Выборки и предварительной обработки эмали зубов карбонат для стабильной углерода и кислорода изотопный анализ

Резюме

Стабильные углерода и кислорода изотопный анализ карбоната человека и животных зуб эмаль используется в качестве прокси для индивидуальной диеты и экологической реконструкции. Здесь мы предоставляем подробное описание и визуальные документации навалом и последовательные зуб эмаль выборки, а также предварительной археологические и палеонтологические образцы.

Аннотация

Стабильные углерода и кислорода изотопный анализ человека и животных зуб эмаль карбоната применялся в paleodietary, палеоэкологические и палеоэкологическое исследования недавних исторических периодов вернуться к более 10 миллионов лет назад. Массовая подходы обеспечивают репрезентативной выборки на период минерализации эмали, в то время как последовательных выборок внутри зуба может отслеживать диетических и экологические изменения в этот период. Хотя эти методологии были широко применяется и описаны в археологии и экологии, палеонтологии, там было без четких руководящих принципов для оказания помощи в выборе необходимого лабораторного оборудования и подробно описать подробные лабораторных проб и протоколы. В этой статье мы документ текстуально и визуально, весь процесс от выборки путем предварительной обработки и диагенетических скрининг более широко распространять методологии для исследователей, считая его применение в различных лабораторных параметров.

Введение

Стабильные углерода и кислорода анализ изотоп карбоната эмаль зуба был использован для изучения прошлого человека пищей, отлучение от груди и мобильности, а также животных полагаться на растительность, движения животных и кормлении скота. Эти приложения были всесторонне обсудили и рассмотрели для различных условий окружающей среды, определяющее последствия местных засушливость, температуры, источников воды и растительности композиции^{1,2, 34,,5,6}. Разнообразие потенциальных применений в области археологии и палеонтологии, а также хорошее сохранение карбоната эмали зуба, сделало его привлекательный материал для стабильного изотопа работы³. Методы отбора проб, предварительной обработки и Диагенез скрининг кратко описаны в ряде предыдущих публикаций^1,7. Однако тщательное вербальный и демонстрации остаются практически недоступными, особенно для людей вне археологической науки лаборатории и лаборатории группами с ограниченным финансированием, где растет интерес к использованию этого метода ⁵.

Зубная эмаль главным образом состоит из гидроксиапатита (bioapatite) кристаллитов⁸ больше, чем те, в кости, что делает его более устойчивым к посмертные диагенетических ионных замен и загрязнения³. Современные исследования показали, что стабильная углерода изотопа (δ¹³C) измерения фауны зуб эмаль надежно запись животных диеты и поведение^9,10. Изотоп (δ¹⁸O) значение стабильной кислорода эмали зубов определяется изотопного состава кислорода попадает вода, которая включает в себя водных растений и животных продуктов, питьевой воды, дыхания, а также различных экологических последствий на воде что может привести к дальнейшей изотопный фракционирование (например., засушливость, температуры, высоты, количество осадков, континентальной местоположение)¹¹. Это сделало его популярным методом для диетического и экологической реконструкции археологических, палеоэкологические и палеонтологические исследования.

В период формирования эмали зуба является относительно коротким (лет) и отличается в зависимости от зуба производится выборка. Для людей первого моляра эмаль реминерализует от рождения до 3 лет возраста, премоляры минерализации от 1,5 до 7 лет, второй моляров минерализации от 2,5 до 8 лет и третьих моляров минерализации в подростковом возрасте, от 7 до 16 лет¹² . Учитывая что формы эмаль зуба постепенно в течение его периода формирования, он может быть пробы навалом вдоль оси весь рост или последовательно отобранных для того, чтобы исследовать изменения в рационе питания и окружающей среде, которые имели место в период формирования¹³ . Хронологически приказал диетических изменений в пределах данного зуба является наблюдаемый объект для людей и других животных^1,14, предоставляя информацию о межгодовой вариации сезонного и диетических.

В то время как эмаль обычно устойчив к Диагенез, изотопный изменениями, вытекающими из захоронения окружающей среды возможны и наблюдались^15,16, делая экспериментальных проверок и предварительной обработки выбор полезных. Хотя это не только доступный метод, Фурье преобразование инфракрасной спектроскопии (FTIR), особенно в ослабленный режим передачи, возникла как быстрый, недорогой и относительно доступный метод для оценки taphonomic изменения в эмали зубов, особенно в палеонтологических контексты^17,18,19,20. Однако подробных протоколов и стандартов записи остаются относительно недоступными для многих людей за пределами области геохимии или материал науки.

Время реакции и химических веществ, используемых исследователями в предварительной обработки эмали зубов также существенно различаются в литературе, часто с ограниченной рассмотреть вопрос о том, что эта изменчивость может сделать, чтобы стабильные углерода и кислорода изотоп значения образца^{21 ,22}. Здесь мы приводим подход использует разбавить уксусной кислоты (0,1 М) для предварительной обработки образцов порошковой эмалью. Однако учитывая, что различия в изотопного измерения, связанные с предварительной обработкой являются относительно незначительными для эмали зубов, это лучше для исследователей, чтобы следовать протоколы для наборов данных, с которой они хотели бы сравнить свои данные до¹¹. Кроме того где принимаются небольшие последовательные образцы, особенно на голоценовых образцов, без предварительной обработки может быть выбран (после экспериментального диагенетических испытаний) чтобы избежать потерь образца.

Хотя методы, которые мы приводим здесь отнюдь не являются новыми, насколько нам известно, это первый раз, что тщательной документации письменные и визуальные сыпучих и последовательной выборки, предварительной обработки выбора и диагенетических проверить методы (в виде FTIR) для зубов эмаль были предприняты широко доступны в разнообразных академической аудитории. Хотя мы надеемся, наши усилия будут сделать этот подход более доступными для более широкого числа лиц и лабораторий, исследователей, которые хотят применять и опубликовать этот метод должны быть осведомлены о минимальных стандартов, диагенетических соображений, отчетности и требования к презентации сделал обзор других²⁰, а также потенциальных Интерпретив сложностей, которые будут уникальными для их изучения региона, таксонов проанализированы и время периода⁵.

протокол

Следующий протокол следует принципам свет изотопной масс спектрометрии лаборатории в институте Макса Планка для науки истории человечества. Этика соответствующие разрешения от национальных и международных комитетов следует искать для анализов, связанных с находящимися под угрозой исчезновения современных или исторических образцов фауны и для использования археологических и фауны материалов, представляющих интерес для современного заинтересованных сторон . В этом документе используются образцы были археологические и ископаемые образцы. Нет живых людей были использованы в этом исследовании, и полный этические, институциональные и правительственные разрешения получили для любых деструктивных анализа.

1. Массовая выборка

Примечание: Для людей и животных, основной метод массового зубной эмали выборки является применение дрель щечной край зуба.

1. Очистите внешние поверхности зуба (~0.1 мм) с помощью алюминиевой выстрел бластера или нежный истиранию, с использованием буровой установки. Используйте ручной дрелью с чистой алмазов накренилась сверла (см. ниже), даже формы, подключенные через Чак к буровой установке. Обеспечить выполнение нежный и даже износу как параллельно оси весь рост паз (рис. 1 и Рисунок 2).
2. Попытка, где это возможно применить этот метод к же часть зуба для каждого человека или животного пробы.
   Примечание: В исследованиях человеческого paleodietary, третьи моляры обычно выступает как представитель позднего несовершеннолетних/Взрослый диета во время первых моляров избегаются вследствие отвыкания эффекты²³. Предпочтительным зуба для каждого таксонов и период жизни представлены, будут зависеть от имеющихся образцов и вопрос изучается.
3. Просверлите в хорошо проветриваемом помещении при ношении маски, чтобы избежать вдыхания порошка эмали зуба. Надевайте защитные очки для защиты глаз. Имейте в виду, что количество образцов порошка пробурено будет варьироваться в зависимости от оборудования, используемого для анализа, предварительной обработки протокола и размер зуба. Сверлить на низкой скорости для того, чтобы предотвратить Отопление образца.
   Примечание: Приблизительно, 4-8 мг порошка образца является приемлемой целью для нескольких анализа с использованием онлайн газ подготовка и внедрение системы для изотопов соотношение масс-спектрометрии и диагенетических тестирования. Имейте в виду, что выбранный дрель скорость будет зависеть от хрупкость образца и потребует некоторых проб и ошибок. В общем на ручной дрели, два из пяти баров прочности достаточно. Сверлить зуб порошок за кусок чистой алюминиевой фольги или бумаги весом.
4. Собирать результирующий порошковой эмалью и перевести его в микро пластиковых пробирок 1.5 мл, который был тарированного на надлежащим образом точный баланс до бурения. Этикетка каждую пробирку с обозначением образца (рис. 3). Запись чисел и эмаль вес образца в лабораторию ноутбука, а также электронная база данных.
5. Перед сверлением каждый новый зуб, очистите используются сверла, сначала с помощью 0.5 М HCl на надежные ткани. Затем вымойте сверло с органические растворители (ацетон, метанол или этанол) с помощью надежных тканей.
6. После бурения сидя, очистить область, тщательно с использованием специального пылесоса, или совка и кисти. Протрите выборки пространства с метанолом. Пылесосом или слегка спрей дрель с сжатым воздухом, чтобы удалить пыль и образец порошка между выборками.

2. последовательная выборка

Примечание: Последовательной выборки можно подойти в различных формах и будет зависеть от taxon пробы, размер зуба, а также временное разрешение.

1. Очистите поверхность зуба производится выборка путем удаления очень тонкий слой (~0.1 мм) наружный зубной эмали.
2. Дрель образцы вдоль щечной поверхности перпендикулярно оси роста зуба, работает от перекрестка корень эмаль в верхней части кроны. Бурение горизонтальных полос перпендикулярно оси роста, с каждого образца, что приводит к 1-2 мм широкий паз через слой эмали (рис. 1 и Рисунок 4). Позаботьтесь, чтобы избежать бурения через эмаль в дентин, как он будет загрязнять образца и результирующие измерения.
   Примечание: Количество проб будет варьироваться в зависимости от желаемого резолюции но c. 10 представляет соответствующие цели для изучения сезонные изменения в δ¹³C и δ¹⁸O значения для hypsodont размер домоседкадомосед крупного рогатого скота.
3. Выберите соответствующий сверло для каждого образца, как ширина линии отбора проб определяется по диаметру долота.
4. Использование буровой установки для более тонкие зубы, требующих большего количества дополнительных образцов (рис. 2) (например., человеческие зубы), а также для более стабильного сверления. Настройка буровой стенд, который надежно сверло сверлом, указывая вниз.
   Примечание: в то время как четыре образцы легко могут быть получены от постоянного человека моляра, используя ручной подход²⁴, более изысканный выборки требует установки или CO₂ лазерной абляции подход, который не будет обсуждаться здесь¹⁴. Другой распространенный подход заключается в использовании полуавтоматических microsampling²⁵.
5. Держите зуб или прикрепить к струбциной. Нажмите эмаль зуба против сверло и применить давление. Образцы просверливаются постепенно вдоль щечной поверхности от вершины (окклюзионной поверхности) на базе короны в месте стыка эмаль корень (ERJ). Реплицировать того же образца, бурение стратегии, несколько раз бурения каждый подряд линии, параллельной линии предыдущего образца. Используйте небольшие цилиндрические алмазной коронки для деликатной зубов, например овец моляров, с диаметром 1 мм (рис. 1 c).
6. Измерить расстояние линии каждой выборки из ERJ при помощи штангенциркуля и записать это расстояние для сравнения.
7. Выполните шаги 1.3-1.6 выше.
   Примечание: Если анализируются небольшие, тонкие зубы и не применяются методы предварительной обработки и диагенетических проверить, образцы, как малые, как 1-4 мг будет производить надежные результаты на он-лайн газа подготовка и внедрение установки для анализа карбонат. Изменение системы автоматизированной периферической может облегчить использование даже ниже образца весов, но неизбежно ограничивается доля карбоната в изученных эмали (4-5 wt %)^26,27. Исследователи должны консультироваться с лабораторией, где образцы собираются быть измерена определить количество необходимых образцов.

3. Фурье преобразование инфракрасный спектрометрии/ослабленное всего отражения метод

1. Для метода ослабленных полного отражения устанавливают камеры фон образца, или под вакуумом при нормальных атмосферных условиях.
2. Место около 1 мг зубной эмали Алмазный кристалл в зале образца с помощью шпателя. Нижняя и безопасного образец пост до тех пор, пока существует фирма связь между пост, образца и пластину алмазов. Закройте камеру образец, с или без создается вакуум, в зависимости от настройки или доступность.
3. Измерение спектров FTIR образца 64 раза для волновое число, колеблется от 400 до 4000 см^-1. Желаемое количество реплицирует будет меняться в зависимости от целей исследования, хотя анализ трех реплицирует, идеально с различными аликвоты принимаемых и затем вернулся в microcentrifuge трубки, жилье образца, обеспечит надежные результаты.
4. Очистите шпатель с метанолом между каждой Алиготе и каждого образца.
5. Выполнение базовых коррекция с использованием доступного программного обеспечения. Программное обеспечение автоматически вычитает фон образца камеры от результате профилем FTIR. Для обеспечения лучшей воспроизводимости, следует учитывать только эмаль спектры с минимального поглощения 0,06 для высоких фосфатной группы на ~1035 см^-1 .
6. Контролировать наличие общих кальцита карбонат вторичного загрязнения во всех пробах, проверяя пик на 711 см^-1.
7. После анализа осторожно вернуть образцов до их microcentrifuge трубы с помощью шпателя или всасывающего устройства и взять на следующую стадию предварительной обработки или анализа.
8. Экспорт сырья волны и интенсивности данных в виде файла .csv (или аналогичный) и использовать для расчета индексов интереса (часто используемые индексы включают A-сайт фосфат индекс, индекс B-сайт фосфат, фосфат кристалличности индекс, вода-Амид на индекс фосфат, и CO₃/PO₄ индекс^17,18,19) (Таблица 1).
9. Сравните FTIR результаты от ископаемых или археологические образцы растущих наборов данных современной фауны зубной эмали теперь доступны в литературе^19,20 для определения характера и масштабов диагенетических изменения Эмаль пробы.

4. простая уксусной кислоты (0,1 М) предварительной обработки

1. Весят порошковой эмалью для каждого образца в microcentrifuge трубки с помощью баланс при необходимости. Этикетке трубки соответственно. Порошок для эмали должны быть отшлифованы в той же степени, с частицами аналогичного размера.
   Примечание: Многие исследователи используют окислителем, например разбавленных отбеливатель (NaClO) или 30% пероксида водорода (H₂O₂) для удаления органических веществ из выборки и это должны быть добавлены в этот момент. Однако не только может эти реагенты изменить стабильной углерода и кислорода изотоп значения выборки, но спектры образцов костей коллагена в он-лайн газ подготовка и введение системы показывают, что 100% фосфорной кислоты используются в карбонат измерения не реагирует с органических образцов (рис. 5), предполагая, что этот шаг не является необходимым.
2. Добавление каждого образца с помощью пипетки 0,1 мл 0,1 М уксусной кислоты (на 1 мг эмали). Не прикасайтесь образцы с пипеткой. Если образец и пипетки вступают в контакт, используйте новый дозатор для следующего образца чтобы избежать перекрестного загрязнения.
3. Агитировать, либо путем встряхивания или электронных мешалкой (рис. 3), а затем оставить образцы сидеть за 10 мин эмаль порошок не следует оставлять в уксусной кислоты для длительного периода времени (> 4 h).
4. Поместите образцы в microcentrifuge 2 мин на 13 700 x g.
   Примечание: Недорогой альтернативой является использование мини-центрифуга для 4 мин на 3500 x g, который содержит меньшее количество образцов, но меньше времени при работе с наборами большой выборки.
5. Когда программа microcentrifuge останавливается, замените 2 мл сверхчистого воды, с использованием чистой пипетки, затем microcentrifuge образцы для 2 мин на 13 700 x g уксусной кислоты.
6. Измените ультрачистая вода еще два раза, как и прежде и проверить нейтральность. Удалите оставшиеся жидкости с помощью пипетки (не нарушая супернатант).
   Примечание: В общей сложности три автомойки с ультрачистая вода является стандартной процедурой, чтобы добраться до нейтралитета. Образца должны быть вымыты, пока не будет достигнуто нейтралитета.
7. Разрезать листы парафина (1 × 1 см) и поместите каждую пробирку microcentrifuge. Сделайте небольшое отверстие в центре, с помощью объекта резкий, таким образом, чтобы образец сушит надлежащим образом.
8. Место труб в заморозке сушилка для удаления любых оставшихся жидкости.
   Примечание: Если сушилка замораживание не доступны, нежный печь сушки (40 ° C) является также возможность и не должны иметь каких-либо неблагоприятных последствий на стабильной углерод и кислород изотопным данным.
9. После высыхания, удаления парафина и закрыть крышками microcentrifuge. Убедитесь, что трубка маркировки является правильным и переписать при необходимости.
   Примечание: Это окончательный этап до хранения для взвешивания вне, который в лабораториях с ограниченными средствами может быть заключительный этап до распределения образцов для анализа других.

5. Взвешивание и измерение образцов и стандартов

1. С помощью шпателя, взвесьте, примерно в 2 мг порошка эмаль на олово диск на баланс чувствительных к 0,001 мг (рис. 6). Затем тщательно перенесите образец во флакон фосфорной кислоты-боросиликатного стекла. Эта сумма эмали необходима для получения надежных результатов из-за относительно небольшую долю карбонат в эмали зубов.
2. Очистите шпателем между образцы с использованием метанола и использовать свежий, чистый диск или весом судно для каждого образца.
3. Весят, 0,2 мг, таких как МАГАТЭ NBS18, 603 МАГАТЭ, МАГАТЭ CO8 или Merck СаСО₃международного стандарта. Внутренний стандарт, из гомогенизированные эмаль большого зуба может использоваться как хорошо²⁰. Для полного выполнения 76 образцов и стандартов, использование 61 образцов и 15 стандартов, который должен равномерно распределены по всему запуск. Несколько исследований сообщили соответствующие число стандартов и детали в археологических исследований^20,28.
   Примечание: Неоднократные предварительной обработки и анализа эмали в стандарте дом, через количество запусков археологические образцы, вероятно, также для обеспечения надлежащей мерой точности для образцов изучается²⁰.
4. Затяните специально крышками, доступной для иглы до тех пор, пока перегородки туго, но не всасывается в пробирку. Не затягивайте крышки как давление на перегородки будет получать слишком сильным и в конечном итоге может привести к сломанной иглы во время анализа. Место флаконов в указанном порядке в пределах блока Отопление в 70 ° C. Порядок и веса образцов должны регистрироваться для вступления в компьютер программное обеспечение надежно.
5. Измерить образцы, выполнив следующие три шага: 1) флеш заполните образцы с чистого гелия 2) добавления фосфорной кислоты, 3) измерения образца.
   1. Промойте образцы с чистого гелия (класс 5.0) с потоком 100 мл/мин за 5 мин, чтобы избавиться от окружающего воздуха.
   2. Добавить 4-5 капель фосфорной кислоты (99%, плотность 1,85 г/мл) в карбонат содержащие образец. Реакция между образцом и H₃PO₄ начинается. Во время реакции CO₂ выпущена которая осуществляет изотопный значение карбонат иона CO₃^{2 -} образца.
   3. Подождите 1 час на сэмпл пока не достигнуто уравновешивания CO₂ . После 1 h образцы должны измеряться для получения надежных результатов. Во время приобретения, смесь пробы газа и он переходит на устройство. Стадии сушки удаляет воду из образца газовой смеси.
   4. Измерьте образца, начиная с трех пиков CO₂ ссылка газа с известным изотопного состава. Пиковая интенсивность должна быть 4000 mV соответствует интенсивности пиков образца (от 4000 до 8000 м). Три вершины газ ссылка должна быть 20 s длиной и 30 s друг от друга. Следуйте с определением измерения интервала выборки. Измерить образца 10 раз для 5 s каждый и 55 s друг от друга. Убедитесь, что пик высотой уменьшается с течением времени, указывающее транспортировки образца/гелий смеси (рис. 5).
      Примечание: Во время измерения, программа вычисляет изотопного состава образца, сравнивая значение известных изотопных, высота пика и район пика ссылка газа с пик высотой и площади пиков образцов. Сырые ¹³C /¹²C и ¹⁸O /¹⁶O составом образца вычисляется.
6. Нормализовать образцы после измерения.
   Примечание: Это важно, потому что газ ссылка не проходят по тому же пути химические и физические пробы газа при введении в масс-спектрометр. Таким образом важно, что образцы дополнительно калибруются по международным стандартам (шаг 5.3), которые проходят же физические и химические лечения в рамках как собственно образца²⁰. Эти международные карбонат стандарты позволяют две точки калибровки образцов на международных Дельта шкалы измерения и оценки точности и воспроизводимости всей прогоне.

Результаты

С использованием представленные выше процедура отбора, были подготовлены дополнительные эмаль bioapatite образцы. Анализ bioapatite эмали зависит точность выборки, сыпучих или добавочное. В этом случае мы решили представить результаты археологические образцы (две овцы) из раз...

Обсуждение

Вызовы успешных проб (насыпных и добавочное) зубочелюстной системы зависит от доступа к знаниям о методы бурения и пробоподготовки, наряду с инвестиций в оборудование, относительно недорогой. Эти проблемы легко преодолимы, когда ясно, что имеются инструкции, касающиеся отбора проб и пр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dremel Micro	Dremel		https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/8050-micro
Diamond-tipped drill bit	Dremel		https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/accessories/7122-diamond-wheel-point
1.5 mL micro-centrifuge tube	Sigma Aldrich		https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t2422?lang=de&region=DE&gclid=EAIaIQ obChMI7pHRpauW2QIV77ftCh1p1 wjhEAAYASAAEgKzkvD_BwE
Methanol			Linear Formula: CH3OH
Acetic Acid			Linear Formula: CH3CO2H
Dremel rig set-up (workstation)	Dremel		https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/220-01-workstation
Microcentrifuge	Thermo Scientific		http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/75002401
Mini-centrifuge	Sprout		http://www.heathrowscientific.com/sprout-mini-centrifuge-4
Freeze drier	Zirbus Technology		http://www.zirbus.com