Упругое окрашивание на параффиновые слайды ткани рака желудка pT3N0M0

Резюме

Здесь мы представляем протокол эластичного окрашивания для выявления эластичных волокон в тканях рака желудка pT3N0M0 на формалино-фиксированных, парафин-встроенных разделах. Впоследствии мы описываем метод, чтобы определить, являются ли опухолевые клетки вторгаются за эластичный ламина.

Аннотация

Упругая ламина, которая обычно находится в субмезотелиальном слое, примыкающем к мезотелиальным клеткам, является амфифилическим на гематоксилине и эозине (Н и Е) окрашиванием, но может быть визуализирована через эластичное окрашивание. Одним из важных преимуществ эластичного окрашивания является то, что это позволяет легко определить, являются ли опухолевые клетки вторглись за эластичный ламина. Это помогает в изучении степени вторжения брюнейшей поверхности, тем самым различая pT3 и pT4 этапов рака желудочно-кишечного тракта. В этом исследовании мы представляем протокол для выявления эластичных волокон в формино-фиксированных, парафин-встроенных pT3N0M0 рака желудка разделов ткани. Мы готовим 5-мм парафинов разделы фиксированной на слайдах, а затем все слайды deparaffinated и регидратированных во время процедуры окрашивания. Впоследствии все секции окисляются перманганата калия, отбеливаются щавелевой кислотой, окрашиваются эластичным окрашиванием и counterstained Van Gieson's. Наконец, мы исследуем эффект окрашивания; эластичный ламина окрашенные сине-черные и коллагеновые волокна окрашены красным цветом, в то время как раковые клетки окрашены в различных оттенках желтого. Мы также подробно описываем методы, используемые для определения позиционной связи между раковыми клетками и эластичной ламиной. Этот метод прост, недорогой, и широко применяется в выявлении вторжения брюшной поверхности в желудочно-кишечного тракта рака из-за его выдающейся избирательности для эластичных волокон и подлинные результаты.

Введение

В рамках опухолевой, узловой и метастазной (TNM) системы постановки рака, прогноз рака желудка на патологической стадии pT4 значительно хуже, чем у pT3 (8-й UICC / AJCC)¹. При раке желудка классификация первичной опухоли (ПТ) обычно зависит от глубины опухоли вторжения². Патологическая стадия pT3 рака желудка определяется как рак вторжения через muscularis propria в подсерозальные ткани, в то время как pT4 рака желудка определяется как рак проникает на поверхность висцеральной перитонеум. Наличие инвазивности перитонеальной поверхности являетсяключом к различению двух стадий 2. Однако, поскольку перитонеальный мезотелиальный слой клетки очень тонкий, он может быть поврежден во время операции, послеоперационного лечения и фиксации³. Кроме того, связанные с опухолью воспалительные изменения и фиброз может повредить нормальную анатомию перитонеума, что делает его очень трудно точно судить о вторжением перитонеальной поверхности, используя только Н И E окрашивания⁴. Современные вспомогательные методы диагностики, такие как цитологияи иммуногистохимия, имеют ограниченное диагностическое значение 5,^6, поскольку они являются ложноположительными или имеют низкую рентабельность.

Серозная мембрана включает в себя перитонеум, плевру и перикард, и состоит из мезотелия, мембраны подвала, и суб-мезотелиального слоя⁷. Одной из распространенных гистологических особенностей серосальной мембраны является наличие эластичного ламина в субмезотелиальном слое, примыкающем к мезотелиальным клеткам^8,9. Упругая ламина имеет сильную анти-повреждение способности и может служить в качестве альтернативного прогностирика, если мезотелиальные клетки разрушаются тяжелым воспалением опухоли или фиброз³. Упругая ламина в основном состоит из эластина и микрофибрила^10,который может быть визуализирован эластичным окрашиванием. Основной причиной использования эластичного окрашивания является то, что эластин образует водородную связь с феноличной группой резоринола в растворе эластина, в результате чего эластичные волокна окрашены в сине-черный цвет. После Ван Гисон (VG) контрастные окрашивания, коллагеновые волокна могут быть окрашены в красный цвет и мышечные волокна и красные кровяные тельца могут быть окрашены желтый^8,11,12,13.

Восьмое издание TNM постановка рака легких определяет висцерального плеврального вторжения (T2) как вторжение опухоли за упругой ламиной или вторжения на поверхности висцеральной плевры². Исследования колоректального рака показали, что упругий ламина вторжения в pT3 колоректального рака может быть причиной плохих прогнозов. 5-летний без болезней и общая выживаемость колоректального рака также было доказано, как pT4a^13,14,15. На основе наших предыдущих исследований по эластичной окрашивания, эластичная ламина вторжения было установлено, что значительное негативное влияние на прогноз рака желудка pT3 и должны рассматриваться так же, как pT4a рака желудка¹². Таким образом, этот простой и экономически эффективный метод может помочь устранить неопределенность в результатах, полученных с помощью н и e окрашивания, и другие общие ограничения, связанные с другими вспомогательными методами диагностики, в том числе цитологии и иммуногистохимии, среди Другие. Этот метод может быть эффективно использован для диагностики перитонеальной поверхности вторжений рака желудочно-кишечного тракта, особенно в некоторых неоднозначных случаях. Это удобно, так как н и E пятна и другие пятна, как правило, затрудняет выявление таких вторжений. Этот метод также обеспечивает надежность результатов, так как он очень избирательный, особенно для эластичных волокон. Здесь мы проводим эластичное окрашивание, чтобы определить, вторглись ли опухолевые клетки в упругую ламину в рак желудка pT3N0M0¹².

Этот метод используется для выявления эластичных волокон в тканях на формалино-фиксированных, парафин-встроенных разделов, а также может быть использован для замороженных разделов, а также. Здесь мы выбираем парафин-встроенные разделы для лучшего обслуживания клеточной и тканевой морфологии. Все этапы в этом протоколе происходят при комнатной температуре. В представленном исследовании используется коммерческий комплект для окрашивания, включающий в себя раствор перманганата калия, раствор щавелевой кислоты, раствор эластина и раствор Ван Гисона.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Между 1994 и 2005, образцы пациента были отобраны двумя опытными желудочно-кишечных патологоанатомов в аффилированной онкологической больнице Xiangya школы медицины, Центральный южный университет, от пациентов, которые перенесли гастроэктомии желудка неоплазмы, с послеоперационная патологическая диагностика рака желудка на этапе pT3N0M0 (согласно седьмой постановке TNM). Это исследование было одобрено комитетом по обзору этики.

1. Секция

1. Поместите парафин блок в фиксированный держатель саней микротом, который может двигаться вперед и назад через лезвие. Отрегулируйте оптимальный угол между блоком и ножом для микротомов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный угол зависит не только от геометрии лезвия, но и от скорости резки и техники.
2. Обрезать парафин блок по мере необходимости и разрезать его на 5 мкм толщиной сечения.
3. Поместите парафин 5-мм разделов в водяной бане около 40 - 45 градусов по Цельсию и смонтировать его, впоследствии, из воды на стеклянную горку, один раздел на слайд.
4. Прижмите установленный раздел тщательно против бумажного полотенца, чтобы удалить любые остаточные воды и потенциальные пузырьки воздуха.
5. Разрешить разделы воздуха сухой в течение 30 мин, а затем выпекать их в духовке при температуре 45 - 50 градусов по Цельсию в течение 2 ч.

2. Депараффинизация и регидратация всех слайдов

1. Погрузите горки в ксилен в банку Коплина в течение 10 минут.
2. Возьмите слайды из первой банки ксилена и погрузите их в ксилен в другую банку в течение 10 минут.
3. Теперь погрузите горки в 100% этанол в банку Коплина в течение 5 минут.
4. Погрузите слайды в 100% этанол в другой банку Коплин, а также в течение 5 минут.
5. Погрузите горки в 95% этанола в банку Коплин в течение 2 минут.
6. Погрузите горки в 70% этанола в банку Коплин в течение 2 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что слайды полностью погружены в решения при выполнении вышеуказанных шагов.
7. Промыть слайды кратко дистиллированной водой в новой банке.

3. Окрашивание

1. Прежде чем приступить к окрашиванию, стереть лишние растворы вокруг ткани на слайде с помощью бумаги.
2. Поместите горки в комнате температуры и влажности комнате условиях, чтобы избежать сушки ткани на слайде на протяжении всего процесса окрашивания.
3. Окислить слайды с несколькими каплями перманганата калия в течение 5 мин. Убедитесь, что объем перманганата калия достаточно, чтобы покрыть раздел ткани на каждом слайде.
4. Промыть окисленные горки дистиллированной водой в банке Коплин с 2 - 3 изменениями. Наблюдайте за синим цветом ткани.
5. Теперь, отбелить эти слайды, добавив несколько капель щавелевой кислоты в течение 5 мин. Убедитесь, что объем щавелевой кислоты достаточно, чтобы полностью покрыть ткани разделе на каждом слайде.
6. Промыть горки, погрузив их в банку Коплин заполнены дистиллированной водой. Выполните промыть 2x - 3x.
7. Теперь вымойте эти горки кратко в 95% алкоголя, а затем погрузить слайды в раствор эластина (5 г/л) для 8 - 24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор эластина волатилен, и его время окрашивания относительно длинное, поэтому лучше всего погрузить горки с эластичным окрашиванием в герметичную емкость, например, прозрачную стеклянную бутылку с герметичной крышкой. Емкость контейнера и объем раствора эластина зависят от количества погруженных горок, если он обеспечивает полное погружение всех слайдов.
8. Погрузите эти слайды непосредственно в 95% этанола в течение 1 - 2 мин, чтобы дифференцировать каждый раздел ткани хорошо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференциация относится к изменению заряда ткани раздела, который удаляет избыток окрашивания поглощается ткани и делает цвета яснее. После эластина раствора окрашивания, образцы не следует мыть дистиллированной водой, чтобы избежать каких-либо трудностей в дифференциации. Проверьте микроскопически, по мере необходимости, для сине-черных эластичных волокон окрашивания и серого фона. Лучше слегка недодифференцировать ткани, так как последующие контрпятно Ван Гисон может также несколько извлечь упругое пятно.
9. Полностью промыть эти горки дистиллированной водой после дифференциации.
10. Противопоставить слайды в растворе Ван Гисона в течение 1 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем решения Van Gieson должен быть достаточно, чтобы иметь возможность погрузить ткани разделе на каждом слайде полностью.
11. Быстро падение 95% этанола на эти ломтики в течение нескольких секунд, чтобы дифференцировать каждый раздел ткани хорошо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не промыть горки с любой водой после противопоставления Ван Гисон, так как это может ослабить или даже украсить цвет противопоступления Ван Гисон.

4. Обезвоживание и монтаж

1. Погрузите слайды в 95% алкоголя в течение 5 минут, чтобы позволить им обезвоживать быстро.
2. Продолжайте обезвоживать эти ломтики на 2 изменения 100% алкоголя, каждый раз погружая горки в течение 5 минут.
3. Погрузите слайды в 2 изменения ксилена, каждый раз в течение 3 мин.
4. Добавьте одну каплю сыси монтажа среды к слайду и поместите крышку сверху.

5. Микроскопическое наблюдение за горками

1. Найдите серозальное направление и наблюдайте за результатами эластичного окрашивания: эластичные волокна (ламина) окрашены в сине-черный цвет, коллагеновые волокна окрашены в красный цвет, а мышечные волокна окрашены в желтый цвет.
2. Ищите раковые клетки в целом слайд: раковые клетки окрашенных желтый¹².
3. Определите позиционную связь между раковыми клетками и эластичной ламиной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Там будет две ситуации здесь. До тех пор, пока есть одна опухолевая клетка, которая вторглась за эластичный ламина во всем слайде, то этот случай можно рассматривать как эластичную ламину вторжения. С другой стороны, только тогда, когда нет опухолевых клеток, которые вторглись за эластичный ламина в целом слайд, этот случай может рассматриваться как упругий ламина не-вторжения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Успешное эластичное окрашивание ясно показывает эластичную ламину и раковые клетки при раке желудка pT3. Рисунок 1 - маломощный поле, микроскопически проверенное после окрашивания раствора эластина, до контрпятна Ван Гисона в соответствии с упомянутым ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот предложенный здесь метод обеспечивает точный подход для определения субсерозаля эластичной ламина. Метод может быть использован для оценки ли опухолевые клетки вторглись упругой ламина в pT3N0M0 рака желудка¹². Упругая ламина является красноватой в H и E-окрашенных разде...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elastin-Van Gieson staining kit	Baso	BA4083B	Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers
Permount TM Mounting Medium	MXB Biotechnologies	DAB-0033	Used for mounting
Ethanol	LMAI Bio	LM64-17-5	100%
Xylene	LMAI Bio	LX820585