В пробирке Формирование собак нейтрофилов внеклеточного ловушка: Динамические и количественный анализ по микроскопии флуоресцирования

Резюме

Мы описываем методы изолировать собак нейтрофилов из цельной крови и визуализировать NET формирования в живой нейтрофилов, с помощью микроскопии флуоресцирования. Также описаны протоколы для количественного определения чистой формирования и citrullinated гистонов H3 выражение (citH3), с помощью микроскопии иммунофлуоресценции.

Аннотация

В ответ на вторжение патогенов нейтрофилов освобождение нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), которые являются внеклеточного сети ДНК, украшенные Гистоны и антимикробные белки. Чрезмерная NET формирования (NETosis) и citH3 релиз во время сепсиса ассоциируется с несколькими полиорганной дисфункции и смертности в мышей и людей, но его последствия в собак неизвестны. Здесь мы опишем технику, чтобы изолировать собак нейтрофилов из цельной крови для наблюдения и количественной оценки NETosis. Лейкоцитов богатые плазмы, порожденных декстрана седиментации, разделенных коммерчески доступных плотность градиента разделения средств массовой информации и гранулоцитов, собранные для мобильных игр и проверки жизнеспособности. Для наблюдения в реальном времени NETosis в живых нейтрофилов, permeant клеток и клеток impermeant флуоресцентные нуклеиновых кислот пятна добавляются нейтрофилов, активированный липополисахарида (LPS) или phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA). Изменения в ядерной морфологии и чистой формирования наблюдаются со временем по микроскопии флуоресцирования. В пробирке NETosis также характеризуется co-colocalization свободных клеток ДНК (cfDNA), миелопероксидаза (МПО) и citrullinated гистонов H3 (citH3) с помощью модифицированных двойной immunolabelling протокола. Чтобы объективно подсчитать чистый формирования и citH3 выражение, с помощью микроскопии флуоресцирования, сетки и citH3-положительных клеток являются количественно в ослепленный манере с использованием доступного программного обеспечения. Эта техника является конкретным пробирного для оценки в vitro способности собак нейтрофилов пройти NETosis.

Введение

Нейтрофилы являются недолго гранулоцитов ответственных за первоначальный обороны против вторгаясь патогенов. Нейтрофилы, набранных на месте инфекции, устранения микроорганизмов, фагоцитоз, дегрануляция и поколения реактивнооксигенных видов (ров)¹. Присутствии бактерий или эндотоксинов нейтрофилов освобождение нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), состоит из внеклеточного хроматина украшен Гистоны и гранулированный белки как эластазы и миелопероксидаза (МПО)². Хотя сеток незаменимым противомикробными свойствами, увеличивая экспериментальных и клинических доказательств свидетельствует о том, что фанатичным NET формирования во время сепсис может привести к нескольким орган дисфункции и смерти^{3,4, 5 , 6}.

Потому что сети могут играть аналогичную роль патофизиологических в собак, терапевтических вмешательств, которые либо предотвратить или уменьшить NET формирования может служить стратегии Роман лечения в септик животных. По этой причине существует необходимость надежный метод для определения и количественной оценки NETosis и чистых компонентов в собак. NET компонентов, включая свободных клеток ДНК (cfDNA) и нуклеосом ранее были оценены в собачьей нейтрофилов и плазмы от клинических собак^7,8,9. Использование флуоресценции анализов, Goggs и Letendre обнаружил, что септик собаки имеют более высокий уровень cfDNA чем здоровые собаки⁸. Хотя эти методы являются весьма объективные и количественных, измерение cfDNA и нуклеосом как маркеры NETosis неспецифической, так как они могут быть производными от некротических клеток, кроме NETosing нейтрофилов. Здесь мы описываем метод, который использует микроскопии флуоресцирования для изучения поведения живых NETosing нейтрофилов. Мы также подробно измененный Протокол, с помощью двойного immunolabeling субъективно количественной оценки сетей и их компонентов, таких как МПО и citH3 в собачьей нейтрофилов¹⁰.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все методы, описанные здесь были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом в университете Калифорнии, Дэвис (протокол номер: 18338).

1. крови коллекции

1. Нарисуйте 10 мл крови от либо предлежании или шейных вен иглой 21 G с помощью шприца аспирации.
2. Чтобы избежать чрезмерного напряжения сдвига, удалите иглу от шприца перед передачей крови в трубки, содержащих гепарин натрия (75 USP). Аккуратно перевернуть трубы несколько раз для обеспечения надлежащего смешивания антикоагулянт и крови. Проверка свидетельства сгустки или агрегатов эритроцитов до размещения образцов на льду.

2. нейтрофилов изоляции

1. Разбавьте антикоагулянтом крови с равным объемом ледяной Dubecco фосфат амортизированное saline (DPBS) (рН 7,4, без двухвалентной катионы). Перевод 8 мл разбавленной крови на 50 мл полипропиленовые конические трубка, содержащая 25 мл 3% декстрана (от Leuconostoc spp., растворенного в 0,9% растворе хлорида натрия). Положите трубку upright в комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы позволить агрегации и оседания эритроцитов.
2. Тщательно слой 5 мл плазмы лейкоцита-богатые люди (рис. 1) на вершине 5 мл градиента плотности СМИ в 14 мл полипропиленовые раунд дно трубки. Будьте осторожны, чтобы не смешать 2 решения¹¹.
3. Центрифуга для трубы на 400 x g с ускорения/замедления (A/D) установлено значение 0 (без тормозов) за 30 мин при комнатной температуре.
4. С помощью 5 мл Серологические Пипетки собирать слоя клеток гранулоцитарного, минуя плазмы и периферической крови одноядерных клеток (КСДОР) слоев (рис. 1). Используйте новый накапайте каждый раз для сведения к минимуму загрязнения.
5. Место 4-6 мл polymorphnuclear (ПМН) слоя клеток в 50 мл полипропиленовые Конические трубки. Поскольку небольшое количество эритроцитов агрегатов может быть придыхательным вместе со слоем ПМН, используйте 1 мл Серологические Пипетки аккуратно удалить агрегатов эритроцитов, которые поселились в нижней части трубки.
6. Лизируйте оставшиеся эритроцитов с 20 мл холодной воды, сверхчистый. Аккуратно перевернуть трубку несколько раз за 30-60 s для обеспечения адекватного лизировать перед добавлением равного количества ледяной 1,8% раствором хлорида натрия.
7. Центрифуга на 112 x g для 10 мин при температуре 4 ° C, A/D, равным 0.
8. Повторите шаг Лизис эритроцитов, если это Пелле появляется красный. Отменить супернатант тщательно с Серологические Пипетки и нежно ресуспензируйте гранулы в 100 мкл DPBS (декстроза 5 мм, 0,9 мм MgCl₂, 1,9 мм CaCl₂ и 1% бычьего сывороточного альбумина, рН 7.3). Объединить все ресуспензированы клеток и место на льду.
9. Выполните отсчет клетки, с помощью анализатора автоматизированные ячейки и проверить счетчик Горяева. При необходимости сконцентрировать ПНЛ на слайд стекла с помощью cytocentrifuge (1000 об/мин, 5 мин) и определить процент нейтрофилов, подсчитывая количество нейтрофилов из общего числа клеток.
10. Определить жизнеспособность нейтрофилы, выполнив испытания изоляции Трипановый синий как говорится Strober соавт. ¹² успешных изоляции должна принести жизнеспособность от 95 до 100% и нейтрофилов должен быть более чем на 95%.
11. Определите концентрацию нейтрофилов путем умножения числа общей ячейки с процент жизнеспособность и процент нейтрофилов. Успешной изоляции должна принести концентрации нейтрофилов от 1,5 до 6 x 10-6/мл.
12. Разбавляют нейтрофилов до конечной концентрации 1 x 10-6/мл DPBS, содержащих декстрозы 5 мм, 0,9 мм MgCl₂, 1,9 мм CaCl₂и 1% бычьего сывороточного альбумина с pH скорректирована с 7.3.

3. Люминесцентная микроскопия живой нейтрофилов

1. Место 200 до 400 мкл нейтрофилов (1 х 106/мл) в каждой скважине поли L-лизин покрытием плиты 12-ну культуры. Разрешить нейтрофилов присоединиться к нижней части скважины по инкубации клеток при 37 ° C за 30 мин.
2. Ярлык нуклеиновых кислот с 1 мкм, один из двух нуклеиновой кислоты красителей, один, что пятна в клетках при интактном плодном пузыре и один, что пятна в клетках с проницаемой мембраны (см. Таблицу материалы), для 10 мин при комнатной температуре.
3. Активация нейтрофилов с 100 мкг/мл липополисахарида (LPS) (E. coli O55. B5), 100 Нм phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) как положительный контроль, или эквивалентный объем DPBS как отрицательный контроль для 180 мин при 37 ° C.
4. Получение изображений с помощью GFP (возбуждения: 470/22 Нм, выбросов: 525/50 Нм) и Техас красный каналы (возбуждения: 585/29 Нм, выбросов: 628/32 нм) на микроскопии флуоресцирования на 40 кратном в следующее время: 30, 90, 120 и 180 мин.

4. чистый количественной оценки и выявления чистых компонентов с помощью иммунофлуоресценции

1. Осторожно поместите скользит крышка поли-D-лизин покрытием диаметром 18 мм в скважины культуры 12-ну пластины. Метки колодцев надлежащим образом.
2. Семена от 100 до 200 мкл изолированных нейтрофилов (1 x 10-6/мл) непосредственно на coverslips и позволяют нейтрофилов присоединиться к обложке скользит по инкубации клеток при 37 ° C за 30 мин.
3. Активация нейтрофилов, как описано в разделе 3.3. Подавляют NET формирования путем предварительной обработки нейтрофилов с 200 µΜ Cl Амидины (15 мин., 37 ° C) до активации, как описано ранее, Li et al. ¹³ обеспечить что надлежащего транспортного средства управления (ДМСО) включен в эксперименте.
4. Осторожно удалите крышку скользит с тонкой щипцами. Слой парафина фильм лист над пробирку стенд для создания неглубоких колодцев и место 2-3 капель 4% ПФА в каждом хорошо¹⁰. Надлежащим образом метки колодцев и аккуратно класть Обложка скользит вниз на PFA-заполнены скважин. Разрешить клеток фиксируются при комнатной температуре в течение 20 мин.
5. Вымойте клетки 3 раза в DPBS на 5 мин, перемещая их из одной скважины к следующему.
6. Если immunolabelling не может быть выполнено вскоре после активации нейтрофилов и фиксации, позволяют скользит крышка быть воздушная сушка, поместив скользит крышка лицом вверх на кусок бумаги поглощения. Скользит крышка может храниться до 1 недели лицом вверх в маркированных культуры 12-ну пластины на 4 ° C до дальнейшего анализа. Вымойте клетки 3 раза в DPBS за 1 мин, используя ту же технику, как описано в 4.4 перед переходом к следующему шагу.
7. Для разрушения клеток, аккуратно заложить покрытие скольжения вниз, на капли 1% NP-40 за 1 мин, используя технику, переходите к пункту 4.4. Вымойте 3 раза в DPBS за 1 мин на рокер.
8. Случайным образом назначить ряд каждый образец и использовать маркер точки алмазов для обозначения coverslips соответственно.
9. Подготовка и лейбл отдельных Петри облицованная пленкой парафина и место 100 до 200 мкл 5% козьего сыворотки на фильм (блокирующий буфер). Заложить coverslips вниз для блокировки буфера. Место на рокер и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
10. Вымойте 3 раза в DPBS 5 мин на рокер.
11. Разбавить основное антитело (1: 400 кролика polyclonal анти citrullinated гистонов H3 (citH3) в 5% козьего сыворотки). Инкубируйте клетки в обозначенные Петри, облицованная пленкой парафина. Положите каждая крышка выскальзования вниз на 50 до 100 мкл раствора разбавленные антитела. Место на рокер и инкубировать 1 час при температуре 37° C.
12. Вымойте 3 раза в DPBS 5 мин на рокер.
13. Разбавить вторичное антитело проспряганное Флюорофор (1: 200) в 5% козьего сыворотки. Инкубируйте клетки в обозначенные Петри, облицованная пленкой парафина. Положите каждая крышка выскальзования вниз на 50 до 100 мкл раствора разбавленные антитела. Место на рокер и инкубировать 1 час при 37 ° C в темноте.
14. Вымойте 3 раза в DPBS 5 мин на качалку в темноте.
15. Для одновременного обнаружения миелопероксидаза (МПО) выполните следующие шаги для модифицированных двойной immunolabeling протокола, как описано в Li et al. ¹³
16. Инкубируйте клетки в обозначенные Петри, облицованная пленкой парафина. Заложить каждый покрытие скольжения вниз на 100-200 мкл 10% кролик сыворотки под плавное покачивание (ночевка, 4 ° C, в темноте).
17. Вымойте 3 раза в DPBS 5 мин на качалку в темноте.
18. Инкубируйте клетки в 50 мкг/мл неконъюгированной коза анти кролик Fab фрагментов втечение 2 ч при комнатной температуре на качалку в темноте.
19. Вымойте 3 раза в DPBS 5 мин на качалку в темноте.
20. Разбавьте первичное антитело (1: 200 кролика polyclonal против человека MPO антитело) в 5% козьего сыворотки. Инкубируйте клетки в обозначенные Петри, облицованная пленкой парафина. Положите каждая крышка выскальзования вниз на 50 до 100 мкл раствора разбавленные антитела. Место на рокер и инкубировать 1 час при 37° C в темноте.
21. Разбавить вторичное антитело проспряганное Флюорофор в 5% козьего сыворотки и инкубировать как описано в 4,8
22. Вымойте 3 раза в DPBS 5 мин на качалку в темноте.
23. Вмешательства управления должно быть подготовлено исключая инкубации с либо первичных антител на втором шаге иммунной маркировки.
24. Пятно ДНК с 300 Нм 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, дигидрохлорид (DAPI) за 5 мин в темноте при комнатной температуре.
25. Вымойте 3 раза в DPBS за 1 мин на качалку в темноте.
26. Нанесите каплю (~ 50 мкл) из antifade mountant на стеклянное скольжение. Аккуратно нажмите края coverslip на чистую фильтровальную бумагу, чтобы удалить избыток буфера перед монтажом coverslip с клетками вниз головой. Средство установки должны составлять тонкого слоя между coverslip и стеклянное скольжение. Чтобы удалить пузырьки воздуха, очень осторожно нажмите на coverslip с тонкой щипцами.
27. Разрешить образцы для лечения на ночь в темноте при 4 ° C. Средство установки следует затвердеть для микроскопического анализа с линзами погружения. Хранить образцы в 4 ° C в темноте.

5. нейтрофилов внеклеточного ловушку количественная оценка

1. Слепой грузовое получения и анализа изображения микроскопа в экспериментальных условиях.
2. С помощью микроскопа флуоресценции в 40 кратном, принять 10 изображений случайным образом из различных регионов каждого coverslip в эксперименте по соответствующим каналам. Убедитесь, что время экспозиции, яркости и контрастности каждого канала хранятся несогласованной приобретения изображений.
3. Анализ изображений с помощью программного обеспечения таких как ImageJ (НИЗ). Идентифицировать сеток на основе совместного локализации cfDNA, citH3 и MPO (Рисунок 3А, B). Подсчитать количество сетей и нейтрофилов в 10 случайных полей для каждого экспериментальные условия. Номера сетки выпустила может быть выражено как соотношение (количество сетей: общее количество нейтрофилов) для каждого экспериментальные условия.
4. Оценить эффекты лечения на внутриклеточную citH3 выражение, подсчитать количество нейтрофилов с внутриклеточной citH3 и количество нейтрофилов без внутриклеточных citH3 в 10 случайных полей при 40 кратном под соответствующие каналы ( Рисунок 3, красные стрелки). Внутриклеточных citH3 выражение может быть выражен как отношение числа нейтрофилов с внутриклеточной citH3 на количество нейтрофилов без внутриклеточных citH3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя этот протокол живых клеток, следователи могут наблюдать Ядерное словотолкование, целостность плазматической мембраны и присутствие cfDNA в живых нейтрофилов. Клетки impermeant ядерных краситель пятна ядер кислот красный в клетках с поврежденных клеточных мембра?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы представляем здесь протокол наблюдать изменения в конформации и cfDNA версии ядра в живых собак нейтрофилов, используя permeant красителя клетки и клетки impermeant краситель. Основным преимуществом этот assay является, что он позволяет для реального времени обнаружения чистой формирования при ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma	31392	Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS	GE Life Sciences	17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	A1285801	With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136	Without divalent cations
E. coli O55:B5	InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S11368	5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7578	1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40	Pierce	28324
Poly-D-Lysine coated coverslips	neuVitro	H-12-pdl	12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments	Jackson ImmunoResearch	111-007-003	Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody	Dako	A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306