JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для подготовки и администрация стереотаксического аллогенной лимфоцитах человека иммунодефицитных мышей, перевозящих ортотопическая человека первичных опухолей головного мозга. Это исследование предоставляет доказательства в концепция как возможности, так и противоопухолевая эффективность intrabrain доставлены сотовой immunotherapies.

Аннотация

Глиобластомы мультиформной (GBM), наиболее частые и агрессивной первичного мозга рак в взрослых, обычно ассоциируется с плохой прогноз, и скудные эффективной терапии были предложены за последнее десятилетие. Среди перспективных кандидатов для проектирования роман терапевтических стратегий сотовой immunotherapies были направлены для ликвидации весьма инвазивных и химио радиационно опухолевых клеток, вероятно, участвующих в быстрое и роковой рецидив этой рака. Таким образом, сменит аллогенной GBM-реактивной эффекторов иммунных клеток, таких как человека Vϒ9Vδ2 Т-лимфоцитов, вблизи опухоли будет представляет собой уникальную возможность предоставлять эффективные и высококонцентрированный терапевтических агентов непосредственно в сайт о злокачественных опухолей мозга. Здесь мы представляем протокол для подготовки и администрация стереотаксического аллогенной лимфоцитах человека иммунодефицитных мышей, перевозящих ортотопическая человека первичных опухолей головного мозга. Это исследование предусматривает доклинических доказательства в концепция как возможности, так и противоопухолевая эффективность этих клеточных immunotherapies, которые полагаются на стереотаксической инъекции аллогенной лимфоцитах человека в intrabrain опухоли кровати.

Введение

GBM (который класс IV астроцитома), является наиболее частым и агрессивной первичного мозга рак в взрослых. Несмотря на агрессивные методы лечения, которые сочетают хирургии и радио химиотерапии GBM остается связанной с очень плохим прогнозом (медиана выживаемости 14,6 месяца и 2-год смертности > 73%)1. Это свидетельствует, что были проверены несколько эффективных терапевтических достижений за последние десятилетия2. Среди кандидатов для разработки более эффективных терапевтических стратегий3,4,5immunotherapies6 в настоящее время изучаются для отслеживания и ликвидации очень инвазивных и радио/химио устойчивые опухоли клетки, предположительно для их ключевой вклад в быстрое и роковой опухоли рецидив7. Различные потенциальные иммунологические цели были выявлены и предложены для immunotherapies, связанных с естественной или модифицированных αβ или ϒδ Т-лимфоцитов как GBM-специфические антигены опухоли или стресс индуцированного молекул8,9, 10. Возможность администрировать выбранных GBM-реактивной иммунных клеток-эффекторов представляет собой уникальную возможность предоставлять повышенные количества эффекторные лимфоциты непосредственно на сайт остаточного злокачественности. Для поддержки этой стратегии, мы недавно показали, что модели, основанные на иммунодефицитных мышей, перевозящих ортотопическая первичной человека GBM ксенотрасплантатов добросовестно итог развития опухолей головного мозга в GBM больных9,11. Кроме того эти модели были использованы для демонстрации сильное противоопухолевое эффективность восприимчивую передаваемых аллогенной лимфоцитах человека Vϒ9Vδ2T.

Этот протокол описывает критических экспериментальные шаги для достижения Стереотаксическая immunotherapies опухолей головного мозга, например GBM, основанный на приемных передачи аллогенной Т-лимфоцитов. В статье показано: (i) усиление терапевтического аллогенной иммунной эффекторных T лимфоциты, например лимфоцитах человека Vϒ9Vδ2T; (ii подготовка этих эффекторных T-лимфоцитов для инъекций; (iii) процедура стереотаксической администрации в головном мозге, вблизи опухоли. Эта статья также обеспечивает понимание поведения этих клеточных эффекторов после стереотаксической инъекции.

Представленный здесь терапевтический подход основан на инъекции 20 x 106 эффекторные клетки за дозу для каждого мозга опухоль подшипник иммунодефицитных мыши. Первоначальный в vitro расширения необходимо производить большое количество иммунных клеток. Таким образом, неспецифичный клеток разложения выполняются с использованием фитогемагглютинина (ФГА-L) и облученных клеток аллогенной фидер: мононуклеаров периферической крови (получения) от здоровых доноров и EBV вирус Эпштейна Барр-трансформированных B-лимфобластоидных клеток линии (BLCLs), полученные от получения в vitro заражение EBV-содержащих культуры супернатанта от линии клеток игрунка B95-8, в присутствии 1 мкг/мл циклоспорина A.

GBM-реактивной эффекторные клетки иммунной системы сопоставляются и отобраны в vitro анализов9. Эти эффекторные клетки активируются и усиливаются с помощью стандартных протоколов, согласно их характера (например, человеческие Vγ9Vδ2 T лимфоциты9 или человека анти вирус αβ T лимфоциты12) с минимальной чистотой > 80%, как обычно проверены гранулярных анализа. Процедура расширения клеток, подробно ниже относится к различных лимфоцитов человека.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Процедура с участием животных предметам была выполнена согласно институциональных руководящих принципов (соглашение #00186.02; региональные Этический Комитет Луары [Франция]). Человека получения были изолированы от крови, собранные из информированных здоровых доноров (пели du Français Etablissement Нант, Франция). Все действия выполняются в стерильных условиях.

1. неспецифические расширение эффекторных цитотоксических Т-лимфоцитов

  1. Подготовить и излучают клетки фидера на 35 гр. Для стимуляции 2 x 105 - 4 x 105 эффекторных клеток, подготовьте 10 х 106 репликацию и 1 x 10-6 BLCLs из трех отдельных, здоровых доноров.
  2. Ресуспензируйте как фидер и эффекторные клетки в 15 мл RPMI, дополненная 10% тепло инактивированная FCS, 2 мм L-глютамином, пенициллин (100 МЕ/мл) и стрептомицин (0,1 мкг/мл) и 300 МЕ/мл рекомбинантного ИЛ-2.
  3. Добавить PHA-L в конечной концентрации 1 мкг/мл, тщательно перемешивают и распространять 150 мкл суспензии клеток в скважину в 96-Ну U-дном пластины.
  4. Инкубируйте при 37 ° C и с 5% CO2 в атмосфере увлажненной.
  5. Ежедневно проверять пластины до тех пор, пока крупноклеточный сгустки формы в скважинах культуры (~ 7 день).
  6. Перенесите клетки в культуре колбу в 1 x 106 клеток/мл в свежей питательной среды.
  7. Определение числа общей ячейки путем подсчета (2 недели) и поддерживать их на 1 х 106 клеток/мл в свежей питательной среды.
    Примечание: Эффекторные клетки иммунной системы должны быть готовы к терапевтической администрации в состоянии покоя (обычно 3 недели после первоначального усиления стимулов). Чистота и реакционная способность этих клеток-эффекторов должны быть проверены до в vivo инъекции (например, с в vitro анализов).

2. предоперационная эффекторные клетки подготовка

  1. После проверки эффекторных клеток граф, собирайте эффекторных клеток в 50-мл пробирку центрифугированием (300 x g 5 мин).
    Примечание: Чтобы компенсировать любые потери, подготовьте избыток клеток (например, 50 x 10-6).
  2. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 15 мл стерильной PBS и центрифуги для 5 мин на 300 x g для выполнения мыть.
  3. Тщательно и полностью удалить супернатант и затем Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл стерильного PBS.
  4. Передача ресуспензированы клетки в 1,5 мл микропробирок для центрифугирования в 300 x g за 5 мин.
  5. Тщательно и полностью удалите супернатант закупорить медленно.
  6. Ресуспензируйте Пелле клеток в 8 мкл стерильных PBS на мышь.
    Примечание: Это важный шаг.
  7. Измерьте объем суспензии клеток с помощью микропипеткой. При необходимости добавьте стерильные PBS (20 x 106 клеток в 15 мкл PBS на дозу) и тщательно перемешать.
  8. Проверьте, используя микропипеткой, что окончательный объем на мышь между 15 и 20 мкл (императивно < 20 мкл).
  9. Держите клетки на льду до стереотаксических инъекции.
    Примечание: более 3-х timepoints не были проверены.

3. Стереотаксическая инъекций

  1. Установка оборудования
    1. Соберите и калибровки малых животных стереотаксической рамы согласно инструкциям производителя, чтобы обеспечить точность внутричерепных инъекций (например, размер шприца, желаемый объем и скорость впрыска).
      Примечание: Скорость медленная инфузия рекомендуется (т.е., 2-3 мкл/мин).
    2. Установка материала под микробной безопасности кабинета (MSC) для сохранения стерильности инструментов и защиты мышей от инфекций.
      Примечание: место «изотермический блоков» в водяной бане при температуре 37 ° C. Эта система ограничивает гипотермии мыши во время операции. Электрогрелки, которые необходимы для ухода после процедуры, должны использоваться в ходе мониторинга постоянной температуры.
  2. Предоперационная подготовка животных
    1. Анестезировать мышь с внутрибрюшинного введения кетамин (10 мг/мл) и ксилазина (0,1 мг/мл) на 10 мкл/г веса тела мыши.
    2. Выполните тест мыс щепотка для обеспечения полной анестезии и обезболивании животного.
      Примечание: Любое движение является свидетельством анальгезии-глубокие, и, если это происходит, прежде чем повторять операцию требуется несколько минут.
    3. После того, как мышь должным образом под наркозом, используйте ножницы, чтобы удалить мех с хирургической сайта (между двумя ушами, до носа).
  3. Подготовка предоперационное клетки
    1. Тщательно Ресуспензируйте клетки с пипеткой (несколько раз) перед каждой инъекцией, чтобы предотвратить любую ячейку слипания.
    2. Аккуратно нарисуйте подвеска объем необходимых клеток (15-20 мкл) в 22-G microsyringe избежание аспирации пузырей.
      Примечание: Этот шаг ячейки загрузки в microsyringe имеет важное значение для сведения к минимуму расхождения вводили томов. Перезагрузите ячейки для каждого индивидуального инъекций между процедурами, чтобы предотвратить любую ячейку слипания и обеспечить четное количество эффекторных клеток администрации в когорте.
    3. Затем поместите шприц в адаптированных шприцевой насос.
  4. Процедурные Уход
    1. Лечить хирургическим сайт с тампоны, пропитанные повидон йода 5% раствор по крайней мере 3 x.
    2. Место смазочное глазные мази в глаза мыши для предотвращения любого сушки роговицы.
    3. Положение наркотизированных мыши на стереотаксической рамы, на теплых изотермический блок покрыта стерильной полиэтиленовой пленкой для поддержания температуры мыши во время операции и ограничить уровень смертности.
      Примечание: Нос мыши и зубы должны быть надлежащим образом расположены над панелью зуб, чтобы обеспечить адекватный поток дыхания во время процедуры.
    4. Когда мышь находится над панелью зуб, затяните баров уха твердо под мышь уши обездвижить головы.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы не повредить барабанные перепонки, или для нарушения дыхания.
    5. Сделайте 1-2 см срединной Сагиттальный разрез стерильными ножницами вдоль верхней части черепа от впереди задней подвергать черепа.
    6. Определите пересечения сагиттальной и коронарного шва (Bregma) в качестве ориентиров для стереотаксической локализации до инъекции (показано на рис. 1).
    7. Место microsyringe выше этой точки.
    8. Переместите microsyringe правой боковой 2 и 0,5 мм передней Bregma.
    9. С помощью microdrill, сделайте небольшое отверстие в черепе с стерильных сверло в заданных координатах. Будьте осторожны, чтобы оставаться поверхностным во избежание любого травматического повреждения мозга.
      Примечание: В настоящем Протоколе, иммунные клетки были введены в рамках установленных опухоли (одной недели после инъекции клеток опухоли). Кожа должна быть вновь (СКАР) и инъекции проводится в те же координаты, используемые для имплантации клеток опухоли (отверстие обычно все еще присутствует до 2 недель после инъекции). Для инъекций опухоли и эффекторных клеток в13,паренхимы мозга14были отобраны координаты.
  5. Инъекции иммунных эффекторных клеток
    1. Осторожно вставьте microsyringe в просверленное отверстие и, медленно, вперед игла 3 мм в Дура вниз и затем обратно 0,5 мм до окончательного глубиной 2,5 мм до инъекционных эффекторных клеток.
    2. Инъекции эффекторных клеток на 2-3 мкл/мин и отслеживать мышей вдоль время впрыска.
    3. После инъекции, снять иглу для всего 1 мм и держать microsyringe на месте за дополнительную минуту перед медленно снятия полностью microsyringe, для предотвращения любой утечки из сайта инфузии.
      Примечание: После удаления животного от стереотаксической устройства, немедленно очистите инъекционное оборудование для предстоящих экспериментов.
  6. Послеоперационный уход и последующие мыши
    1. Удаление животное от стереотаксической рамы и немедленно применить повидон йода 5% раствора на сайте разрез и закрыть кожи с соответствующей шовного.
    2. Применять гель 2% лидокаин непосредственно на рану и администрировать 0,15 мкг/г бупренорфина подкожно после процедуры анальгезии.
    3. Место обратно наркотизированных мыши к своей клетке выше грелку набор до 37 ° C для поддержания температуры тела соответствующие мышь и избежать любых гипотермии.
      Примечание: Отдельные жилье не является необходимым.
    4. Контролировать мыши до тех пор, пока он полностью оправился от наркоза и передать его на помещение для жилья.
      Примечание: На сегодняшний день этот протокол хорошо поддерживается несколько непредвиденные осложнения имели место (< 5% от введенного мышей).
    5. Ежедневно контролировать мышей и усыпить их, когда наблюдаются признаки снижения здоровья (например, Сгорбленная осанка, ограниченной подвижностью, прострация или значительное Потеря веса [≥ 15%]).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Это исследование описывает стратегию передачи приемным клеточных иммунных эффекторных клеток в головном мозге опухоли нося мышей, основанный на стереотаксической инъекции непосредственно в опухоль кровати.

Чтобы свести к минимуму л...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Приемных передача выбранных родной или инженерных иммунной эффекторных клеток представляет собой перспективный подход для эффективного лечения опухолей, таких как инфильтративный мозга рак, заботясь о ограничения определено против-трансформированных клеток15,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят сотрудников больницы университета животных фонда (ют) Нант для животноводства и ухода, клеточной и тканевой визуализации объекта ядра Нант университета (MicroPICell) для обработки изображений, и цитометрии фонда (Cytocell) от Нанта для их экспертной технической помощи. Эта работа финансировалась INSERM, CNRS, Université de Nantes, институт, Национальный du рака (Инка #PLBio2014-155), Национальная лига против le рака (AO межрегиональных 2017) и Европейский консорциум Transcan2 ERA-Net (Immunoglio). Команда финансируется фонд pour la Recherche Пущинский (DEQ20170839118). Эта работа осуществлялась в контексте LabEX МПО и IHU-Сести программ, поддержке национальных исследований агентства Investissements будущее через программы НРУ-11-LABX-0016-01 и АНР-10-IBHU-005, соответственно. IHU-Сести проект поддерживается также Нант Metropole и региона Луары. Авторы благодарят Рафия Chirine за помощь в исправлении рукопись.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PBMCsfrom 3 different healthy donors
BLCLsfrom 3 different donors
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)Gibco31870-025
FCSDutscherS1810-500
L-glutamineGibco25030-024
penicillin/streptomycinGibco15140-122
IL-2Novartisproleukin
PHA-LSigmaL4144
Stereotaxic frameStoelting Co.51600
Mouse adaptator for stereotaxic frame  Stoelting Co.51624
microsyringe pump injector WPIUMP3-4
NanoFil SyringeWPINF34BV-2
NSG miceCharles RiverNSGSSFE07S
KetamineMerialImalgène 1000
XylazineBayerRompur 2%
ScissorsWPI201758
ForcepsWPI501215
OmniDrill 115/230VWPI503598
Vicryl 4-0EthiconVCP397H
XylocaineAstrazeneca3634461

Ссылки

  1. Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
  2. Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
  3. Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
  4. Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305(2018).
  5. Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824(2018).
  6. Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545(2014).
  7. Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
  8. Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
  9. Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554(2016).
  10. Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
  11. Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
  12. Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
  13. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403(2011).
  14. Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
  15. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  16. Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
  17. Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
  18. Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
  19. Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
  20. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  21. Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
  22. Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
  23. Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
  24. Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
  25. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

139stereotaxy

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены