Спектральная Рефлектометрические микроскопия на Миелинизированные аксоны в Situ

Резюме

Здесь мы представляем пошаговые протокол для визуализации Миелинизированные аксоны в кусочек фиксированной мозга, используя ярлык свободный наноразмерных изображения метод, основанный на спектральные рефлектометрии.

Аннотация

В млекопитающих нервной системы миелина обеспечивает электрической изоляции, обертыванием аксон волокон в многослойных спираль. Вдохновленный архитектурой субцеллюлярные высоко организованной, мы недавно разработали новый механизм визуализации, именем спектральных рефлектометрии (сфере), который позволяет беспрецедентную лейбл свободных наноразмерных изображений живой Миелинизированные аксоны в situ. Основополагающий принцип заключается в получении информации наноструктурных, проанализировав отражения спектр многослойных субцеллюлярные структуры. В этой статье мы опишем подробные пошаговые протокол для выполнения основной сфере изображений нервных тканей, с использованием коммерческих конфокальный микроскопические системы, с белый свет лазера и перестраиваемый фильтр. Мы охватывают процедуры пробоподготовки, приобретение спектральных данных и обработки для получения сведений о наноструктурных изображений.

Введение

В нервной системе млекопитающих миелина обеспечивает быстрое нервной проводимости и аксональной целостность, обертыванием аксон волокон с многослойных мембранных влагалищ. Многослойная структура состоит из чередующихся наноразмерных тонких пленок-состоящий из плазменных мембран (~ 5 Нм), цитозоле (~ 3 Нм) и внеклеточного пространства (~ 7 Нм)^1,2. Оптическая микроскопия, включая недавние суперразрешением микроскопии, не подходят для наблюдений за наноразмерных миелина динамика из-за их недостаточной резолюции вследствие дифракции^3,4,5. Хотя электронная микроскопия может предоставить мелких деталей из наноструктурированных миелина, это не совместимо с живых биологических систем из-за очень инвазивных образец подготовки с участием химической фиксации и ultrasectioning^6,7 . До недавнего времени, там было не техника применяется для наблюдения за наноразмерных динамика Миелинизированные аксоны в situ.

Schain et al. ранее сообщалось, что Миелинизированные аксоны exhibit красочные светоотражения⁸. Приняв спектроскопического анализа на отраженный свет, мы разработали новый механизм изображений для визуализации наноразмерных Миелинизированные аксонов, названный спектральных рефлектометрии (сфере)⁹. Сфере на основе тонкопленочных вмешательства, происходящих в многослойной структуре Миелиновые оболочки (рис. 1). По оптического моделирования на различных аксонов, мы показали, что спектр отражения является периодическая функция волновое и его периодичность () пропорциональна аксон диаметр (d). Этот простой отношения () предлагает снисходительный количественная оценка диаметра аксона от сфере данных. Используя это, мы показали распространены аксона, выпуклые под легкой черепно-мозговой травмы в нашем предыдущем докладе.

Сфере система основана на confocal микроскопии и состоит из специализированных лазерного источника и фильтров (рис. 2). Источник ввода является белый свет лазера, предоставление широкополосного спектральных вывода видимых инфракрасных регионов. Для спектрального сканирования, система оснащена двумя акустооптические устройства: акустооптические перестраиваемый фильтр (AOTF) для доставки выбранной длине волны от источника входного сигнала широкополосные и splitter луча Акусто оптический (AOBS) для руководства выбранного отражение Длина волны до детектора. Программное обеспечение для гиперспектрального confocal микроскопии (см. Таблицу материалы) предоставляет настраиваемый спектрального сканирования вариант последовательно получить отражения изображения на различных длинах волн ввода. Кроме того хроматические аберрации критически может вмешиваться в спектральных измерений; Поэтому рекомендуется использовать Апохромат объектива.

Следует отметить белый свет лазеры производства неравномерным спектральных и оптических компонентов также влияет на спектральные профиль. Таким образом полученные спектры должны быть откалиброваны для последующего количественного анализа. Охраняемых Серебряное зеркало обычно используется как ссылка, которая обеспечивает практически постоянный коэффициент отражения (> 97%) над полностью видимой области. Полученные спектры затем делится на ссылку спектров от зеркала.

Размер спектральных шаг спектрального сканирования определяет скорость приобретения; Таким образом он должен быть оптимизирован. Как большие аксона имеет высокий спектральных период, он требует тонкой спектральных выборки. К примеру, аксон с диаметром 10 мкм, один из крупнейших физиологического аксоны, имеет спектральный период ~ 8 Нм. Применив критерии отбора проб Найквиста, мы заняты спектральный интервал 4 Нм для покрытия всех физиологических аксоны в нервных тканях мыши. Этот подход обычно занимает более нескольких секунд для полного спектрального сканирования и таким образом не подходит для приложений в естественных условиях , где физиологическое движение (например дыхание и сердцебиение) мешает стабильной спектральных приобретения. Ранее мы решили этот вопрос путем инструментирования микроскопом заказной вертикально, предназначена для получения полного спектра для каждой точки, с помощью массива спектрометр (приобретение скорость ≈ 30 мс на пиксель).

В настоящем докладе, мы описываем подробный протокол на сфере изображений на кусочек фиксированной мозга, которые могут быть выполнены в коммерческих гиперспектрального микроскоп (см. Таблицу материалы). Таким образом протокол может быть дополнено экспериментаторов без опыта в оптических приборов. Мы также охватывать потенциальные проблемы и устранение неполадок для сбора и анализа данных сфере.

протокол

Все хирургические процедуры были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Университета Сонгюнгван.

1. Пробоподготовка

Примечание: Автоклав всех хирургических инструментов до обработки животных. Проведение всех хирургических производительности в комнате, посвященный хирургических процедур. Стерильные хирургические халаты и перчатки должны носить всем персоналом в хирургическое обслуживание на все времена.

1. Фиксация ткани
   1. Подготовьте два 10 мл-шприцы, каждый наполнен фосфат амортизированное saline (PBS) и параформальдегида 4% (PFA) в PBS.
   2. Анестезировать 7-12-недельных мышь, (C57BL/6J или любой мыши линии с любого пола) управляющими смесь zoletil и Ксилозин (1:1, 20 мг/кг) или режима альтернативных подходящих анестезии (например, смесь кетамин 80 мг/кг и 10 мг/кг Ксилазина) с внутрибрюшинной инъекции.
   3. Как только мышь достиг хирургические плоскости анестезии (используйте метод Пинч ответ мыс), разоблачить сердце, отрезав кожи и грудная клетка с ножницами.
   4. СНиП правое предсердие с маленькие ножницы для слива крови и perfuse PBS и PFA решение последовательно через левого желудочка с помощью иглы (перфузии ставка = 4 мл/мин, объем = 10 мл для каждого решения).
      Примечание: Мышь становится жесткой, если процедура будет успешно завершена. Использование глазная мазь или стерилизация не является необходимым, как процедура терминала. Фиксация процедура может быть пропущен. Однако этот шаг рекомендуется для сведения к минимуму структурных деформаций, включая повреждение механических тканей и аксональной ишемический отек. Для получения более подробной информации о фиксации ткани обратитесь к статье Гейдж, G. J. et al. ¹⁰
2. Подготовка срез мозга
   1. Обезглавить мышь с Ножницы хирургические через брюшной грудной клетки и живота.
   2. Удалите головы и надкостницы, подходяще небольшой ножницами до полностью обнажая черепной коробки.
   3. Разорвать лобной кости и разрезать вдоль Сагиттальный шов от затылочной кости, используя маленькие ножницы с осторожностью, чтобы не повредить мозг череп.
   4. Аккуратно удалите черепной коробки и твердой мозговой оболочки, последовательно с помощью тонкой щипцами.
   5. Извлечение с помощью мягкой пластиковой ложкой, стараясь не повредить ткани мозга.
   6. Промыть и замочить извлеченные мозга в 4% раствор PFA для 30 мин при 4 ° C.
   7. Slice фиксированной мозга на 100 — 150 мкм секций с помощью vibratome.
      Примечание: Для получения более подробной информации о подготовке ткани, обратитесь к статье, Сегев и др. ¹¹. для последующих процедур, ткани должны быть нарезанный в секции тоньше, чем толщина распорку.
3. Монтаж на срез мозга
   1. Подготовка 1 стеклянное скольжение и 2 квадратных крышка очки (22 × 22 × 0,17 мм) для каждого среза ткани.
   2. Один из квадратных очках Обложка нарезать половину (две прямоугольные куски) с помощью стеклорез.
   3. Прикрепите два наполовину очки покрытия с помощью супер клей на стекле слайд.
      Примечание: Пространство между двумя наполовину очки должны быть немного больше, чем размер среза ткани.
   4. Урожай срез мозга, используя щетку или пипетки и заложить ткань на слайд стекло между распорку. Заботиться не сложить ткани.
   5. Отказаться от 100 мкл PBS на поверхности ткани.
   6. Место другой квадратных Стекло покровное поверх ткани. Избегайте включения воздушных пузырей во время этой стадии.
   7. Уплотнение вокруг крышки стекла, используя лак (или альтернативно подходящего клея) для предотвращения испарения PBS и загрязнение пылью во время последующей сессии изображений.
      Примечание: На данном этапе может приостановить экспериментатора.

2. Калибровка

1. Переключение на микроскопе по крайней мере 1 час перед изображений позволяет тепловой стабилизации лазерного источника (см. Таблицу материалы). Затем включите программное обеспечение для спектрального сканирования (см. Таблицу материалы) и нажмите на кнопку получить на вершине GUI (Рисунок 3А).
2. Включите программное обеспечение затвора для белый свет лазера (WLL) и фотоэлектронный умножитель трубки (ПЛТ) (рис. 3a).
3. Выберите в xyΛ режим в раскрывающемся списке Режим, а затем, режим ввода лазер автоматически изменяется с постоянной процентов на Постоянной мощности. Снимите флажок Автоматического движения SP. И установите спектральные окна ввода лазерного 470 – 670 нм и размер спектральных шага 4 Нм на Λ-возбуждения лямбда сканирования Параметры (рис. 3b).
4. Спектральный диапазон ПЛТ значение 450-690 двойным щелчком или перемещении ползунка регулировки для спектрального диапазона (рис. 3 c).
   Примечание: Этот спектральный диапазон должен включать полную пропускную способность источника входного сигнала.
5. Выбор объектива погружения в воду, надлежащим образом с высоким числовой апертуры (NA > 0,7) и дать любое значение ПЛТ и лазерной энергии для того чтобы активировать кнопку AOBS конфигурации и Жить сканирование . Переключение оптического пути, проверяя отражение в AOBS конфигурации (рис. 3d).
6. Смонтировать зеркало ссылку (см. Таблицу материалы) на сцене микроскопа. Зеркальная поверхность следует сталкивается против объектива. Если это не просто поставить зеркало на микроскопа, Бонд зеркало на плоской пластине (например слайд стекло).
7. Управление микроскопа выровнять фокальной плоскости к зеркальной поверхности.
8. Отрегулируйте ПЛТ усиления и мощности лазера, учитывая динамический диапазон детектора и затем изменить режим ввода лазер с постоянной процента для Постоянной мощности.
   Примечание: Как обычно, PMT получить 500 (V) и относительной лазера мощностью 0,1% используются в 570 Нм.
9. Подтверждение в псевдо-цветовой режим, чтобы проверить, что есть нет насыщения во всем диапазоне длин волн. Если наблюдается насыщения, снизить мощность лазера (рис. 3a).
10. Запуск Сканирования лямбда приобретения.
11. Удаление зеркала из стадии и повторите же приобретения без образца, чтобы получить ссылку на темные (т.е., темный смещение).
12. Сохраните данные в формате Multistacked TIF .

3. сфере изображения приобретение

1. Место навесные ткани на микроскопа. Чтобы приблизительно выровняйте ткани в фокальной плоскости объектива, используйте режим флюоресценции поля через глаз кусок.
2. С Live сканирования на, управления микроскопа выровнять фокальной плоскости для региона интерес в ткани. Чтобы избежать фоновый шум от скольжения обложки, выберите целевой регион по крайней мере 15 мкм глубины из стекла ткани интерфейса.
3. Приобрести изображения спектральным стека для целевого региона, используя ту же процедуру, как описано в шагах 2.1 – 2.10.
4. Сохраните данные для ткани и темные смещение в Multistacked TIF формате.
   Примечание: На данном этапе может приостановить экспериментатора.

4. обработка и анализ изображений

1. Откройте спектральные данные (multistacked TIF) для ссылки зеркало и ткани мозга в ImageJ.
2. Выберите трансформирования (Регионы интереса) для открытого изображения стеки — Центральная область для ссылки зеркало и сегмент аксона волокна для ткани мозга.
3. Приобрести сырье спектры для выбранного ROIs работает изображение → стеки → профиль участка Z-axis в ImageJ меню.
4. Открытие Темные смещения данных, один для ссылки зеркало и другие принятые для ткани мозга.
5. Приобрести спектры для темных смещения работает изображение → стеки → профиль участка Z-axis в ImageJ меню.
6. Сохраните все полученные спектры с помощью копирования и вставки параметров.
   Примечание: Для изображений сфере, рекомендуется использовать Центральный визуализации поля в минимизации аберраций оптической оси. Аксон волокна могут быть структурно гетерогенных вдоль их длины. Следовательно выбор ROI на сегмент малого аксона, обычно < 5 мкм, для сведения к минимуму частичного объем артефакт рекомендуется.

5. базовые коррекции и анализ сфере сигнала

1. Вычтите смещение спектров от спектров ссылка зеркало и тканей мозга.
2. Нормализация каждой спектра путем деления максимальная интенсивность спектра.
3. Разделите нормализованных спектр аксон нормализованных спектр ссылка зеркало и вычесть смещение DC от нормализованной спектра.
4. Измерения частоты волновое путем установки приобретенного спектра синусоидальной кривой (см. Таблицу материалы), а затем преобразовать приобретенных волновое периодичности, принимая взаимные.
5. Преобразуйте волновое периодичности аксон диаметр с помощью уравнения в рисунке 4 c.

Результаты

Согласно протоколу, ломтиком фиксированной мозга был подготовлен с экзогенной окрашивание, Флюорофор ориентации миелина (см. Таблицу материалы). Сфере изображений была исполнена на срез мозга, с использованием коммерческих гиперспектрального конфокального...

Обсуждение

Сфере является новый лейбл бесплатная изображений механизм на основе спектральных интерферометрии, который в первый раз, предлагает наноразмерных информацию в прямом Миелинизированные аксоны. В протоколе текущего приобретения, пространственное разрешение для axon диаметр составляет ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass cutter	-	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Nail polish	-	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Apochromat objective 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	Water-immersion type
Fluoromyelin Green	Thermo Fisher	F34651	Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.
Leica SP8 TCS microscope	Leica Microsystems	SP8	Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details.
Imaging software	Leica Microsystems	LAS-X	-
Matlab	MathWorks	-	-
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01	Coated with protected silver.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Life technologies	14190-136	-
Paraformaldehyde	Biosolution	BP031a	4% v/v in PBS
Cover slip	Thermo Fisher	3306	Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)
Slide glass	Muto Pure Chemicals	5116-20F	Thickness: ~1 mm
Super glue	Henkel	Loctite 406	Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.
Syringe pump	Brainetree Scientific	BS-8000 DUAL	-
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200S	-
White-light laser	NKT photonics	EXB-6	EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.