JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Mitophagy, селективный деградации митохондрий, был вовлечен в митохондриальной гомеостаза и дерегулирование в различных заболеваний человека. Однако удобный экспериментальные методы для измерения активности mitophagy весьма ограничены. Здесь мы предоставляем чувствительных анализа для определения mitophagy активности с помощью проточной цитометрии.

Аннотация

Mitophagy представляет собой процесс селективного удаления поврежденных или ненужные митохондрий, с использованием машин autophagy. Тесные связи были найдены между дефектных mitophagy и различных заболеваний человека, включая нейродегенеративные заболевания, рак и болезни обмена веществ. Кроме того недавние исследования показали, что mitophagy участвует в нормальных клеточных процессах, например дифференциация и развития. Однако конкретная роль и лежащих в основе mitophagy молекулярные механизмы требуют дальнейшего изучения. Таким образом крайне важно разработать надежный и удобный способ для измерения изменений в mitophagy деятельности. Здесь мы описываем подробный протокол для количественной оценки mitophagy деятельность через проточной цитометрии, с помощью ориентированных на митохондрии флуоресцентный белок Keima (mt-Keima). Этот assay цитометрии потока можно анализировать mitophagy более быстро и деликатно, чем обычные микроскопия - или immunoblotting-на основе методов. Этот протокол может применяться для анализа mitophagy активности в различных типах клеток.

Введение

Митохондрии являются органеллы, которые необходимы для пролиферации клеток и физиологии. Митохондрии отвечают за создание более чем 80% поставок СПС через окислительное фосфорилирование, и они также предоставляют различные метаболические интермедиатов для биосинтеза и метаболизм1,2. Помимо их роли в энергоснабжении и метаболизм митохондрии играют центральную роль во многих других важных процессах, включая реактивнооксигенных видов (ров) поколения, регулирование клеточной смерти и внутриклеточных Ca2 + динамики3 . Изменения в митохондриальной функции были связаны с человека болезней, включая рак, сахарный диабет и различных нейродегенеративных заболеваний4,5. Увеличение митохондриальной дисфункции и митохондриальных мутаций ДНК также думал вносить нормального старения процессов6,,78. Таким образом контроль качества является ключевым вопросом в митохондриях. Митохондрии являются высокодинамичные органеллы, которые непрерывно можно изменить их форму между удлиненным сетей и короткие, раздробленной формой. Митохондрии динамики играет важную роль в поддержании функции митохондрий, а также их деградации через mitophagy9.

Mitophagy — это механизм, который включает селективного деградации всего митохондрий, с использованием механизма autophagy. Mitophagy является принцип механизма основной митохондриальную оборот и удаление поврежденных или неблагополучных митохондрий. В этом процессе митохондрии окружены сначала мембраны, что приводит к формированию autophagosomes, которые затем сливаются с лизосомы гидролитическая деградации9. Предыдущих генетические исследования в дрозофилы предложили что два генов, связанных с болезнью Паркинсона, PTEN-индуцированной предполагаемого киназы 1 (PINK1) (PARK6) и Паркин (PARK2), функционировать в том же пути10,11. Самой длинной общей подпоследовательности исследования показали, что путь PINK1-Паркин отвечает за устранение повреждения митохондрий и дефектов в результате этот путь в неблагополучных mitophagy и может способствовать болезни человека12,13. Дефекты в mitophagy процессах были недавно найдены в различных человеческих заболеваний, включая рак, болезни сердца, заболевания печени и нейродегенеративные болезни 14. Кроме того недавние исследования также показали, что mitophagy имеет решающее значение для многих физиологических процессов, например дифференциация, развития и иммунный ответ15,16,17,18 ,19, предполагая, что mitophagy могут играть более активную роль в управлении функции клеток.

Несмотря на недавнее подтверждение, что mitophagy играет важную роль в обоих качества управления в митохондриях и болезней человека, лежащие в основе mitophagy молекулярные механизмы остаются плохо понимают. Хотя механизмы, связанные с mitophagy систематически исследованы в дрожжи, исследования, направленные на изучение механизмов, связанных с mitophagy, в клетках млекопитающих главным образом на PINK1-Паркин путь. Предыдущие исследования установили, что путь PINK1-Паркин отвечает главным образом за селективное удаление поврежденных митохондрий через mitophagy12,,2021. Однако недавние исследования сообщили, что в некоторых моделях, mitophagy может быть активирован даже в отсутствие функциональных PINK122,,23-24. Эти результаты показывают, что в дополнение к PINK1-Паркин путь, там еще неопознанных путь, который может активировать mitophagy.

Отсутствие удобного метода для оценки деятельности mitophagy является серьезным препятствием для изучения путей, которые регулируют mitophagy и его роль в патофизиологической событий. Электронная микроскопия является мощным инструментом непосредственно визуализировать охватил autophagosome митохондрий. Однако электронная микроскопия имеет ограничения в количественном определении mitophagy активность. Хотя стратегии, которые используют связанные микротрубочек белка-1 легкая цепь 3 (LC3)-конъюгированных флуоресцентных зондов, например GFP-LC3, в настоящее время наиболее широко используемых подходов25, преходящий характер на основе LC3 сигнала и его высокий уровень ложно положительных сигналов ограничивают его чувствительность обнаружения mitophagy в клетки26. Сочетание Западный blotting для измерения уровня митохондриальных белок, количественная оценка митохондриальной ДНК и анализ микроскопии флуоресцирования colocalize митохондрий с autophagosomes или лизосомы будет хорошим подходом для оценки mitophagy. Однако количественная оценка ограничений и отсутствия удобства существующих методологий требуют новых подходов. Введение новой рН зависимых флуоресцентный белок, митохондриальных целевой Keima (mt-Keima), значительно улучшить способность обнаруживать mitophagy27. Смешав последовательности митохондриальной ориентации цитохрома с-оксидазы субъединицы VIII (Кокс VIII) в Keima, mt-Keima направлена на митохондриальной матрицы. Большой сдвиг в пик возбуждения Keima от 440 Нм до 586 Нм (соответствует рН 7 и pH 4, соответственно) могут быть использованы для оценки mitophagy с хорошим чутко в как in vitro и in vivo эксперименты28,29 . Что еще более важно сопротивление МТ Keima лизосомальных деградации вызывает интеграции МТ Keima сигнала в лизосомы, позволяя легко количественного измерения активности mitophagy. Флуоресценции изменение, которое происходит в МТ Keima могут быть проанализированы с использованием либо конфокальная микроскопия поток или цитометрии28,29. Однако на основе цитометрии метод потока для определения mitophagy активности с использованием МТ Keima не обеспечивается в деталях на сегодняшний день.

Здесь мы описываем подробный протокол для потока на основе цитометрии техники для измерения mitophagy активность в клетках, использование МТ Keima. Хотя мы показали здесь, что cytometry анализ потока успешно обнаружен CCCP-индуцированной mitophagy в клетки HeLa, выражая Паркин, этот метод может быть применен к широкий спектр типов клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. поколение клеток HeLa, выражая mito-Keima (mt-Keima)

  1. Подготовка человека mt-Keima
    1. Слой 100-мм культуры блюдо, добавив 2 мл 0,001% поли L-лизин/фосфат амортизированное saline (PBS) и дайте ему постоять 5 мин при комнатной температуре.
    2. Удаление поли L-лизин решения с помощью стеклянной пипетки, подключенных к вакуум и мыть культуры блюдо, добавив 2 мл ПБС.
    3. Плита 1,5 х 106 HEK293T клетки на покрытые культуры блюдо с 10 мл DMEM, содержащие 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина и культура клетки при 37 ° C в инкубатор культуры ткани CO2 на один день.
    4. Transfect 2 мкг МТ Keima лентивирусные плазмида29 ДНК вместе с упаковкой ННО (psPAX 2 мкг и pVSVG 0,25 мкг) с помощью трансфекции реагент для 8 h согласно инструкциям производителя.
    5. Извлеките носитель transfection и добавить 8 мл свежего средств массовой информации.
    6. Сбор средств массовой информации, содержащие вирусных частиц 48 h позже. Удаление сотовой мусора из собранных средств массовой информации центрифугированием на 500 g x 5 мин и фильтровать их с 0,45 мкм фильтром шприца.
      Примечание: Для длительного использования сделать аликвоты лентивирусные частиц и хранить образцы-80 ° c. Избегайте, подвергая вирусных образцов для замораживания оттаивания циклов для эффективного вирусной инфекции.
  2. Заражение клетки HeLa Паркин с МТ Keima Лентивирусы
    1. Клетки HeLa4 Клемная 5 x 10, выражая Паркин (HeLa-Паркин) в 60-мм культуры блюдо с 4 мл DMEM, содержащие 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 ° C за один день до уборки МТ Keima человека.
      Примечание: Из-за отсутствия эндогенного Паркин выражения в НеЬа клетки30, клетки HeLa-Паркин, использованы здесь, чтобы более четко показать CCCP-индуцированной mitophagy. Эта процедура может также применяться к другим основным или увековечен клеточных линий.
    2. Удалите средство роста следующий день и добавьте 1 mL МТ Keima лентивирусные средств массовой информации. Добавьте еще 2 мл среднего роста, содержащий 3 мкл Полибрен раствор (8 мг/мл в дистиллированной воде). Инкубируйте на один день в инкубатор культуры ткани CO2 .
    3. Снимите смесь лентивирусные МТ Keima следующий день и мыть ячейки дважды с ПБС. Добавьте 4 мл среднего роста и лечить клетки с 2 мкг/мл puromycin за два дня.
    4. После двух дней puromycin выбор удалить среднего роста и вымыть клетки дважды с ПБС. Добавьте средство роста и культура клетки в инкубатор CO2 до использования.
      Примечание: Этот метод может применяться для создания клетки, которые стабильно Экспресс МТ Keima, включая другие линии клетки и клетки первичной.

2. побудить mitophagy с помощью CCCP лечения и подготовка образцов СУИМ

  1. Клемная 5 x 104 Паркин НеЬа клетки, выражая МТ Keima в культуре 60-мм блюдо с 4 мл DMEM, содержащие 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина и культура их на один день при 37 ° C в инкубатор культуры ткани CO2 .
  2. Удалите средство роста следующий день и добавить 4 мл свежего DMEM, содержащие 10 мкм карбонильных цианида m-chlorophenylhydrazone (CCCP). Инкубируйте клетки HeLa-Паркин mt-Keima в инкубатор ткани CO2 на 6 ч.
  3. Удалите средство роста 6 h позже и вымыть клетки с 2 мл ПБС. Отсоединить клетки, рассматривая их раствором трипсина/ЭДТА и инактивировать трипсина, добавив среднего роста, содержащие 10% FBS. Перенесите клетки в 15 мл Конические трубки.
  4. Центрифуга клетки на 500 g x 5 мин.
  5. Осторожно удалите среднего роста, стремление и Ресуспензируйте клеток в 1 мл холодного ПБС.
  6. Клетки перехода в соответствующую трубку СУИМ и поместите его на льду.
    Примечание: Подготовьте неинфицированных клеток HeLa в качестве отрицательного контроля.
    Примечание: Клетки являются жизнеспособной на льду на несколько часов, и МТ Keima флуоресценции сигналы также остаются стабильными.

3. СУИМ анализ mitophagy

Примечание: В этом исследовании, клетки были проанализированы с проточный цитометр оснащены лазером 405 нм и 561 Нм. Клетки были в восторге с фиолетовым лазером (405 нм) с выбросов, обнаруженные на 610 ± 10 нм с BV605 детектором и желто зеленый лазер (561 Нм) с выбросов определяется PE-CF594 детектор 610 ± 10 Нм, одновременно (рис. 1).

  1. Шлюзовые живых клеток
    1. Включите проточный цитометр и компьютер и войдите в программное обеспечение для анализа.
    2. Создайте новый эксперимент или дублировать существующие эксперимент. Для возбуждения клеток с фиолетовыми (405 нм) и желто зеленый (561 Нм) лазеры и обнаружения выбросов на 610 ± 10 Нм детектор, выберите BV605 и PE-CF594 помимо вперед точечной (FSC) и стороны точечной (SSC) в окне параметров требуется флуорофоров.
      Примечание: Все флуорофоров должны быть добавлены в линейном режиме.
    3. Вихревой каждый образец клеток кратко разойтись клеток агрегатов.
    4. Место трубка, содержащая управления HeLa Паркин образец клеток, который не заражен с МТ Keima человека на порт впрыска образца и нажмите кнопку «выполнить» на цитометр.
    5. В сюжете точка FSC по сравнению SSC Отрегулируйте FSC и SSC напряжения для размещения ячеек в центре сюжета точка.
    6. Нарисуйте P1 ворота, используя значок многоугольник вокруг живых клеток и устранить омертвевшие клетки и клетки мусора (рис. 2A).
  2. Настройка напряжения для фиолетовый и зеленый лазер
    1. Место труб, содержащих HeLa Паркин клетки, инфицированные с МТ Keima человека на образец инъекции порт и нажмите кнопку «выполнить» на цитометр.
    2. В сюжет точка BV605 (405 нм) по сравнению с ККК, отрегулируйте BV605 напряжения так, что клетки HeLa-Паркин, выражая МТ Keima четко отличать от управления клеток, которые не выражают МТ Keima (рис. 2B).
    3. В сюжете точка PE-CF594 (561 Нм) по сравнению с ККК, настроить напряжения PE-CF594, чтобы клетки HeLa-Паркин, выражая МТ Keima четко отличать от управления клеток (рис. 2B).
  3. Оценить процент клеток в mitophagy
    1. Приобрести BV605 против PE-CF594 точка участок с помощью линейной шкалы. Нарисуйте ворот, используя значок многоугольник вокруг клетки, выражая МТ Keima и ликвидации клеток, не выражая МТ Keima (рис. 3A). Mt-Keima населения флуоресценции положительных клеток называется ворот «МТ Keima».
    2. Создайте еще один участок точка BV605 против PE-CF594 показаны только «МТ Keima»-закрытый клетки. В этом участке точка Нарисуйте ворот вокруг необработанных МТ Keima положительных клеток. Базальной mitophagy деятельность управления НеЬа клетки является низким, и коэффициент выбросов в PE-CF594/BV605-меньше 1. Таким образом этот ворот называется ворот «низкий».
    3. Нарисуйте другой ворота, содержащий регионе выше ворот «низкий». Эти ворота именуется как «высокий» ворота потому, что он содержит ячейки с высокой mitophagy активностью, то есть, клетки с высоким соотношением эмиссии в PE-CF594/BV605 (рис. 3B).
    4. Чтобы вычислить процент клеток в ворота «высокий», выберите в меню «Показать иерархию населения». «Процентов родителей» (% родителей) значение представляет собой процент клеток в «высокий» ворота среди МТ Keima позитивной популяции.
    5. Установите по крайней мере 10 000 событий для записи в ворота «МТ Keima» остановки и запуска каждого образца.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Пример анализа потока цитометрии CCCP-индуцированной mitophagy в клетки HeLa Паркин показан на рисунке 4. Использование метода анализа цитометрии потока, описанных выше, мы можем обнаружить резкое увеличение в mitophagic клетках в ворота «высокий». Процент клеток в...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы представляем быстрый и чувствительных метод использования проточной цитометрии для измерения активности клеточных mitophagy в клетках, выражая МТ Keima. Клетки, переживает высокий уровень mitophagy демонстрируют увеличение соотношения между объемом PE-CF594 (561 Нм) / BV605 (405 нм) возбуждения. Т?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грант от Национальный исследовательский фонд Кореи (2016R1D1A1B03931949) (на ю. д.) и Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF) Грант, финансируемого Кореи government(MSIT) (№ 2016R1A2B2008887, № 2016R1A5A2007009) (для J.Y .)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
poly-L-lysineSigma-AldrichP2636
FBSGIBCO16000-044
penicillin/streptomycinwellgeneLS202-02
PBSHycloneSH30013.02
HEK293TATCCCRL-3216
DMEMGIBCO12800-082
OPTI-MEM GIBCO31985-070
TurbofectThermos scientificR0531
0.45 μm syringe filtersartorius16555
HeLaATCCCCL-2
polybreneSigma-AldrichH92688 mg/ml
puromycinSigma-AldrichP88332 mg/ml 
Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP)Sigma-AldrichC275910 mM
trypsin-EDTAwellgeneLS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessaBD BioscienceLSRFortessa
FACSDIVABD BioscienceFACSDIVA (v8.0.1)

Ссылки

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
  2. Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
  3. Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
  4. Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
  5. Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
  6. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  7. Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
  8. Yun, J., Finkel, T. Mitohormesis. Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  10. Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
  11. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
  12. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  13. Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
  14. Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
  15. Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
  16. Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
  17. Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
  18. Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
  19. Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
  20. Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
  21. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  22. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  23. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  24. Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707(2015).
  25. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  26. Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
  27. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  28. Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
  29. Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  30. Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
  31. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
  32. Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
  33. Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228(2012).
  34. Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657(2016).
  35. Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

138Mitophagymt Keima

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены