Дифференцирование и дифференциации собак яичников мезенхимальных стволовых клеток

Резюме

Здесь мы описываем метод для изоляции, расширения и дифференцирования мезенхимальных стволовых клеток из собачьего тканей яичника.

Аннотация

За последнее десятилетие из-за их легкости изоляции, расширения и культуры возрос интерес к мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Недавно исследования продемонстрировали способность широкий дифференциации, что эти клетки обладают. Яичника представляет перспективный кандидат для терапии на базе ячеек с тем, что он богат MSCs, и что он часто удаляются после овариоэктомии операций как биологические отходы. Эта статья описывает процедуры для изоляции, расширение, и дифференцировки МСК, полученных от собак яичника, без необходимости сортировки клеток методики. Этот протокол является важным инструментом для регенеративной медицины из-за широкой применимости этих крайне дифференцируемая клеток в клинических испытаниях и лечебных целях.

Введение

Число опубликованных исследований, которые сосредоточиться на стволовые клетки значительно увеличился за последнее десятилетие, исследования, который был вызван коллективной цели обнаружения мощный регенеративной медицины терапии. Стволовые клетки имеют два основных определяющих маркеры: self - ремонт и дифференциации. Мезенхимальные стволовые клетки отвечают за оборот обычных тканей и имеют более ограниченные возможности дифференциации по сравнению с¹эмбриональных стволовых клеток. Недавно многие исследования показали широкий спектр дифференциации MSCs, и предметом обсуждения является вопрос о том, существуют ли различия между эмбриональных и взрослых стволовых клеток на все².

Поверхности эпителия яичника является незафиксированных слой клеток, относительно менее продифференцировано, который выражает как маркеры эпителия и мезенхимальных³, сохраняя способность дифференцироваться в различные типы клеток в ответ на Экологические сигналы⁴. Точное местоположение стволовых клеток в яичниках не хорошо известна; Однако было предложено, что родоначальниками bipotential в белочной порождают клетки семенозачатка⁵. Иммунологические исследования предположил, что эти клетки имеют стромальные происхождения⁶ или расположены в или проксимальной поверхности яичников⁷. Так как мезенхимальных стволовых клеток выразить множество рецепторов, которые играют важную роль в ячейке сцепления⁸, эксперимент был разработан для проверки гипотезы, что выбор популяция клеток с Быстрое сцепление будет изолировать население клеток четко characterizable как мезенхимальных в природе. Недавно наша группа сообщила дифференцирование MSCs из тканей яичника, основанные на их способности адгезии к поверхности пластика культуры блюдо в течение первых 3 ч культуры, с целью получения очищенного населения экспонируется Быстрое сцепление⁹клеток. Здесь мы описываем разработанный метод для изоляции мезенхимальных стволовых клеток из тканей яичника.

протокол

Этот эксперимент проводился с яичниками четырех беспородных суки, пожертвовал после плановой операции в программу стерилизации собак. Этот эксперимент был одобрен Комитет по этике использования животных UNESP-FCAV (протокол № 026991/13).

1. Экспериментальная подготовка

1. Подготовка или приобрести 500 мл стерильного Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) без кальция или магния.
2. Подготовить коллагеназы я складе решение путем смешивания 40 мкг фермента в 1 мл DPBS. Фильтр с помощью фильтра шприц 0,2 мкм и хранить 2 мл аликвоты при-20 ° C.
3. Подготовьте культуры СМИ от Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) низкий глюкозы с плода сыворотки 10% и 1% антибиотиков.
4. Собирать стерильных материалов: ножницы, щипцы, культуры ткани колбу, блюда, трубки и 10 мл и 5 мл пипетки.
5. Используйте стандартные ячейки культуры лабораторное оборудование: биологической безопасности кабинета (BSC), клетки культуры инкубатор на 5% CO₂ и 38 ° C и центрифуги.
6. Очистить BSC: в перчатках, стерилизовать его с 70% EtOH, используя УФ лампы.

2. изоляция мезенхимальных стволовых клеток из яичника

1. После операции Держите яичников в PBS на льду в конической трубки, до их прибытия в лаборатории.
2. Заполните две чашки Петри 100 мм с 10 мл ФСБ.
3. Удаление яичников из трубки и передавать их на первый Петри с PBS. Мыть их с смешивания движений.
4. Аккуратно извлечь завязи и поместить его в другое блюдо. С стерильным пинцетом и ножницы фарш ткани на очень мелкие кусочки, размером около 1 мм.
5. Передача тканей яичника до 35 мм Петри и добавить 2 мл коллагеназы. Фарш ткани немного больше.
6. Петри в инкубатор в 38 ° C на 3 h и осторожно встряхивайте Петри с круговыми движениями каждые 20 мин.
7. После 3 h удалите Петри блюдо из инкубатора.
8. Передавать содержимое блюдо 15 мл. Добавьте 5 мл расширения средств массовой информации.
9. Аккуратно Переверните трубку перед центрифугированием. Центрифуга трубки на 2100 x g 7 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 3 мл расширения средств массовой информации.
10. Передать гранулы T25 бутылку. Поместите бутылку в инкубаторе с 5% CO₂ в 38 ° C в течение 3 ч.
    Примечание: Наиболее важной частью процедуры является изменение средств массовой информации через 3 ч инкубации.
11. Удалите из инкубатора бутылку и СМИ с оставшейся ткани. Добавьте 3 мл свежего расширения средств массовой информации к бутылке.
12. Измените СМИ каждые 48 ч и наблюдать за бутылку для сотовых слияния.
    Примечание: Основные этапы процедуры можно наблюдать на рисунке 1.

3. расширение мезенхимальных стволовых клеток из яичника

1. Проход ячейки
   1. Когда клетки достигают слияния, удалите медиафайл из бутылки.
   2. Вымойте бутылку с 3 мл ФСБ. Удаление PBS.
   3. Добавьте 1,5 мл трипсина и поставить бутылки в инкубатор в 38 ° C на 3 мин осторожно коснитесь бутылку, чтобы помочь клетки для отсоединения.
      Примечание: Клетки должны достичь слияния примерно 5 - 7 d после первоначального покрытия.
   4. Добавить 3 мл расширения средств массовой информации и передача содержимого в коническую пробирку.
   5. Центрифуга трубки на 2100 x g 7 мин удалить супернатант и добавьте 1 mL расширения средств массовой информации.
   6. Аккуратно гомогенизировать содержимое трубки.
   7. Возьмите Алиготе 10 мкл пример для выполнения клеток подсчета и положил трубку с клетки обратно в инкубаторе.
   8. Место 10 мкл смеси в Горяева.
2. Подсчет ячеек
   1. Использовать цель 10 X микроскопом и сосредоточиться на линии сетки Горяева.
   2. Подсчитать ячейки в пяти небольших площадей (рис. 2).
   3. Подсчитано число умножьте на 50000, чтобы оценить количество клеток на миллилитр.

4. дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток из яичника

Примечание: Дифференциация анализов были исполнены в соответствии с руководящими принципами, установленными в Хилл и др. ⁹.

1. Семя 1.0 x 10⁴ клетки на колодец, в трех экземплярах, с использованием 4-ну культуры блюдо.
2. Добавьте 1 mL расширения средств массовой информации.
3. Аккуратно агитируйте блюдо с круговыми движениями.
4. После 24 часов замените СМИ желательно дифференциация культуры средств массовой информации.
5. Для остеогенные, адипогенном и хондрогенном дифференцировки, инкубации клеток с индукции СМИ для 30 d, с заменой средств массовой информации были использованы каждые 3 d. конкретные дифференциация комплекты для каждого из этих анализов.
6. Для дифференциации нейрогенный линии инкубации клеток для 10 d в индукции СМИ, СМИ Замена каждые 3 d. Средства массовой информации, используемые здесь содержится DMEM низкий глюкозы, 2 мм вальпроевая кислота, гидрокортизон 1 мкм, 10 мкм форсколин, калия хлорида 5 мм, 5 мкг/мл инсулина и 200 мкм бутилированный hydroxyanisole.
7. Эндодермы прекурсоров Проинкубируйте 5 d в средствах массовой информации энтодермы согласно указаниям производителя реагента.
8. Для дифференциации первичных зародышевых клеток линии инкубации клеток в индукции СМИ для 14 d, с заменой каждые 3 d СМИ. Средства массовой информации, используемые здесь содержится DMEM, 10% FBS, пируват натрия 1 мм, 10 нг/мл LIF, заменимые аминокислоты 1 мм, 2 мм L-глютамина, 5 мкг/мл инсулин, β-меркаптоэтанол 0,1 мм, 60 мкм путресцин, трансферрин 20 мкг/мл, 10 нг/мл мыши эпидермального фактора роста, 1 нг/мл человека Основные фибробластический фактор роста, 40 нг/мл человека глиальных клеток линии нейротрофического фактора и пенициллин 15 мг/Л.

Результаты

Изоляция мезенхимальных стволовых клеток из собачьего яичника:

Яичников процедура изоляции MSC приводится на рисунке 1. После хирургии, измельчения тканей, коллагеназа пищеварение и средства массовой ...

Обсуждение

Здесь мы предоставляем доказательства того, что MSCs могут быть изолированы от собак тканей яичника, которая считается биологические отходы после овариоэктомии. С тем, что многие типы клеток можно найти в яичнике, мы предложили протокол для выбора MSCs, основанные на их быстрое присоединен...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Thermo Fisher	14190144
Collagenase I	Thermo Fisher	17100017
Tissue flask	Corning	CLS3056
DMEM low glucose	Thermo Fisher	11054020
FBS	Thermo Fisher	12484-010
TrypLE express	Thermo Fisher	12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit	StemCell	5110
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15070063
CD45	AbD Serotec	MCA 2035S
CD34	AbD Serotec	MCA 2411GA
CD90	AbD Serotec	MCA 1036G
CD44	AbD Serotec	MCA 1041
Nestin	Milipore	MAB353
β-Tubulin	Milipore	MAB1637
DDX4	Invitrogen	PA5 -23378
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR80F
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR120F