный объем до 1 Л в стеклянной бутылке 1 Л с помощью газобетона стерилизованные ddH₂O. хранить при комнатной температуре.
6. Подготовка среднего PS:DB в стеклянной бутылке 1 Л, смешивая 100 мл стерилизовать среды PS, стерилизованные 100 мл 10 x DB' буфер и стерилизовать ddH₂O к общим объемом 1 л дополнения с 1 мл стерилизованное MgCl 2 M₂ и 1 мл стерилизованные 1 M CaCl ₂. хранить при 4 ° C.
7. Подготовьте раствор Флуорексон ам, добавляя 50 мкл ДМСО 50 мкг Флуорексон-ам в пластиковый контейнер, поставляемые производителем. Хранить при температуре от-20 ° C.

2. роста и поддержания амёб

1. Расти штамм E. coli B/r¹⁷ как источника пищи для амёб в период начального роста. Полоска E. coli от замороженных складе B/r температуре-80 ° C на плиту LB агар и инкубировать при 37 ° C ночь для получения единого колоний.
2. Прививок одной колонии E. coli B/r в 2 мл среды LB и инкубировать в барабан ролика или шейкер при 37 ° C на ночь.
3. Принесите на ночь культуры е. coli до комнатной температуры. С помощью деревянной палочкой, прививать амёбы из замороженных запас хранится при температуре-80 ° C в 750 мкл ночь культуры.
   Примечание: Использование D. discoideum штамм AX3, который способен стерильных роста¹⁸. Этот шаг не требуется стерильных роста, но последующие шаги будут иметь его требование.
4. Сразу же 700 мкл смесикишечной амёбы - на тарелку Пептон дрожжи глюкозы (мошенник). Распространение культуры равномерно на поверхности пластины, наклоняя его назад и вперед и стороны в сторону при необходимости. Избегайте использования разбрасывателя.
5. Место пластину мошенник с агар вверх в поле, которое поддерживает высокой влажности. Используйте два одноразовые пластиковые контейнеры (183 x 183 см x 91 см) укладываются на вершине друг друга. Заполните контейнер с приблизительно в 25 мл воды и поместите верхний контейнер с несколькими 0,5 см диаметр отверстия, просверленные через пол контейнера чтобы влага переехать из водохранилища в верхнем контейнере.
6. Инкубируйте мошенник пластина и коробка при 22 ° C для 4-5 дней до тех пор, пока спор амебы наблюдаются, растущих вблизи поверхности пластины (рис. 2). Используйте Охлаждаемые инкубаторы для инкубации пластины, вместо того, чтобы инкубации при комнатной температуре.
   Примечание: После того, как спор выросли, они остаются жизнеспособными на пластины на несколько недель при температуре 4 ° C. Храните пластины с агар стороной вверх. После 3-4 дней инкубации может наблюдаться зон очистки в пределах бактериальных газон, которые указывают начала заспорение амебы.
   1. Наблюдать за небольшой амёбы споры над поверхностью пластины после 4-5 дней инкубации (рис. 2).
      Примечание: Не растут амёбы дольше, чем неделю, как качество споры уменьшается за этот период времени.
7. Собирайте амеб споры подготовить для стерильных роста амёб, потрясающим кончик 1 мл стерильной пипеткой параллельно поверхности пластины. Соберите споры от половины 10 см Петри.
   Примечание: Не прикасайтесь кончик на поверхности агара пластины, как это движение будет собирать большое количество кишечной палочки.
8. Ресуспензируйте амёбы на кончике пипеткой, погружая кончик в 1 мл среды PS и аккуратно закупорить вверх и вниз.
9. Передача смеси привитых в 250 мл флакон, содержащий 25 мл среды PS, дополнена антибиотик противогрибковое решения на 0,25 x концентрации.
   Примечание: Сохранить антибиотик противогрибковое решение как 250 мкл аликвоты при-20 ° C. Избегайте повторяющихся циклов оттаивания и замораживание данного решения, как это может снизить ее эффективность.
10. Растут амёбы axenically при 22 ° C в шейкере вращающийся при 100 об/мин. Для assay вирулентности в шаге 5, растут клетки оптической плотности, измеренная на 600 Нм (₆₀₀OD) 0.2 до 0.5.
    Примечание: Этот шаг требуется 3-4 дней роста с момента прививки (шаг 2.7). Если клетки выросли до более высокой плотности, разбавленных в культуре обратно в PS средне-ОД₆₀₀ 0,05 или ниже и расти обратно к ОД₆₀₀ 0.2 до 0.5.

3. рост P. aeruginosa

1. Выбрать одного Колония P. aeruginosa от пластины LB, прививать в 2 мл PS:DB культуры и расти на ночь при 37 ° C до насыщения.
   Примечание: Не добавляйте антибиотик противогрибковое решения к PS:DB средствам массовой информации.
2. Разбавьте ночь культуры 1: 100 или 1:1,000 в чашке Петри 6 см в диаметре, с помощью PS:DB. Если вирулентности планктонных клеток является исключительно быть assayed, расти культур с использованием обычных культуры трубы вместо. Встряхнуть культуры на benchtop вращателе установлен на 100 об/мин при температуре 37 ° C.
3. Урожая культур в определенное время точках для обеспечения воспроизводимости. В 30 мин до 1 часа до оценки вирулентности Подготовьте площадку агар, как описано в разделе 4.
   Примечание: Вирулентности в P. aeruginosa индуцируется примерно в 8 ч роста на поверхностях.
4. Изолировать придает поверхности клетки, удалите жидкой среды из Петри, немедленно промыть 1 мл DB буфера для удаления планктонных клеток и переходите сразу к шагу 5.1.
   Предупреждение: Не мойте дольше, чем 30 s, как это будет возмущают и отсоединение придает поверхности клетки и могут повлиять на измерение вирулентности.
5. Чтобы изолировать планктонных клетки, передать чистый Петри 10 мкл культуры от Петри блюдо и сразу перейти к шагу 5.1.

4. микроскопия - подготовка агар Pad

1. Перед амёбы готовы быть смешанной с P. aeruginosa, подготовите агар колодки около 30 мин до 1 часа.
2. Микроволновая печь 50 мл 1% (w/v) агар в буфере DB в 250 мл флакон. Mix каждые 20 s до скопления агар исчезают.
3. Охладите расплавленный агар, поместив его в разогретой до 55 ° C водяной бане 15 мин.
4. 15 мкл Стоковый раствор Флуорексон ам, по 15 мл расплавленный агар в коническую пробирку. Смешайте нежно инвертирование трубка 4 - 5 раз и немедленно приступить к следующему шагу.
   Примечание: Выполните этот шаг в полипропиленовые 15 мл пластиковых пробирок. Не используйте контейнер толстого стекла, как это вызовет агар закрепить слишком быстро.
5. Залить расплавленный агар смесь на вершине стеклянной пластины 12 x 10 см и позволяют агар затвердеть в течение 10 минут при комнатной температуре. Вырежьте затвердевших агар pad на более мелкие разделы 1,5 x 1,5 см, поместив стеклянную пластину над печатной сетки и резки по сетке с помощью металлической линейки.
6. Держите гель гидратированных в коробке влажный, до тех пор, пока он будет готов к использованию.

5. микроскопия - Подготовка образца бактерии амебы для изображений

1. Для анализа вирулентности придает поверхности бактериальной клетки, мкл 10 амебы клеток из шага 2.10 придает поверхности бактерии из шага 3.4.
   Примечание: Этот шаг описывает смешивания амёб с бактериями.
2. Для анализа вирулентности планктонных клеток, Смешайте 10 мкл амебы клеток из шага 2.10 с 10 мкл планктонных бактерий из шаг 3.5.
   Примечание: Не мойте axenically выросли амебы клетки (на од₆₀₀ от 0,2 до 0,5) перед смешиванием с бактериями. E. coli рост будет наблюдаться в амеба культуры за счет использования антибиотиков противогрибковое решения.
3. Немедленно Поместите панель агар Флуорексон AM 1,5 x 1,5 см от шага 4.5 поверх смесь бактерий амебы на поверхности Петри.
   Примечание: Место агар pad на верхней части смеси, используя быстрый плавного движения. Не ниже площадку медленно на смеси, как это движение, как правило, нажимаем клетки к периферии и от нижней площадки. Этот шаг обеспечит бактерий и амебы равномерно смешанные, иммобилизованных и что оба ячейка типы ограничиваются той же плоскости.
4. Удалите лишнюю жидкость, нежно закупорить, любые оставшиеся жидкость, окружающих агар pad. Разрешить Петри для просушки на 20 мин при комнатной температуре.
5. Обложка с Петри блюдо с крышкой и инкубировать иммобилизованных амебы бактерии смесь при комнатной температуре для дополнительных 40 мин переходите к шагу 6.1.
   Примечание: Важно для инкубации все образцы для одинаковое количество времени, как фон флуоресценции увеличивается с течением времени. Рекомендуется время инкубации 1 ч. Инкубаций более чем на 1 час меньше воспроизводимость как амёбы клетки могут начать лопнуть.

6. микроскопия - получение изображения

1. Амебы изображения с помощью микроскопа флуоресценции способны получения brightfield и зеленая Флуоресценция изображений. Для зеленой флуоресценцией, используйте зеленый флуоресценции белков (ГПУП) фильтры с 474/27 Нм и 525/45 Нм для возбуждения и выбросов, соответственно. Используйте объектив (≥0.3 числовая апертура) 10 X для изображения амебы.
   Примечание: Флуорексон ам в агар приведет к умирающей амёб к флуоресценции в канале зеленой флуоресценцией. Здоровые амёбы иначе не флуоресцентные.
2. Отрегулируйте время приобретения для фазового контраста, GFP каналы ограничить Фототоксичность, и оптимизировать динамический диапазон изображения света. При необходимости замените Фазовый контраст контрастность (DIC) дифференциальной помехи.
   Примечание: Используйте 100-200 мс воздействия для фазового контраста и флуоресценции GFP, если это возможно. Сохранить параметры экспозиции и инструмента, без изменений на протяжении всего эксперимента. Это критически важно для вычисления индекса убийство хост.
3. Приобрести изображений для по крайней мере 100 амебы клеток для получения качественных статистических данных для расчета принимающей убийство индекс.

7. анализ и принимающих убийство индекс изображений

1. Выполните анализ изображений с помощью ImageJ.
2. Откройте файл изображения контрастность фазы в ImageJ, нажав на файл | Открыть и выбор образа. Отрегулировать порог, нажав на изображения | Анализ | Порог. Отрегулируйте нижний и верхний порог для выбора только интенсивность пик (рисA).
3. Преобразовать изображение в двоичный файл, нажав кнопку процесс | Двоичные | Сделать бинарный. Заполнить дыры, выбрав процесс | Двоичные | Заполнить отверстия.
   Примечание: Использование изображения на рисунке 1 в качестве источника, шаги 7,1-7.2 будет производить изображение, в котором амеб и придает поверхности бактерии появляются как темные области (Рисунок 3B).
4. Убедитесь, что поля область и означает значение серого проверяются в анализ | Задать размеры. Измерьте приблизительный размер амёб, выбрав инструмент Овал на главной панели инструментов. Нажмите кнопку анализ | Мера и отмечаем области представитель амебы.
5. Создание маски для амёб, нажав анализ | Анализ частиц. В поле Размер введите область, которая будет включать амёб, но исключить бактерии. Выбор маски в раскрывающемся меню для параметра Показывать. Убедитесь, что установлен флажок добавить диспетчер .
6. Нажмите кнопку OK и изображения показаны только амеб и ROI менеджер, что появится диалоговое окно (рис. 3C).
7. Откройте изображение флуоресценции, с помощью файла | Открыть и выбрав соответствующий файл. Выберите все регионы в ROI менеджер , удерживая нажатой клавишу Shift и нажатие на каждый регион в списке (рис. 3D).
8. Нажмите кнопку измерения в ROI менеджер. Это откроет окно результатов значение средней интенсивности каждого амебы.
9. Скопируйте значения флуоресценции для каждого амеба в программу электронных таблиц и рассчитать принимающей убийство индекс, принимая среднее всех значений флуоресценции.

Результаты

Мы росли одичал тип P. aeruginosa штамм PA14¹⁹ или ΔlasR напряжение²⁰ в же фон PA14 в 6 см в диаметре Петри и assayed вирулентности планктонных и придает поверхности клеток. Культур были привиты от одного колоний в PS:DB культур, выращенных на ночь в культ...

Обсуждение

Этот протокол описывает быстрое и количественный метод для анализа вирулентности в P. aeruginosa. Этот протокол может испытываться с другими бактериями. Однако важно иметь в виду, что средство роста должны быть совместимы с условиями роста амебы. В частности мы оптимизировали протокол, ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Bacto agar, dehydrated	BD Difco	214010
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Life Technologies	15240062	Aliquot < 1 mL and store at -20 °C
Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)	Life Technologies	C34852	Calcein Acetoxymethyl (AM)
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glucose	Fisher Chemical	D16500	Dextrose
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Yeast extract	Oxoid	LP0021
Special peptone	Oxoid	LP0072
Potassium hyroxide	Fisher Chemical	P250
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Chemical	S373
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V2876
Strains
Dictyostelium discoideum	Siryaporn lab	Strain AX318
Escherichia coli	Siryaporn lab	Strain B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn lab	PA14	PA14 strain19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Siryaporn lab	AFS20.1	PA14-derived strain20
Supplies
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE	For filter sterilization
Conical tube, 15 mL	Corning	352097
Glass storage bottles	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petri dish, 6 cm diameter	Corning	351007	60 x 15 mm polystyrene plates
Petri dish, 10 cm diameter	Fisher	FB0875712	100 x 15 mm polystyrene plates
Plastic containers with lid	Ziploc	2.57E+09	Square 3-cup containers
Glass plates	Bio-Rad	1653308	For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.
Wooden sticks	Fisher	23-400-102
Equipment
Eclipse Ti-E microscope	Nikon	MEA53100	Microscope setup
10X Plan Fluor Ph1 objective  0.3 NA	Nikon	MRH20101	Microscope setup
Fluorescence excitation source	Lumencor	Sola light engine	Microscope setup
Fluorescence filter set	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Microscope setup
Orca Flash 4.0 V2 Camera	Hamamatsu	77054098	Microscope setup
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software for image analysis
MATLAB	Mathworks	R2013	Software for image analysis
Orbital shaker incubator	VWR	89032-092	For growth of bacteria at 37 °C
Platform shaker	Fisher	13-687-700	For growth of amoebae at 22 °C
Spectrophotometer	Biochrom	Ultrospec 10
Undercounter refrigerated incubator	Fisher	97990E	For growth of amoebae at 22 °C
Isotemp waterbath	Fisher	15-462-21Q	For cooling media to 55 °C