JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы опишем простой и быстрый метод для подготовки и анализа N- гликанов из различных сортов редиса (редька sativus).

Аннотация

В последние годы постановление углевод растений получили значительное внимание, поскольку они являются потенциальным источником cross-reactive, провоцируя специальные иммунных реакций. Кроме того структуры углеводов также играют критически важную роль в метаболизме растений. Здесь мы представляем простой и быстрый метод для подготовки и анализа N- гликанов из различных сортов редиса (редька sativus) с использованием N- glycanase, специфичных для выпуска растительного углеводов структур. Для достижения этой цели, сырой трихлоруксусной кислоты преципитаты редька гомогенатах были относиться с PNGase H+и помечены с помощью 2-aminobenzamide как флуоресцентные метки. Приклеенные этикетку N- glycan образцы впоследствии были проанализированы ультра производительность разделения жидкостной хроматографии (UPLC) и при содействии матрицы лазерной десорбции ионизации время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии для подробного структурных оценки и количественного анализа относительной abundancies редиска производные N- glycan структур. Этот протокол может также использоваться для анализа N- гликанов из различных других видов растений и может быть полезной для дальнейшего расследования функции и N- гликанов воздействия на здоровье человека.

Введение

N- гликанов в растениях привлекли повышенное внимание в последние годы, как предыдущие исследования высветил N- гликанов как потенциальный источник иммунологические перекрестные, которые могут вызвать аллергические реакции1,2 . Ранее было продемонстрировано, что N- гликанов на завод гликопротеинов может повлиять на каталитическую активность3,4, термостойкость и складной5,6 или субцеллюлярные локализации и секреция7. Для того, чтобы соотнести glycan структур с их соответствующих функций, N- гликанов сначала должен быть освобожден из гликопротеинов, химически или ферментативно. Классический химический метод для освобождения как N- и O- гликанов — β-ликвидация, в котором щелочной образца лечение сопровождается снижением с боргидрид приносить alditol8. Однако эта процедура не исключает маркировки с Флюорофор и вызывает значительный упадок моносахаридов единиц от снижения конца glycan структуры. Химических deglycosylation, основанный на Гидроксид аммония/карбонат лечения является также широко используется альтернативный метод9. Ни один из этих методов химического релиз деградирует интакт белками, который позволяет масс-спектрометрических анализ немеченого glycan бассейнов без вмешательства терпеноидные фрагменты из того же диапазона массы. Однако один недостаток этих методов встречается увеличение скорости разложения α1, N3-fucosylated - гликанов, общую структуру углеводов в растениях10. Кроме того, ферментативные релиз методы, используя пептиды:N- glycanases (PNGases, ЕС 3.5.1.52) также широко применяются. Рекомбинантных PNGase F (от флавобактерии meningosepticum) является наиболее распространенным вариантом и разрешает освобождение всех типов N- гликанов, за исключением структуры с учетом основных α1, 3 Фукоза11,12. Таким образом PNGase A (изолированные от миндаля семена) обычно используется для анализа растений N- гликанов13. Однако, этот фермент deglycosylates только proteolytically производные гликопептиды и не может deglycosylate родной гликопротеинов14. Следовательно перед дальнейшего анализа, который приводит к гибели гликаны, особенно низкой изобилие15требуется проработка многоступенчатой выборки. Общая цель метода – представить Оптимизированный рабочий процесс для N- glycan выпуска и флуоресценции маркировки на основе простой и надежный. Обоснование этого заключается PNGase H+, который был недавно обнаружен в Terriglobus roseus и recombinantly может быть выражен в E. coli, можно гидролизуют N- гликанов непосредственно из белка лески в кислой условия16. Ключевым преимуществом использования PNGase H+ над альтернативными методами является, что люминесцентные маркировки реакции может быть выполнена в том же реакция трубе без изменения реакции буферов17,18. Простая подготовка условий и высокое извлечение низкой изобилие олигосахариды делают этот метод является ценным инструментом в анализе N- гликанов. Этот протокол предназначен для анализа N- гликанов из различных видов растений.

протокол

1. образец коллекции

  1. Приобрести различные сорта свежего хрена (редька sativus L.).

2. изоляция белка из редиса

  1. Однородный примерно 100 г свежего хрена с кухня блендер для 10 мин.
  2. Передача навозной жижи на тюбик 50 мл центрифуги и центрифуги на 14 000 × g при 4 ° C в течение 20 мин для удаления нерастворимых материалов.
  3. Передача супернатант тщательно в новой 50 мл пластиковых пробирок и добавить равное количество 2 М раствора трихлоруксусной кислоты (ТСА).
    Примечание: Добавление ГТС будет выпадать в осадок белков растворимые (glyco).
  4. Центрифуга на 14 000 × g при 4 ° C на 30 мин и удалить супернатант из гранулированного (glyco) белки.
  5. Помойте лепешка с 20 мл деионизированной воды и центрифуги на 14 000 × g при 4 ° C за 5 мин для удаления растворимых олигосахаридов и полисахариды.
  6. Повторите шаг 2,5. четыре раза.
  7. Вновь приостановите гранулы в 1 мл деионизированной воды и передачи свежие 1,5 мл пластиковых пробирок.

3. Подготовка N- гликанов

  1. Mix 50 мкл раствора белка из шага 2.7. (равный 5 г свежего хрена) с 0,2 му рекомбинантных ч PNGase+ в 10 мм уксусной кислоты.
  2. Инкубируйте реакционной смеси при 37 ° C в течение 12 ч. После инкубации центрифуги на 14 000 × g 5 мин для удаления дополнительных белков и ферментов.
  3. Супернатант передать свежие 1,5 мл пластиковых пробирок.

4. Очистка N- гликанов

  1. Подготовить столбце твердофазный извлечения (SPE), чтобы обогатить N- гликанов и удаления солей и других примесей из реакционной смеси, увеличения избирательности fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) маркировки агент для N- glycan деривации.
    1. Добавьте 3 мл деионизованной воды промойте колонку.
    2. Добавьте 3 мл 80% Ацетонитрил раствора, содержащего trifluoroacetic кислоту (TFA, 0.1% v/v) для активного столбце SPE.
    3. Добавьте 3 мл деионизированной воды, чтобы сбалансировать столбце SPE.
  2. Передать образец из шага 3.3 на столбец и отбросить потока через.
  3. Добавьте 1,5 мл деионизованной воды промойте колонку и отбросить потока через.
  4. Элюировать выпущенный N- гликанов из столбца с помощью 1,5 мл водного раствора 20% ацетонитриле, содержащие 0,1% TFA (v/v) в 2-мл пробирку центрифуги.
  5. Удаление растворителя центробежные испарения при комнатной температуре. Испарится до тех пор, пока образец должна быть абсолютно сухой.

5. флуоресценции деривации N- гликанов

  1. Готовим 1 мл раствора 2-AB, состоящий из 35 мм 2-AB и 0,1 М натрия цианоборогидрида в этанного сульфоксида/уксусной кислоты раствор (7:3 v/v).
  2. Добавьте 5 мкл раствора 2-AB в высушенных образцов (шаг 4.5.), полученных от шести различных редис. Вихревой каждый образец до тех пор, пока полностью распущены.
  3. Инкубировать смесь для 2 h на 65 ° C.
  4. Остудите до комнатной температуры образца за 5 мин и добавить 5 мкл деионизированной воды и 40 мкл ацетонитриле. Центрифуга трубы в 14.000 x g на 3 мин.
  5. Передача 48 мкл от супернатант в 300 мкл высокого подъема ВЭЖХ флакон. Храните derivatized N- glycan образцов при-20 ° C до одного месяца.

6. HILIC-UPLC профилирование N- гликанов

  1. Анализ образцов, с использованием стандартной системы UPLC, подключенных к Интернет флуоресценции detectorset на длинах волн возбуждения/выбросов, 330 Нм/420 Нм соответственно.
  2. Используйте гидрофобные взаимодействия жидкостной хроматографии (HILIC)-UPLC glycan столбец столбец при температуре 60 ° C для анализа.
  3. Подготовить растворителей A путем разбавления 50 мл Стоковый раствор (1 M аммония Формиат раствор, рН 4,5) с 950 мл жидкого хроматография масс-спектрометрия (LCMS)-класс воды. Стоковый раствор приготовляют следующим образом:
    1. Добавление 43 мл муравьиной кислоты до 700 мл LCMS-класса H2O.
    2. Отрегулируйте pH 4.5 прикапывают добавлением раствора (25% w/w) водного раствора аммиака.
    3. Передать Измерительный цилиндр растворителя и заполнить до 1000 мл с LCMS-класса H2O. магазин на 4-6 ° C на срок до 3 месяцев.
  4. Использовать LCMS-класс Ацетонитрил в качестве растворителя б.
  5. Отделяйте N- гликанов элюции следующих градиента:
    1. Начните с добавления 95% растворителей B в жидкостной A. набор скорость потока в 0,5 мл/мин от 0 до 44,5 мин.
    2. 0 мин 6 мин постепенно уменьшаться доля растворителя B с линейного градиента to78%.
    3. От 6 мин до 44,5 мин постепенно уменьшаться доля растворителя B с линейным градиентом до 55,9%.
    4. 44.5 мин 46.5 мин быстро уменьшить количество растворителя B с линейным градиентом от 55,9% до 0% 0% на 2 мин и удерживайте инициировать Стиральная столбца. Уменьшите скорость потока до 0,25 мл/мин от 44,5-55 мин.
    5. Промойте колонку далее, увеличивая растворителей B до 95% от 48,5 мин до 50,5 мин и удерживайте на 95% для 4,5 мин.
    6. Заново сбалансировать столбец для стартовых условий 95% растворителя B в 0,5 мл/мин от 50,5 до 57 мин.
  6. Inject 45 мкл пример в системе UPLC.
  7. Элюировать N- гликанов, UPLC с временем удержания между 15 и 40 мин.
  8. Собирать каждый наблюдаемых фракция пик UPLC, используя 2 мл пробирок и сухой образцы центробежные испарением.
  9. Придать примерно 1 пмоль 2-AB помечены декстрана стандарт (2−20 глюкозы единиц) для калибровки завод -N- glycan профилирования и назначить их элюции раз в стандартизированных Глюкоза единицы.

7. MALDI-TOF масс-Спектральный анализ

  1. Распустить образцы из шага 6,8 в 5 мкл LCMS-класс воды. Смешайте 1 мкл пример решения и 1 мкл 6-аза-2-thiothymine (ATT) раствора (0,3% w/v в водный ацетонитриле 70% v/v), и дозатор смеси на прободержатели MALDI-TOF.
  2. Анализ образцов, с помощью инструмента MALDI-TOF масс-спектрометр в положительный ион режим, нажав кнопку Пуск .
  3. Анализ массового спектры с помощью сопутствующего программного обеспечения анализа MALDI-TOF-MS.
  4. Интерпретируйте спектры с использованием программного обеспечения интерпретации glycan открытым исходным кодом19. Установите параметры поиска для маркировки, 2-AB [M + Na]+и установите для параметра точности 2,0 ПДР.

Результаты

Рисунок 1 показывает Схематический обзор описанных протокола, в том числе изоляции (glyco-) белков из редиса, подготовка N- гликанов, UPLC анализ и MALDI-TOF-MS анализ этих компонентов. Рисунок 2 показывает представитель UPLC хроматограммы дерив?...

Обсуждение

Протокол, который мы представили здесь позволяет Сравнение профилей - glycan Nразличных сортов редиса. Значительное преимущество этого метода по сравнению с существующими протоколами является, что изменения буфера между ферментативные выпуск N- гликанов и деривации реакции с 2-AB...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа частично поддержали фонд естественных наук Китая (Грант номера 31471703, A0201300537 и 31671854 СП и л.л., предоставить г.я. номер 31470435) и 100 зарубежных талантов план (Грант номер JSB2014012 СП).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals:
Trichloroacetic acid SCR, Shanghai80132618
Acetic acid glacialHuada, Guangzhou64-19-7
AcetonitrileGeneral-reagentG80988C
Trifluoroacetic acidEnergy chemicalW810031
2-aminobenzamideHeowns, TianjinA41900
Sodium cyanoborohydrideJ&K Scientific Ltd314162
Dimethyl sulfoxideHuada, Guangzhou67-68-5
2AB-labeled dextran ladder, 200 pmolAgilent TechnologiesAT-5190-6998
6-Aza-2-thiothymine Sigma275514
Tools/Materials:
Kitchen blenderBear, GuangzhouLLJ-A10T1
CentrifugeTechcompCT15RT
Centrifugal EvaporatorHualida, TaicangLNG-T120
SPE columnSupelcoSupelclean ENVI Carb SPE column
MALDI-TOF mass spectrometerBrukerAutoflex
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vialAgilent Technologies # 5188-2788
HPLC SystemShimadzuNexera
Fluorescence Detector for HPLCShimadzuRF-20Axs 
Column ovenHengxinCO-2000
HPLC ColumnWatersAcquity UPLC BEH glycan column2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size
LCMS-grade WaterMerck Millipore#WX00011
LCMS-grade AcetonitrileMerck Millipore# 100029
Formic acidAladdinF112034
Ammonia solutionAladdinA112080

Ссылки

  1. Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
  2. Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
  3. Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
  4. Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
  5. Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
  6. Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
  7. Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
  8. Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
  9. Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
  10. Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
  11. Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
  12. Fan, J. -. Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
  13. Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
  14. Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
  15. Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
  16. Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).
  17. Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
  18. Wang, T., Hu, X. -. C., Cai, Z. -. P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
  19. Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

136NsativusPNGase HMALDI TOFfucosylation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены