Высок объём Cre-Lox активации вирусного мембраны Fusion Assay для выявления ингибиторы синтеза вирусных мембраны ВИЧ-1

Резюме

Мы описываем на основе ячеек пробирного представить доклад о ВИЧ-1 Сплавливание через выражение зеленого флуоресцентного белка обнаружению потока цитометрии или флуоресцентной микроскопии. Он может использоваться для тестирования ингибиторы вирусный вход (специально на шаге фьюжн) в системах свободных клеток и клеток к инфекции.

Аннотация

Этот assay предназначен для специально доклад о ВИЧ-1 Сплавливание через выражение зеленого флуоресцентного белка (ГФП) обнаружению потока цитометрии или флуоресцентной микроскопии. Репортер вирусов ВИЧ-1 (ВИЧ-1 кляп МСВЗ) генерируется, вставив рекомбиназа КРР в геном ВИЧ-1 между матрицей и капсульных белков polyprotein кляп. Это результаты в упаковке рекомбиназа КРР в частицы вируса, который затем выпущен в целевой ячейке строки, стабильно выражая Cre рекомбиназа активированный красный флуоресцентный белок (RFP) GFP переключатель кассету. В состоянии базальной эта кассета выражает только ППП. После доставки рекомбиназа КРР в целевую ячейку ППП, обрамленная loxP сайтов, акцизы, результате экспрессия гена GFP. Этот assay может использоваться для проверки любых ингибиторов вирусный вход (специально на шаге фьюжн) в системах свободных клеток и клеток к инфекции и был использован для идентификации класса антагонистов рецепторов purinergic как Роман ингибиторы синтеза вирусных мембраны ВИЧ-1.

Введение

Потребность в новой антиретровирусной терапии побудило развитие экранов высокой пропускной способностью для ингибиторы ВИЧ-1 записи. Assay репортера кляп МСВЗ разработана для выявления ингибиторы вирусные записи на шаге фьюжн в системе к ячейке инфекции, специально измеряя вирусный мембраны сплавливание с принимающей клеточной мембраны¹. Assay была разработана экран Роман ингибиторов, которые действовали непосредственно на ранних стадиях ВИЧ-1 инфекции до точки синтеза вирусных мембраны. Один вызов для измерительных ячеек инфекции является, что первоначальный посевным материалом содержит инфицированных доноров клетки и клетки ininfected цели, поэтому измерение новой инфекции трудно различать из ячеек ввода. Идеальная система будет включать маркер гетерологичных генов, который может быть вызвана начало целевой ячейки инфекции и не присутствует в клетке доноров. Популярных вирусных содержимое смешивания пробы, основанные на слияние вирусного белка фермента, Блам-Vpr, может быть эффективным, но имеет ограничения для высокой пропускной способности, ячейке скрининг². Этот assay включает бета лактамаз (Блам) Репортер ген, который сливается с ВИЧ-1 Vpr, упаковывается в вирионы и доставлены в клетки-мишени после вирусных мембраны фьюжн. Субстрат CCF2-AM загружается в цитоплазме клеток-мишеней и подвергается флуоресценции сдвига после расщепления. CCF2-ам субстрата является дорогостоящим и может быть непомерно высокой для экранов высокой пропускной способности. Для того, чтобы отличить доноров и целевые клетки, это необходимо для краска ярлык целевых групп населения. Наконец протокол требует несколько мыть и инкубации шагов, которые могут быть обременительными и дорогостоящими при тестировании большого числа соединений.

Кляп МСВЗ assay был разработан как решение этих вопросов, для разработки высокопроизводительного скрининга для ингибиторы синтеза в ячейке для передачи. Эта система не требует субстрат для загрузки в клетки. Может также использоваться для ячейки свободного исследования и адаптированы для других исследований вирусных фьюжн с помощью псевдо-типизированных частицы вируса ВИЧ-1 кляп МСВЗ. ВИЧ Env опосредованной ячеек фьюжн анализов можно измерить вирус Env белка опосредованной клеток фьюжн, однако они не использовать фактические вирусных частиц как assay кляп МСВЗ ВИЧ-1 и^3,,45. Этот assay может читать с потоком цитометрии или флуоресцентной микроскопии. Она успешно используется для экрана FDA библиотеки, а также небольшая библиотека purinergic ингибиторы^1,6. Другие исследователи выявили также purinergic ингибиторов в fusion ВИЧ-1, используя assay адаптирована и оптимизирована высок объём фьюжн, сообщает передачи вируса инкапсулированное бета лактамаз в цитоплазме^7,8 .

Кляп МСВЗ вирус был разработан с аналогичный подход к кляп iGFP вируса, вставляя Cre рекомбиназа между матрицей и капсид, обрамленная сайты протеаз ВИЧ-1⁹. Cre фермента производится как прекурсор вставлены в пределах polyprotein кляп, созревает активированы протеаз ВИЧ-1 в рамках нарождающегося вирус частиц. Cre доставки зависит, таким образом, доставки содержимого частиц активированного протеазы ВИЧ-1 в целевой ячейке через процесс синтеза вирусных мембраны. Здесь предоставляются две версии протокола. Первый использует населения инфицированы ВИЧ-1 заразить клетки-мишени, учиться непосредственно в ячейке передачи ВИЧ. Вторая версия использует ячейки свободный вирус для изучения клеток бесплатно вирусной инфекции. К ячейке передачи пробирного занимает 7 дней со дня талой клетки, или 5 дней, если клетки уже растаяло и пассированные. Assay клетки бесплатно инфекции могут выполняться в 5 дней, если клетки нужно быть разморожен и 3 дня, если клетки оттаяла и пассированной. Инструкции приведены также для генерации RG (красный зеленый) целевой ячейки линии в нужной ячейки типа (если не используется ранее существовавшие RG целевой ячейки линии) с помощью плазмида, созданные Clevers Lab¹⁰. Рекомендуется, чтобы соответствующие биобезопасности меры предосторожности принимаются с вирус и вирус выражая клетки в этот assay. Мы проводим инфекционных часть этот assay в учреждении культуры ткани BSL2 +. После того, как клетки являются фиксированными, они могут быть проанализированы в стандартный поток цитометрии и микроскопии.

Здесь мы описываем приложения этот assay экран для Роман соединений, которые подавляют синтеза вирусных мембраны ВИЧ-1 (рис. 1). Purinergic рецепторы являются про воспалительных медиаторов. Наша лаборатория продемонстрировал, что не селективных ингибиторов purinergic рецепторов действовать как ингибиторы ВИЧ-1 вирусный мембраны фьюжн⁶. Мы сообщаем, что использование этот assay в высокой пропускной способности можно определить Роман ингибиторов фьюжн вирусный мембраны ВИЧ-1. Мы демонстрируем, что ингибитор purinergic класса рецепторов представляет новый класс ингибиторов синтеза вирусных мембраны ВИЧ-1.

протокол

1. поколение целевой клеточных линий

Примечание: Этот шаг не является обязательным; При использовании существующей линии RG целевой ячейки, начните с шага 2.

1. Cotransfect 70% вырожденная 10 см пластины 293T клетки¹¹ [в 10 мл среды (DMEM) Дульбекко изменение орла с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС)] с pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE¹⁰ и pCL-10A1¹² (упаковка плазмида) в соотношение 1:1 (всего 20 мкг) с использованием на основе кальция трансфекции¹³.
2. Урожай 10 мл вирусных супернатанта 48 ч после трансфекции закупорить СМИ от пластины в 15 мл Конические трубки и центрифугирование трубки на 3000 x g 5 мин при 23 ° C до Пелле любой ячейки мусор.
3. Прикрепите 0,45 мкм фильтр в шприц 10 мл. После центрифугирования взять весь супернатанта и загрузить шприца. Запуск образца в чистые 15 мл трубку.
4. Алиготе отфильтрованных вирусный супернатант в соответствующих размеров (как правило, 0,5 – 1 мл аликвоты). Эти могут быть использованы сразу на следующем шаге или может быть замороженные при температуре-80 ° C и хранятся.
5. Используйте 50 – 100 мкл вирусных супернатант заразить клетки линии выбора в 96-луночных пластине. Культура клетки при 37 ° C с 5% CO₂. ППП сигнал должен появиться в как только 24 часа под микроскопом флуоресцирования (40 кратном, 532 нм возбуждения, 588 Нм выбросов), но может занять до 72 ч.
   Примечание: В этих экспериментах, Jurkat клетки были использованы, но также могут использоваться и другие типы.
6. Выберите transduced клеток с puromycin путем создания серии 10 скважин и добавление puromycin каждому, оставляя по крайней мере 1 хорошо лечить как элемент управления (использование в диапазоне концентраций от 0,5 мкг/мл до 5 мкг/мл; это может варьироваться в тип ячейки). Монитор, жизнеспособность клеток (лизис клеток будет происходить в клетках без сопротивления puromycin) в течение нескольких дней по сравнению с необработанными управления и использования концентрации puromycin, где выжить только ППП выражая клетки.
   Примечание: Выберите концентрации, где untransfected клетки погибают, а выжить transfected клеток.
7. С помощью потока одноклеточных цитометрии сортировки или ограничивающих разрежения (см. шаги 1.8 – 1.10), расти культур, полученных от одной клетки¹ разработать линию клоновых ячейки (это может занять несколько недель, чтобы расти).
8. При использовании метода разрежения, подсчитать количество ячеек с помощью Горяева и разбавления образца до приблизительно 500 клеток/мл.
9. В 96-луночных пластине Пипетка 50 мкл клетки разрежения в 50 мкл СМИ [Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI) средний с 10% FBS и 2% пенициллин стрептомицином, если с помощью Jurkat клетки] и выполнять серийных разведений 1:1 в 11 скважин, содержащие 50 мкл средств массовой информации. Для достижения наилучших результатов выполните по крайней мере 10 реплицирует.
10. Контролировать рост клеток через микроскопии (40 X) пластины в культуре ткани инкубатора (37 ° C с 5% CO₂) или около 4 недель. Выбор культур низкие концентрации puromycin с ростом (как видно через Микроскоп, 40 X) на клоновых культур.
11. Заморозить аликвоты, центрифугирование 20 мл культуры (500000 клеток/мл, с Горяева) на 800 x g 5 мин при 23 ° C и resuspending его в 500 мкл FBS с 10% ДМСО. Поместите его на-80 ° C, с помощью контейнера клетки замораживание и затем сохранить его в жидком азоте.

2. в ячейке вируса

1. Подготовка клетки-мишени
   1. Оттепель один 500 мкл флакона Jurkat RG репортер клеток, поместив его в ванну воды 37 ° C. Пипетка клетки от флакон 10 мл RPMI полного среднего и затем центрифуга смеси на 800 x g 5 мин при 23 ° C. Ресуспензируйте гранулы в 20 мл RPMI полной среды в T-75 колбу. Инкубируйте колбу на ночь (37 ° C и 5% CO₂).
      Примечание: RPMI полный носитель содержит RPMI 1640, 10% FBS, 2 мм L-глютамином, 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина 100 мг/мл.
   2. Следующий день, добавьте 0,5 мкг/мл puromycin (1 мкл акций 2 мг/мл мл 8 СМИ). Культура клетки, поддержание плотности 200 000 – 800 000 клеток/мл ( через Горяева насчитал).
   3. День перед настройкой assay переноса, разбить ячейки до 200000-400000 клеток/мл в свежих RPMI среде, содержащей 0,5 мкг/мл puromycin.
2. Подготовка донорских клеток
   1. Потепление untransduced Jurkat клеток и культуры их в T-75 колбу с 20 мл RPMI завершить среднего (как описано в шаге 2.1), сохраняя плотностью 200 000 – 800 000 клеток/мл.
   2. Центрифуга 7500000 клетки (800 x g 5 мин) и Ресуспензируйте их в 120 мкл раствора nucleofection V с дополнением (см. Таблицу материалы). Передать кювет electroporation клетки и добавьте 4,5 мкг кляп МСВЗ¹ ДНК. Transfect клетки (через подход, основанный на электропорации, см. Таблицу материалы) с помощью соответствующей программы (например, S-18) и затем немедленно перевести их в 3 мл RPMI среднего (с 10% FBS).
   3. Позволяют клеткам восстанавливаться по инкубации их на ночь при 37 ° C с 5% CO₂.
   4. На следующее утро, центрифуга клетки на 800 x g 5 мин при 23 ° C и Ресуспензируйте их в 3 мл RPMI полного среднего, позволяя им 2 h восстановить при 37 ° C (5% CO₂) прежде чем приступить к настройке пробирного.
3. Совместное культура
   1. Подсчет количества ячеек, используя Горяева то спин вниз 50000 клетки (800 x g 5 мин при 23 ° C) за хорошо быть assayed (клеток как доноров, так и цели). Resuspending 1 x 10⁶ клеток/мл в RPMI полным без puromycin.
   2. В одной пластине добавьте 25 мкл суспензии клеток доноров в каждой скважине; в другой пластине 25 мкл целевых ячеек.
   3. Для каждой скважины добавьте 25 мкл составные теста разводят в RPMI полного среднего в соответствующей концентрации. Инкубируйте доноров и целевой ячейки с комплекса за 30 мин.
      Примечание: Концентрация будет варьироваться в зависимости от наркотиков. Если оно имеет известный IC₅₀, используйте это в качестве отправной точки титрования выше и ниже. Если неизвестен IC₅₀ , подготовьте 200 мкм запас для конечная концентрация 10 мкм.
   4. После предварительной обработки объединить доноров клеток с клеток-мишеней, закупорить содержимое одной пластины в другую и инкубации клеток для 40 h в инкубатор культуры ткани при 37 ° C с 5% CO₂.
4. Проточная цитометрия
   1. Добавьте параформальдегида (PFA) для каждой скважины до конечной концентрации 2%.
      Примечание: Для 16% акций решения, это 14 мкл на 100 мкл хорошо.
   2. Предупреждение: PFA вреден для кожи и глаз. Носите пальто лаборатории, перчатки и защитные очки и обрабатывать Стоковый раствор в капюшоне безопасности.
   3. Читайте на проточный цитометр с mCherry и каналы FITC ячейки.
      Примечание: Это можно увидеть 5 – 20% клеток, выражая GFP выше фона в инфицированных клетках против. неинфицированных клеток.
   4. Визуализировать GFP сигнала через флуоресцентной микроскопии (40 X) на GFP-конкретных каналов (с фильтром возбуждения 400 Нм и фильтр выбросов 508 Нм).

3. альтернативный протокол для свободных клеток вирусной инфекции

1. Подготовка клетки-мишени
   1. Оттепель один 500 мкл флакона Jurkat RG репортер клеток, помещая в ванну воды 37 ° C. Пипетка клетки от флакон 10 мл RPMI полного среднего и затем центрифуга RPMI полного среднего на 800 x g 5 мин при 23 ° C. Ресуспензируйте гранулы в 20 мл RPMI полной среды в T-75 колбу. Инкубируйте колбу на ночь (37 ° C и 5% CO₂).
   2. Следующий день, добавьте 0,5 мкг/мл puromycin (1 мкл акций 2 мг/мл мл 8 СМИ). Культура клетки, поддержание плотности 200 000 – 800 000 клеток/мл ( через Горяева насчитал).
   3. День перед настройкой assay переноса, разбить ячейки до 200000-400000 клеток/мл в свежих RPMI среде, содержащей 0,5 мкг/мл puromycin.
2. Производство клеток свободный вирус
   1. Transfect 70% вырожденная 10 см пластины 293T клетки¹¹ (10 мл DMEM с 10% FBS) с 5 мкг кляп МСВЗ¹ плазмида с помощью на основе кальция трансфекции¹³.
      Примечание: Эта шкала будет производить 10 мл вируса, который является достаточно для примерно двух-четырех 96-луночных пластины, в зависимости от эффективности transfection.
   2. Урожай весь вирусный супернатант 48 ч, закупорить СМИ от пластины в 15 мл Конические трубки и центрифугирование трубки на 3000 x g за 5 мин до Пелле всех клеток мусора.
   3. Прикрепите 0,45 мкм фильтр в шприц 10 мл. После центрифугирования взять весь супернатанта и загрузить шприца. Запуск образца в чистые 15 мл трубку.
   4. Используйте этот вирус заразить клетки сразу-мишени (шаг 3.3) или заморозить и хранить вирус-80 ° c (оттепель образца при необходимости перед использованием).
3. Инфекции
   1. Подсчет клеток-мишеней RG Jurkat (из шага 3.1.3) с помощью Горяева и спин вниз 50 000 клеток-мишеней в скважине на 800 x g 5 мин, resuspending клеток в 1 x 10⁶ клеток/мл в RPMI завершения среднего без puromycin.
   2. В одной пластине добавьте 25 мкл RG Jurkat клеток-мишеней в каждой скважины; в отдельную тарелку, 25 мкл (2 нг) вирус для каждой скважины.
   3. Для каждой скважины мкл 25 тест соединения, разводят в СМИ на соответствующей концентрации. Инкубируйте клетки и вирус с соединением на 30 мин.
      Примечание: Тест концентрации будет варьироваться в зависимости от наркотиков. Если оно имеет известный IC₅₀, используйте это в качестве отправной точки титрования выше и ниже. Если неизвестно, подготовьте 200 мкм запасов среднего для конечная концентрация 10 мкм.
   4. После предварительной обработки добавьте все содержимое (50 мкл) вирус/соединение микс из скважин к клеткам-мишеням и Инкубируйте все для 40 h в инкубатор культуры ткани при 37 ° C с 5% CO₂.
4. Проточная цитометрия
   1. Добавьте ПФА в каждой скважине до конечной концентрации 2%.
      Примечание: Для 16% акций решения, это 14 мкл на 100 мкл хорошо.
   2. Читайте на проточный цитометр с mCherry и каналы FITC ячейки. GFP сигнал также может быть визуализирован посредством микроскопии флуоресцирования на каналах GFP.
      Примечание: Когда можно ожидать увидеть 5 – 20% клеток, выражая GFP выше фона в инфицированных клетках против. неинфицированных клеток.

Результаты

Неинфицированных клеток Jurkat RG демонстрируют низкий уровень фонового сигнала GFP (0,3%) с очень сильный сигнал ППП (рисунок 2A, неинфицированным столбец). Инфекции с кляп МСВЗ приводит к увеличению в GFP сигнала (24,9%), а наличие ингибитора фьюжн ВИЧ-1 AMD3100 (20 мкм) ?...

Обсуждение

Кляп МСВЗ assay оказался весьма полезным для скрининга наркотиков кандидатов, которые могут препятствовать сплавливание шага вирусной репликации. При выполнении этот assay, наиболее важные шаги, чтобы получить хороший сигнал похожи на большинство вирусных инфекций анализов. Первым важным...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).