Создание модели рака молочной метастатической мышиных ортотопическая и выполняя мышиных радикальная мастэктомия

Резюме

Мы представляем мышиных ортотопическая груди Рак и радикальной мастэктомии модели с технологией биолюминесценции для количественного определения опухолевых бремя для имитации прогрессии рака молочной железы человека.

Аннотация

In vivo мыши модели для оценки прогрессии рака молочной железы имеют важное значение для исследований рака, включая доклинические наркотиков события. Однако большинство практических и технических деталей обычно опущены в опубликованной рукописи, которые, таким образом, делает его сложно воспроизвести модели, особенно когда речь идет о хирургических методов. Биолюминесценции технология позволяет для оценки небольших количеств раковых клеток, даже тогда, когда опухоль не ощутима. Используя выражения Люцифераза раковые клетки, мы устанавливаем техника прививка ортотопическая рака груди с высоким tumorigenesis ставкой. Метастазы в легких оценивается, используя технику ex vivo . Мы, затем создать модель мастэктомии с низкой местных рецидивов показатель для оценки бремени метастатические опухоли. Здесь мы, подробно описать, хирургические методы имплантации ортотопическая и мастэктомии рака молочной железы с высоким tumorigenesis скоростью и низкой местных рецидивов цены, соответственно, для повышения эффективности модели рака молочной железы.

Введение

Животные модели играют ключевую роль в исследовании рака. Когда гипотеза это доказано в лабораторных условиях, он должны быть протестированы в естественных условиях оценить его клиническое значение. Прогрессии рака и метастазы часто лучше захвачен животных моделей по сравнению с моделями в пробирке, и важно, чтобы проверить новый препарат в животной модели как доклинические исследования наркотиков развития^1,2. Однако технические детали экспериментов на животных, часто не хорошо описана в опубликованных статьях, что делает его сложно воспроизвести модель успешно. Действительно авторы, которые создали эти ортотопическая прививки и мастэктомии модели прошли через длинные и строгий процессов методом проб и ошибок. Показатель успеха tumorigenesis после прививки клеток рака является одним из ключевых факторов для определения успеха и эффективности животного исследование³. Линии клетки и количество клеток для прививок, прививка сайта и штамм мышей находятся все важные факторы. Хорошо известно, что существуют огромные различия в результатах экспериментов на животных из-за индивидуальных различий, по сравнению с методами в пробирке. Таким образом получить стабильные результаты, чтобы улучшить эффективность экспериментов на животных и избегать вводящих в заблуждение результатов важно использовать устоявшиеся модели со стандартным методом.

Этот документ содержит⁴ устоявшихся методов для создания модели мыши ортотопическая и мастэктомии рака молочной железы. Целями этих методов являются 1) имитировать прогрессии рака молочной железы человека и курсов лечения и 2) для проведения в экспериментах in vivo с большей эффективностью и более высокие показатели успеха, по сравнению с мастэктомии методы или другие прививки рака молочной железы. В ортотопическая раковых клеток прививка чтобы имитировать прогрессии рака молочной железы человека, мы выбираем #2 молочной железы жировой ткани как прививка сайт, который расположен в грудь. В большинстве исследований, клеток рака молочной железы привиты подкожно⁵. Этот метод не требует хирургического вмешательства, и, таким образом, он является простым и понятным. Однако подкожной микроокружения довольно сильно отличается от микроокружения молочной железы, что приводит к прогрессии рака различных и даже молекулярных профили^6,7. Некоторые исследования используют #4 молочной железы, который расположен в живот, как прививка сайта⁶. Однако поскольку #4 молочных желез расположены в животе, чаще метастатические шаблон является перитонеальный рак⁷, которое происходит с менее чем 10% рака молочной метастатической⁸. Генерируемые технику, представленные здесь, в #2 молочной железы, рак молочной железы метастазы в легких, который является одним из наиболее распространенных рака молочной железы метастатические узлы⁹.

С этой техникой целью является также достичь более высокую ставку tumorigenesis с изменчивостью размера минимальной опухоли, по сравнению с другими методами прививки рака молочной железы. Для этого, раковые клетки, приостановлено в желатиновую белка смесь являются прививку под прямое видение через разрез средний передней грудной стенки. Этот метод производит высокий tumorigenesis курс с меньше изменчивости в опухоли размером и формой, по сравнению с подкожной или нехирургических инъекции, как сообщалось ранее^3,7.

Мы также представляем методом радикальной мастэктомии мыши, в котором опухоли груди ортотопическая резецируется с окружающих тканей и подмышечные лимфатические узлы. В клинических условиях, стандарт медицинской помощи для больных раком молочной железы без отдаленных метастазов болезни является мастэктомии^10,11. Перед мастэктомии подмышечных лимфатических узлов метастазы обследована изображений и дозорный биопсии лимфатических узлов. Если нет никаких доказательств подмышечных лимфатических узлов метастазы, пациент затем рассматривается с полной или частичной мастэктомии, в котором пропущен резекции подмышечных лимфатических узлов. Всего мастэктомии является техника иссечения рака молочной железы с ткани всей груди целиком, тогда как частичной мастэктомии иссечения рака молочной железы с запасом окружающих тканей нормальной груди только, таким образом сохранение оставшихся нормальных грудной ткани в пациента. Однако пациенты сохранить оставшиеся ткани нормальной груди после частичной мастэктомии требуют послеоперационной лучевой терапии, чтобы избежать рецидивов¹⁰. Пациенты, которые подмышечных лимфатических узлов метастазы проведения радикальной мастэктомии, который удаляет рака молочной железы с всеми нормальной груди ткани и подмышечных лимфатических узлов и вторгся в тканях en блока^10,11. В модель мыши наблюдения для подмышечных лимфатических узлов метастазы и/или послеоперационного излучения не является разумной или осуществимо. Таким образом мы используем метод радикальной мастэктомии избежание местные или подмышечных лимфатических узлов метастазы.

Прививка клетки рака через Вену хвост является наиболее распространенных легких метастазов мыши модель¹², так называемой «экспериментальный метастазов». Эта модель легко генерировать и не требует хирургического вмешательства; Однако она не имитировать прогрессии рака молочной железы человека, который может привести к поведению различных метастатической болезни. Чтобы имитировать курс лечения рака молочной железы человека, где метастазы часто возникает после мастэктомии, первичная опухоль удаляется после прививки клеток рака ортотопическая. Этот метод производит меньше рецидивов по сравнению с резекции опухоли простой, как ранее сообщалось¹³и полезно для Роман терапии, доклинические исследования и для метастатической груди Рак исследований. Методы, описанные здесь, применимы для большинства рака молочной железы ортотопическая модель экспериментов. Однако важно учитывать, что желатиновой белка смесь может повлиять на микроокружения и хирургия может повлиять на стресс/иммунный ответ¹⁴. Таким образом исследователи, изучая микроокружения и/или стресс/иммунный ответ должны быть осведомлены о возможности смешанных факторов.

протокол

Одобрение от Розуэлл парк всеобъемлющей Рак центр институциональных животное уход и использование Комитета был получен для всех экспериментов.

Примечание: Девяти до двенадцати недель старый самок мышей BALB/c получены. 4T1-luc2 клетки, линия клеток молочной железы аденокарцинома мыши производный от мышей BALB/c, была разработана для Экспресс Люцифераза, используются. Эти клетки культивировали в Розуэлле парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 среде с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС).

1. Подготовка документов

1. Оттепель замороженных желатиновой белка смесь (например, Matrigel) на льду в культуре ткани капюшоном.
2. Чистота и автоклав двух наборов хирургических инструментов (microdissection ножницы, пинцет Adson и иглодержатель) до операции. Подготовить стерилизовать 5-0 шелковыми швами и сухой sterilant (когда последовательные операции планируются).
3. Клип средней груди волосы мышей с помощью машинки и Марк мышей для идентификации штамповкой уха до времени операции.
4. Подготовьте таблице процедуры, которые могут быть немедленно использованы для операции.
   1. Распространения Впитывающим вкладышем и исправить углы с лентой, исправить анестезии головных конусов с лентой, положить sterilant и дезинфицирующих средств (хлоргексидин, йода и 75% этиловом спирте) рядом с рабочего пространства и место мышей в порядке операции.

2. Подготовка клеток (10 мышей)

Примечание: Клетки должны быть прививанным в течение 1 ч после отсоединения от блюдо, чтобы избежать жизнеспособность сокращение клеток. В частности суспензию клеток должна быть смешанной в желатиновую белка смесь в течение 15 минут после отсоединения клетки от блюдо для поддержания их жизнеспособность.

1. Культура клеток 4T1-luc2, линия клетки молочной железы аденокарцинома мыши, выражая Люцифераза, в средствах массовой информации RPMI 1640 с 10% FBS в увлажненные инкубатора при 37 ° C в 5% CO₂.
2. Вымойте клетки сторонником 4T1-luc2 в 10 см блюдо с фосфат амортизированное saline (PBS), с помощью Пипетки серологические 10 мл. Добавьте 1 mL трипсин 0.25%, с помощью пипетки P1000 и, затем, инкубации образца при 37 ° C за 5 мин. Затем, добавить 4 мл питательных сред (RPMI 1640 с 10% FBS) с помощью 5 мл серологических Пипетка и передать 15 мл конические в культуре ткани капюшоном суспензию клеток. Центрифуга суспензию клеток на 180 x g за 5 мин.
3. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в 2 мл PBS; затем подсчитать ячейки, используя Горяева.
4. Приостановите 2 х 10⁶ клеток 4T1-luc2 в 40 мкл холодной PBS (рН 7,4, 4 ° C) в культуре ткани капот.
5. Смешайте 40 мкл суспензии клеток с 360 мкл желатиновой белка смеси в трубу microcentrifuge 1,5 мл на льду в культуре ткани капот.
   Примечание: Окончательный концентрация составляет 1 x 10 мкл⁵/20 (1:9 PBS: желатиновой белка смесь). Для модели ортотопическая (без мастэктомии) 1 x 10 мкл⁴/20 конечная концентрация был использован, чтобы избежать достижения эвтаназии критерии (опухоль размер > 2 см) в течение двух недель.

3. рак клеток прививка

1. Положите мышей в зале индукции анестезии с 2-4% изофлюрановая и 0,2 Л/мин поток кислорода, до тех пор, пока мышей дышать спокойно (2-3 мин).
2. Захватить мышь и придать ее плечо бупренорфин 0,05 мг/кг подкожно.
3. Подтвердите адекватной анестезии, отсутствие реакции на щепотку мыс. Вставьте в отверстие мыши маски, которая позволяет ингаляционных анестезии с 2-4% изофлюрановая и поток кислорода 2 Л/мин, прилагается к блоку угольного фильтра нос мыши.
4. Сдерживать мыши конечностей с помощью ленты лаборатории и стерилизовать свою кожу с помощью хлоргексидина, йода и 75% этанола, с помощью ватных тампонов.
5. Сделать 5 мм разрез в середине передней грудной стенки, используя стерильные microdissection ножницы, подъемник правой стороне кожи рядом с разрез и отделить кожу от грудной стенки, используя ножницы, а затем инвертировать кожи подвергать право #2 молочной железы жировой ткани.
6. Осторожно внедрять 20 мкл суспензии клеток рака с помощью инсулина 1 мл шприц с иглой 28,5 G в жировой ткани под прямое видение через рану.
   Примечание: Игла проходит через рану, не кожи. Держите держа иглу в жировой ткани за 5 s до потянув его, который позволяет время для желатиновых белка смесь затвердеть.
7. Закройте разрезов кожи путем сшивания, используя стерильные 5-0 не рассасывающиеся шовные материалы.
8. После операции, вернуться животных в клетке чистой и контролировать их, пока они выздоровели и движутся свободно (после ~ 1-2 мин). Если животное не в добром здравии в течение 24 ч хирургии, администрировать бупренорфин (0,2 мг/кг).
9. Удаление швов под наркозом (см. шаг 3.1) 7 d после операции.

4. мастэктомии

Примечание: Очень важно время мастэктомии. Если это делается слишком рано, метастаз в легких не происходит. Если это делается слишком поздно, первичной опухоли захватила крупных кровеносных сосудов, которые усложняют полной резекции онкологических. Таким образом несколько моментов времени были протестированы для мастэктомии определить, какой момент производится надлежащего баланса в ожидании метастазов, прежде чем резекции стала слишком сложной. После этого в более чем 50 мыши экспериментов, было продемонстрировано, что идеал мастэктомии в 8 дней после прививки клеток рака (или когда размер опухоли достигает 5 мм) время точкой для достижения надлежащего соотношения между¹³.

1. Анестезировать мышь с изофлюрановая 2-4% вдыхании и придать бупренорфин (см. шаги 3.1 и 3.2).
2. Сдерживать мыши и стерилизовать его кожи (см. шаг 3.4).
3. Сделать 5 мм Кожный разрез 2 мм слева от хирургического шрам, который был сделан в начальной рака клеток прививка, используя ножницы microdissection. Расширить разрез к корню передних конечностей по удалению опухоли, кожи, включая хирургические шрам и поражения при контакте с опухоли, а также бассейне подмышечных лимфатических узлов, в которой большую часть времени нет видимых лимфатических узлов существует в то время mastect Мики¹³. Убедитесь в том, чтобы не повредить подмышечные вен.
4. Закройте дефектов кожи путем сшивания, используя стерильные 5-0 не рассасывающиеся шовные материалы в форме «Y».
5. То же самое, как в шаге 3.8, вернуть Мышь чистой клетке и монитор до тех пор, пока они выздоровели.
6. Удаление швов под наркозом (см. шаг 3.1) 7 дней после операции.

5. биолюминесцентных количественной оценки первичной опухоли (ортотопическая прививки без мастэктомии) или легких метастазов (мастэктомии модель)

Примечание: Для количественной оценки бремени первичной опухоли биолюминесценции находится измеренное 2 x в неделю на следующий день после прививки ортотопическая. Для количественного определения метастаз легких биолюминесценции является измеренных 2 x в неделю на следующий день после мастэктомии.

1. D-люциферин растворяют в Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) до конечной концентрации 15 мг/мл в культуре ткани капюшоном. Аликвота его в microcentrifuge свет экранированный 1,5 мл пробирок. Магазин разбавленный раствор при температуре-80 ° C.
   Примечание: Для мыши 20 g 200 мкл разбавленного D-люциферин не требуется.
2. Откройте изображений программное обеспечение и нажмите кнопку инициализировать.
   Примечание: Она занимает около 15 минут для охлаждения зарядовой (связью ПЗС). Когда КБО достигнет установленной температуры, цвет панели температуры изменяется с красного на зеленый.
3. Анестезировать мышей с 2-4% изофлюрановая в камере выделенный индукции до изображений (см. шаг 3.1).
4. Взвешивание мышей.
5. Придать 150 мг/кг D-люциферин внутрибрюшинно точке середине живота, с помощью иглы 28,5 G.
6. Установите каждый мышь с носовой конус внутри система электронного фотографирования в лежачем положении (место максимум пяти мышей в то же время). Поддержание анестезии в изофлюрановая 1% - 3% (в 100% кислорода) через конусов нос во время визуализации.
7. Захват изображения каждые 5 минут для обнаружения пик биолюминесценции для 50 мин (или до биолюминесценции подтвержденных пик).
   1. Выберите люминесценции как Авто, биннинг как средствои поле зрения как D.
   2. Нажмите кнопку получить для захвата изображения.
8. Вернуть их cage(s) мышей и контролировать их, пока они оправились (см. шаг 3,8).

6. легких метастазов опухоли бремя количественной, Ex Vivo изображений

Примечание: Легких метастазов количественная оценка применима для ортотопическая прививки, так и без мастэктомии модели. В модели мастэктомии ex vivo изображений или выживание наблюдения выбирается в зависимости от цели. В ортотопическая модели прививка (без мастэктомии) большинство случаев производят критерии эвтаназии размер первичной опухоли (> 2 см) приблизительно в 21 дней после прививки.

1. Количественно метастатического поражения легких через 21 день после прививки клеток рака, ex vivo изображений.
2. Анестезировать мышей с 2-4% изофлюрановая в камере выделенный индукции (см. шаг 3.1).
3. Взвешивание мышей.
4. Придать 150 мг/кг D-люциферин внутрибрюшинно (см. шаг 5.6).
5. Усыпить мышей от шейки матки вывих, 15 мин после инъекции.
6. Откройте живота, резка кожи и брюшины в середине живота, изогнутые ножницами Mayo. Расширить разрез справа и слева. Вытащить печени с щипцами пока не визуализируется диафрагмы; Затем вырежьте диафрагмы.
7. С помощью изогнутые ножницы Майо, вырезать двусторонние ребра от каудальнее (12 ребер) к краниально (1-го ребра) подвергать легких, щелкая передней грудной стенки.
8. Идентифицировать грудной пищевод, который выглядит как шнур, соединяющий легких к позвоночнику, поднятием легких с помощью щипцов и, затем, вырезать ножницами microdissection пищевода.
9. Поднять двусторонние легких и сердца с помощью щипцов (применение тяги, потянув вниз, в сторону краниально к каудально) и, затем, сократить трахеи и крупных сосудов легких верхушки в краниально, используя microdissection ножницы.
   Примечание: Это позволяет для изоляции легких и сердца от тела.
10. Удалите из легких с помощью ножниц microdissection сердце.
11. Положите легких в 10 см Петри.
12. Захват изображения биолюминесценции (см. шаги 5.7.1 и 5.7.2) 5 мин после эвтаназии (20 мин после инъекции люциферин).

Результаты

Модели ортотопическая предназначен для имитации человеческого рака прогрессии (то есть, рост первичной опухоли, следуют лимфатических узлов метастазы и затем далеких легких метастазирования)¹⁵. После прививки клеток рака, регулярно количественно би...

Обсуждение

За последнее десятилетие мы создаем несколько моделей мышиных рака, включая груди Рак модели^{3,7,13,16,,2021}. Ранее мы показали, что груди рак клеток ортотопическая прививки в ткани мол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture