JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Для улучшения серологических диагностических тестов на антигены Mycobacterium tuberculosis, мы разработали суперпарамагнитные нанозонды оксида железа для выявления внелегочного туберкулеза.

Аннотация

Молекулярный зонд визуализации, состоящий из наночастиц суперпарамагнитного оксида железа (SPIO) и поверхностных антител Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb), был синтезирован для повышения чувствительности к визуализации для внелегочного туберкулеза (ETB). Нанозонд SPIO был синтезирован и спрячен с MtbsAb. Очищенный нанозонд SPIO-MtbsAb был охарактеризован с использованием TEM и NMR. Для определения способности к ориентации зонда, нанозонды SPIO-MtbsAb были инкубированы Mtb для анализа в пробирке изображений и введены в Mtb-inoculated мышей для исследования in vivo с магнитным резонансом (MR). Снижение контрастности на магнитно-резонансной томографии (МРТ) клеток Mtb и THP1 показало пропорционально концентрации нанозондов SPIO-MtbsAb. После 30 минут внутривенного инъекционного нанозонда SPIO-MtbsAb в зараженных МТБ мышей, интенсивность сигнала гранулематозного участка была увеличена в 14 раз в T2-взвешенных изображений MR по сравнению с теми, у мышей, получающих инъекции PBS. Нанозонды MtbsAb могут быть использованы в качестве нового метода обнаружения ETB.

Введение

Во всем мире внелегочная туберкулезная (ВТБ) представляет собой значительную долю случаев заболевания туберкулезом (ТБ). Тем не менее, диагностика ETB часто пропущена или отложена из-за его коварного клинического представления и плохой производительности диагностических тестов; ложные результаты включают мазки косы отрицательные для кислотно-быстрых бацилл, отсутствие гранулематозной ткани на гистопатологии, или неспособность к культуре Mycobacterium туберкулеза (Mtb). По сравнению с типичными случаями, ETB встречается реже и включает в себя небольшое освобождение бацилл Mtb. Кроме того, он обычно локализован в труднодоступных местах, таких как лимфатические узлы, плевры и остеоартикулярные области1. Таким образом, инвазивные процедуры для получения адекватных клинических образцов, что делает бактериологическое подтверждение рискованным и трудным, необходимы2,3,4.

Коммерчески доступные тесты на обнаружение антител для ETB ненадежны для клинического обнаружения из-за их широкого диапазона чувствительности (0.00-1.00) и специфичности (0.59-1.00) для всех внелегочных участков в сочетании5. Фермент-связанные иммунопоза (ELISPOT) анализы интерферона-Я, культуры фильтровного белка (CFP), и раннего секреторного антигенного целевого (ESAT) были использованы для диагностики скрытого и активного туберкулеза. Тем не менее, результаты варьируются между различными местами заболевания для диагностики ETB6,7,8. Кроме того, PPD кожи (очищенный производный белок) и Квантиферон-ТБ часто давали ложные отрицательные результаты9. Квантиферон-ТБ-2G является анализ иммунной реакции всей крови, которая не требует образца из пораженного органа, и это может быть альтернативный диагностический инструмент6,10,11. Другие диагностические методы, обычно используемые при туберкулезном менингите, такие как полимераза цепной реакции, все еще слишком нечувствительны, чтобы уверенно исключить клинический диагноз12,13. Эти обычные тесты демонстрируют недостаточную диагностическую информацию для обнаружения места экстралегочной инфекции. Таким образом, клинически необходимы новые диагностические условия.

Молекулярная визуализация направлена на разработку новых инструментов, которые могут непосредственно экран конкретных молекулярных целей болезни процессов in vivo14,15. Суперпарамагнитный оксид железа (SPIO), T2-взвешенный контрастный агент NMR, может значительно повысить специфичность и чувствительность магнитно-резонансной (МР) визуализации (МРТ)16,17. Эта новая функциональная модальность визуализации может точно эскиз тканей изменения на молекулярном уровне через лиганд-рецепторов взаимодействий. В этом исследовании, новый молекулярный зонд изображения, включающий наночастицы SPIO, был синтезирован для сопряжения с антителами поверхности Mtb (MtbsAb) для диагностики ETB. НАнозонды SPIO минимально инвазивны в тканях и телах, намизиваемых18,19. Кроме того, эти нанозонды могут демонстрировать точные изображения MR при низких концентрациях из-за их парамагнитных свойств. Кроме того, нанозонды SPIO вызывают наименьшие аллергические реакции, потому что наличие ионов железа является частью нормальной физиологии. Здесь чувствительность и специфичность нанозондов SPIO-MtbsAb, нацеленных на ETB, оценивалась как в моделях клеток, так и в животных моделях. Результаты показали, что нанозонды применимы в качестве ультрачувствительных средств визуализации для диагностики Эбб.

протокол

Весь протокол, касающийся эксперимента на животных, соответствует стандартным эксплуатационным процедурам для лабораторного животноводства в соответствии с Национальными институтами медицинских руководящих принципов по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание, 2011) и одобрен институционального комитета по уходу за животными и использованию.

1. Синтез наночастиц SPIO

  1. Приготовьте dextran-покрытием магнитных наночастиц оксида железа, энергично перемешивая смесь декеспна Т-40 (5 мл; 50% ж/ч) и ваковая решения FeCl3No6H2O (0,45 г; 2,77 ммоль) и FeCl2No4H2O (0,32 г; 2,52 ммоль) решения при комнатной температуре.
  2. Добавить NH4OH (10 мл; 7,5% v/v) быстро.
  3. Далее перемешать черную подвеску на 1 ч; впоследствии, центрифуга на 17300 х г в течение 10 мин, а затем удалить агрегаты.
  4. Отделить окончательные продукты SPIO от несвязанного dextran Т-40 по гель фильтрации хроматографии20.
  5. Загрузите реакционную смесь (общий объем 5 мл) в столбец 2,5 см и 33 см и утяните буферным раствором, содержащим 0,1 М На ацетат и 0,15 М NaCl при рН 7,0.
  6. Соберите очищенный dextran-покрытием оксида железа магнитных наночастиц в объеме пустоты и просеете колонки eluates для железа и dextran на 330 и 490 nm с помощью соляной кислоты и фенол / серная кислота методы20, соответственно.

2. Синтез SPIO-MtbsAb

  1. Синтезировать SPIO-конъюгированный EDBE с использованием ранее сообщалось методы21,22.
  2. Синтезировать СПИО-EDBE-succinic ангидрид (SA).
    1. Перемешать щелочный раствор (5 МН НаО; 10 мл)) SPIO-EDBE и SA (1 г; 10 моль) при комнатной температуре 24 ч.
    2. Диализ раствор с 20 изменениями 2 л дистиллированной воды с помощью молекулярных пористых мембранных труб (12000-14000 МВт отсечения). 6 ч для каждого изменения.
  3. Наконец, добавьте 100 л SPIO-EDBE-SA (4 мг/мл Fe) до 400 л 4,5 мг/мл MtbsAb для синтеза SPIO-MtbsAb с помощью 1-гидроксибензотриазол и (бензотриазол-1-yloxy) трипирролидинофосфоний гексафторфат в качестве катализаторов и перемешать раствор при комнатной температуре в течение 24 ч.
  4. Наконец, отделить растворы от несвязанных антител через гель фильтрации хроматографии.
  5. Загрузите реакционную смесь (5 мл) на 2,5 см и 33 см колонки и выщелажните с помощью буфера PBS. Подтвердите Ab-nanoparticle комплекс (т.е., нанозонд) с помощью бисинхониновой кислоты белка анализ комплект23.

3. Наблюдение морфологии частиц и измерение уровня релаксации

  1. Изучите средний размер частиц, морфологию и распределение размеров с помощью электронного микроскопа передачи при напряжении 100 кВ.
    1. Drop-cast композитной дисперсии на 200-сетки медной сетки и сухой воздух при комнатной температуре перед загрузкой его на микроскоп.
  2. Измерьте значения времени релаксации(T1 и T2) нанозондов с помощью релаксометра ЯМР при 20 МГц и 37,0 градуса по Цельсию и 0,1 градуса по Цельсию.
    1. Калибровать релаксометром перед каждым измерением.
    2. Запишите значения r1 и r2 из восьми точек данных, генерируемых путем инверсии-восстановления, и последовательность импульса Carr-Purcell-Meiboom-Gill, соответственно, чтобы определить r1 и r2 relaxivities20.

4. Клеточная визуализация

  1. Культивировать человеческие моноциты THP-1 в RPMI 1640 с 10% плода бычьей сыворотки, 50 мкг/мл гентамицин сульфат, 100 единиц / мЛ пенициллин G натрия, 100 мкг сульфата стрептомицина, и 0,25 мкг /мЛ грибизон в 5% CO2 intor.
  2. Инкубировать нанозонды SPIO-MtbsAb (2 мм) с 106 колониями, образующими единицы (CFU) Mycobacterium bovis BCG, предварительно инкубационные с 1 и10 активированными моноцитами в микроцентрифуговых трубках (1 мл) в 5% CO2 инкубаторе при 37-C на 1 ч.
  3. Центрифуговых трубок на 200 х г и отбросить супернатант. Рерастворите гранулы в среде (200 л).
  4. Сканирование образцов с помощью быстрой градиентной последовательности импульса эхо (время повторения (TR) 500; Эхо-время (TE) - 20; Угол флитора - 10 евро) через 3,0-T МРТ, чтобы определить специфичность и чувствительность нанозонда21,22.

5. БКГ (Бацилла Кальметт-Герин) прививка

  1. Восстановите лиофилизированную вакцину или бактериальный запас в среде Sauton, а затем разбавить запас сольным раствором до тех пор, пока должным образом не рассеется, как ранее описано24.
  2. Прививать живой ослабленный штамм M. bovis BCG, полученный из ADIMMUNE (Тайбэй, Тайвань) (Коннот штамм; ImmuCyst Aventis, Пастер Мерье) на объеме 0,1 мл / мышь (т.е., 107 CFU) intradermally в левую или правую царскую лопатку scapular кожи мышей, как описано ранее23. Вводят солин в мышей в качестве отрицательного контроля. Мониторинг животных ежедневно после прививки BCG.
  3. Пожертвование животных через месяц после прививки бактерий с использованием эвтаназии углекислого газа. Урожай ткани из интрейдермальной прививки сайта. Исправить ткани в 10% формалин и вставлять в парафин для серийных разделов на 5-10 мкм. Пятно ткани разделов с гематоксилин / эозин и Зиэль-Нилсен пятна для кислотно-быстрых бактерий24 и с Берлин синий для железа25.

6. In vivo МРТ

  1. Вводят кетамин (80 мг/кг массы тела) и ксилазин (12 мг/кг массы тела) подкожно в мышей для анестезии животных.
  2. Впрыскивать зонды SPIO-TbsAb (2 нмоль/200 л) в хвостовые вены мышей. MR изображения мышей до и сразу после инъекции зонда, а затем каждые 5 минут в течение 30 минут, чтобы приобрести T2-взвешенных быстрых спи-эхо изображений (TR 3000; ТЕ No 90; поле зрения No 8).
  3. Количественно анализировать все Изображения Mr с помощью интенсивности сигнала (SI), измерения определенных регионов, представляющих интерес в сопоставимых местах центра Грануломы Mtb и мышцы спины, прилегающей к гранулематозной области.
  4. Рассчитайте относительные улучшения сигнала с помощью измерения SI до (SIpre; контроль) и 0-3 ч после (SIpost) инъекции контрастных агентов с использованием формулы

    (SIpost - SIpre)/SIpre

    где SIpre является SI поражения на предварительно расширенном сканировании и SIpost является SI поражения на пост-улучшенной сканирования21,22.

Результаты

Синтез и характеристика нанозонда SPIO-MtbsAb
Наночастицы SPIO были разработаны для сопряжения с MtbsAb. Декстран стабилизировался на поверхности наночастиц SPIO, был перекрестным эпиглухохидрином. Наночастицы SPIO были впоследствии включены в EDBE для активации первичных функциональных...

Обсуждение

Как и в соответствующих исследованиях, наши выводы относительно нанозондов SPIO-MtbsAb продемонстрировали значительную специфичность для Mtb27,28. Подкожная гранулема Mtb была обнаружена через месяц после инъекции туберкулеза в моделях мыши. Типичные результат?...

Раскрытие информации

Ни один из авторов не имеет никакого проприетарного интереса к материалам, рассмотренным в данном исследовании.

Благодарности

Авторы благодарны за финансовую поддержку со стороны Министерства экономики Тайваня (гранты НСК-101-2120-М-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) для выполнения этой исследовательской работы. Эта рукопись была отредактирована Уоллес академическим редактированием.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphateSigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazoleSigma-Aldrich
dextran(T-40)GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine)Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrateFluka
ferrous chloride tetrahydrateFluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCGPasteur MérieuxConnaught strain; ImmuCyst Aventis
MRIGE medical Systems3.0-T, Signa
NH4OHFluka
NMR relaxometerBrukerNMS-120 Minispec
Sephacryl S-300GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut offSpectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to MtbAcris Antibodies GmbHBP2027
transmission electron microscopeJEOLJEM-2000 EX II

Ссылки

  1. Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
  2. Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, 25-55 (1984).
  3. Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
  4. Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
  5. Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
  6. Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
  7. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
  8. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
  9. Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
  10. Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
  11. Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
  12. Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
  13. Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
  14. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. , 1-7 (2003).
  15. Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219, 316-333 (2001).
  16. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
  17. Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
  18. Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).
  19. Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
  20. Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
  21. Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
  22. Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
  23. Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
  24. Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
  25. Woods, A. E., Ellis, R. . Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , 6-11 (1994).
  26. Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
  27. Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
  28. Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
  29. Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
  30. von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены