JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем метод, в котором low-density нейтрофилов человека (LDN), оправился от послеоперационных перитонеальный лаваж жидкости, производят массовые нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки) и эффективно ловушки бесплатно опухолевых клеток, которые впоследствии растут.

Аннотация

Активация нейтрофилов освобождение нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), которые могут захватить и уничтожить микробов. Последние исследования показывают, что сети участвуют в различных процессах болезни, например, аутоиммунные заболевания, тромбоз и опухолевых метастаз. Здесь мы покажем подробный в vitro технику для выявления чистой активности во время треппинга бесплатно опухолевых клеток, которые растут после присоединения к сети. Во-первых мы собрали низкой плотности нейтрофилов (LDN) от послеоперационных перитонеальный лаваж жидкости из пациентов, перенесших лапаротомию. Краткосрочные культивирования LDN привели к массовым NET формирования, который был визуализирован с зеленый люминесцентной ядерных и хромосомы изображение. После совместного инкубации линий клеток человека рак желудка, MKN45, OCUM-1 и NUGC-4 с сеткой Нетс были ловушку многие опухолевых клеток. Впоследствии вложение был полностью отменен, деградация сетей с DNase I. Time-lapse видео показали, что клетки опухоли, захваченных Нетс не умрет, но вместо энергично вырос в непрерывной культуры. Эти методы могут применяться для обнаружения клей взаимодействия сетей и различных видов клеток и материалов.

Введение

Превращение ядерной нейтрофилов в циркулирующей крови обычно отделяются от мононуклеарных клеток через метод подготовки градиента плотности. Однако некоторые нейтрофилов, известный как low-density нейтрофилов (LDN), с CD11b(+), CD15(+), CD16(+) и CD14(-) фенотипов, совместной очищенную с мононуклеарных клеток. Относительное количество LDN значительно увеличивается при различных патологических состояниях, включая аутоиммунные заболевания1,2, сепсис3и рак4,5. Предыдущие исследования показали, что LDN являются фенотипически и функционально собственный класс6нейтрофилы. Следует отметить, что LDN в циркулирующей крови чаще производить нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), чем нормальной густоты нейтрофилов2,7. Нетс веб как структуры, состоящий из нуклеиновых кислот, гистонов, протеаз и гранулированных и цитозольной белков, и они могут эффективно завлечь и уничтожить патогенов8.

Недавно было показано сеток захватить не только микробы, но и тромбоцитов и циркулирующих клеток опухоли, которые могут помочь в тромба формирования9 и опухолевых метастаз10,11. Однако молекулярные механизмы за клей взаимодействия сетей и тромбоцитов или опухолевых клеток по-прежнему неясны. Совсем недавно в пробирке адгезии assay показали, что клетки миелоидного лейкоза (12K562) и клетки карциномы легких (13A549) придают сетей через β1 и β3 интегринов. Авторы использовали чистых запасов изолированы от нейтрофилов и активированную phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) как субстрат адгезии14. Хотя этот assay позволяет определение реальных взаимодействий с чистой компонентами в отсутствие нейтрофилов, это спорный ли «клеток свободный чистых запасов» изолированные высокоскоростной центрифугированием сохраняет молекулярной структурой, идентичной сетки производится в VIVO. Недавно мы нашли что перитонеальный лаваж жидкости после абдоминальной хирургии содержатся многие пожилые LDN, который генерируется массивные сеток и придает опухолевых клеток, вызывая перитонеальных метастазов15. В этом исследовании мы успешно изучили адгезию опухолевых клеток с нетронутыми сеток без каких-либо физических манипуляций. Здесь мы показать детали техники для обнаружения клей взаимодействия сетей и бесплатные опухолевых клеток.

протокол

LDN были получены от пациентов, зачисленных в этом исследовании и были одобрены организационного обзора Совет Jichi медицинского университета.

1. изоляция LDN из брюшной полости смывов и чистой обнаружения

  1. Приобретение образца
    1. Влить 1000 мл стерильным физиологическим непосредственно в брюшную полость до закрытия раны в пациентов, которые подверглись абдоминальной хирургии вследствие злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта.
      Примечание: Образцы были получены от пациентов, перенесших гастрэктомия, колэктомия или esophagectomy без предвзятости, на основании возраста или пола. Солевой раствор был переведен в контейнер и выливают в весь живот в течение одной минуты. Обычно это выполняется как послеоперационных перитонеальный стиральные без значительного воздействия на пациентов.
    2. Промывание брюшной полости широко для по крайней мере 1 мин.
      Примечание: Рекомендуется, что заваренного жидкость медленно перемешивают руками хирурга так что образцы являются однородными.
    3. Восстанавливает 200 мл жидкости промывания с четырьмя 50 мл-шприцы.
      Примечание: Иногда резиновый соединитель используется для занять жидкости.
  2. Выполнение очистки перитонеальный LDN, используя конкретные МАБ гранулоцитов, CD66b16.
    Примечание: Поскольку промежуточного слоя после плотность градиентного центрифугирования содержит много мононуклеарных клеток, положительный выбор полиморф нейтрофилов, используя CD66b МАБ была выполнена.
    1. Передать перитонеальный лаваж жидкость 50 мл трубки.
      Примечание: В этот шаг, передайте жидкости через 100 мкм Нейлоновый фильтр для удаления примесей.
    2. Центрифуга перитонеальной жидкости на 270 g x 7 мин на RT.
    3. Ресуспензируйте гранулы в 5 мл PBS с 0,02% ЭДТА.
    4. Тщательно наложение 5 мл суспензии клеток на 3 мл раствора градиент плотности.
    5. Центрифуга на 1700 x g 15 мин на RT без каких-либо перерывов.
    6. Урожай ~ 2-3 мл раствора, содержащего промежуточных слоев (рис. 1A) с помощью пипетки и смешайте его с 10 мл PBS с 0,02% ЭДТА.
    7. Центрифуга перитонеальной жидкости при 400 g x 7 мин на RT и удалить супернатант.
    8. Добавьте еще 10 мл PBS с 0,02% ЭДТА и центрифуги на 270 g x 7 мин на RT. удалить супернатант.
    9. Растворяют в 60 мкл буфера для комплекта разделения магнитных ячейки ячейки Пелле (1 x 10-7).
    10. 20 мкл ФК блока для гранул и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C.
    11. Добавить 20 мкл анти CD66b с микрошарики и инкубировать еще 10 мин при 4 ° C.
    12. Вымойте и вновь приостановить гранулы в 500 мкл буфера MACS.
    13. Применить суспензию клеток к столбцу магнитные в магнитном поле подходящие магнитного сепаратора и собирать потока через содержащих CD66b(-) клетки путем промывания столбец с 15 мл буфера.
    14. Удалите столбец из магнитного сепаратора и немедленно промыть магнитно помечены CD66b(+) клетки, твердо толкает поршень в столбце.
      Примечание: Популяции клеток CD66b(+) состоит в основном из нейтрофилов определяется анализ СУИМ, показывая, что > 95% CD66(+) фракции являются позитивными для CD11b, CD15 и CD16, но негативные для CD14.
  3. Генерация сеток
    1. После центрифугирования в 270 g x 7 мин на RT, вновь приостановить изолированных LDN (5 x 10-6) в 1 мл раствора RPMI1640 с 10% FCS.
    2. Культура LDN на тарелку с покрытием 6-ну поли L-лизин (6 см в диаметре) за 2 ч при 37 ° c в 5% CO2.
    3. Добавьте Зеленый флуоресцентный изображение (мембраны непроницаемый краситель пятно на ядро и хромосом) в конечной концентрации 5 мкм.
    4. Сразу же наблюдать морфология сеток (внеклеточной ДНК компоненты, изгнаны из LDN под микроскопии флуоресцирования).

2. окрашивание опухолевых клеток с красной флуоресцентной клеток компоновщика краска

  1. Подготовка человеческих раковых клеток линии MKN45, NUGC и OCUM-1.
  2. Вымыть 1 x 107 клеток с PBS + 0,02% ЭДТА в 15 мл трубки и центрифуги на 270 x g 7 мин на RT.
  3. Добавить 1 мл раствора для окраски гранул красителя и Пипетка осторожно.
  4. Распустить 4 мкл люминесцентные клеток компоновщика красного красителя в 1 мл раствора для окрашивания и смешать с суспензию клеток от шаге 2.2.
  5. Инкубировать гранулы для 4 мин на RT.
  6. Добавить 4 мл DMEM (10% FBS) остановить окрашивание реакции.
  7. Центрифуга 270 g x 7 мин и удалить супернатант.
  8. Повторите шаги, 2.6 и 2.7 дважды.
  9. Проверить с флуоресцентным микроскопом (возбуждения = 551 Нм, испуская = 567 Нм) что опухолевые клетки являются пятнами красного.

3. анализ опухоли клеточной адгезии к сеткам

  1. Вновь приостановите красных флуоресцентных окрашенных опухолевых клеток (1 x 10-6) в 1 мл RPMI 1640 с 0,1% BSA.
  2. Добавьте опухолевые клетки LDN культуру, которая производится Нетс, как описано в шаге 1.3.
  3. Инкубируйте 5 минут при 37 ° c, что позволяет опухолевых клеток связаться Нетс.
    Примечание: Длительный инкубационный вызывает опухоли клеточной адгезии LDN или пластины.
  4. Удаление среды и осторожно Промыть лунки, добавив 2 мл подогретую СМИ (0,1% BSA + RPMI 1640) и закрученной блюдо.
  5. Повторите процедуру стиральная в шаге 3.4 дважды.
    Примечание: Поскольку сеток слабо прикрепить к пластине, Стиральная должно быть сделано мягко, как можно избежать удаления самих сетей.
  6. Добавьте зеленый флуоресцентные краски для окрашивания ядра и хромосом в конечной концентрации 5 мкг/мл для визуализации сетей.
  7. Наблюдение за сетями и придает опухолевых клеток, используя соответствующие фильтры (зеленый, возбуждения = 504 нм, испуская = 523 Нм; красный, возбуждения = 551 Нм, испуская = 567 Нм).
  8. Слияние цифры, чтобы показать опухолевых клеток, которые оказались в ловушке в сети.
    Примечание: В некоторых экспериментах, фермент деградации ДНК был добавлен в культуре LDN (конечная концентрация 100 ед/мл) 5 мин до совместного инкубации за 5 мин.

4. время Замедленная съемка видео анализ захваченных опухолевых клеток

  1. Культура перитонеальный LDN в 35 мм круглый блюдо с поли L-лизин, как описано в шаге 1.3 покрытием.
  2. Добавьте зеленый флуоресцентные краски для окрашивания ядра и хромосом для визуализации сетей, как описано в шаге 1.3.
  3. После 1 мин инкубации удалите средства массовой информации и добавить 2 мл 0,1% BSA + RPMI 1640.
  4. Удалите средства массовой информации и добавить что безупречная 1 x 10-6 MKN45 клетки приостановлено в 0,1% BSA + RPMI 1640. Инкубируйте 5 мин на RT.
  5. Удалите все неприсоединенные опухолевых клеток, аккуратно мыть как описано в шаге 3.4 и добавьте DMEM с 10% FCS, дополненная 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл.
  6. Маунт культуры блюдо в целом представление ячейки наблюдения системы и выберите соответствующее поле, в котором опухоли клетки попали в сети.
  7. Продолжать совместно культура еще 2 дня и непрерывной фотографировать поля каждые 6 мин под нормальный свет и флуоресценции, который обнаруживает клетки MKN45 и сетки, соответственно.
  8. Наложения изображения на каждом timepoint и построить промежуток времени видео с помощью программы просмотра изображений.

Результаты

В 2-х часовой культуре, CD66b(+) LDN, производные от перитонеальный лаваж жидкости показал строку структуры окрашенных с Грин Люминесцентная краска для ядерной и хромосомы (рис. 1B), при этом мононуклеарных клеток не CD66b(-) (рис. 1 c). Однако, когда L...

Обсуждение

Предыдущие исследования сообщили, что циркулирующих клеток опухоли могут быть захваченных чистой подложки в естественных условиях10,11. Метастатическим груди раковых клеток было показано для стимуляции нейтрофилов и стимулировать формирование сет...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим г-жа J. Shinohara и I. Nieda для технического и канцелярской работы. Кроме того мы благодарим Drs. Shiro Мацумото, Hidenori Харута, Кентаро Kurashina и Кадзуя Такахаси за их сотрудничество в целях приобретения образца в операционной комнате. Эта работа была поддержана целевые субсидии для проведения научных исследований от министерства образования, науки, спорта и культуры Японии и японского общества для содействия развитию науки (17K 10606).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare, SWEDEN17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeadsMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-104-913
Fc blockMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-059-901
MACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-091-222
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-091-376
LS ColumnsMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-041-306
MACS Magnetic SeparatorMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSOThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAS7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane LabelingSigma-Aldrich, St Louis, MO, USAP9691
Diluent CSigma-Aldrich, St Louis, MO, USACGLDIL
RPMI1640 MediumSigma-Aldrich, St Louis, MO, USAR8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAD5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAD8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)nacalai tesque, Japan06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regionsgibco by life technologies, Mexico10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAA2153
Penicillin StreptomycinLife Technologies Japan15140-122
Plasmocin ProphylacticInvivoGen, San Diego, CA-USAant-mpp
DNase IWorthington, Lakewood NJ)LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6WellIWAKI, Japan4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24WellIWAKI, Japan4820-040
fluorescein stereomicroscopeBX8000, Keyence, Osaka JapanBZ-X710
Whole view cell observation systemNikon, Kanagawa, JapanBioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell lineRiken, Tukuba JapanN/A
NUGC-4 human gastric cancer cell lineRiken, Tukuba JapanN/A
OCUM-1 human gastric cancer cell lineOsaka City University, JapanN/AGift from Dr. M.Yashiro

Ссылки

  1. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  2. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  3. Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
  4. Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
  5. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
  6. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
  7. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  8. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  9. Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
  10. Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
  11. Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
  12. Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
  13. Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
  14. Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  15. Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
  16. Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
  17. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

138LDNDNase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены