JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы приводим иммунофлюоресценции локализации Динамин для иллюстрации протоколы для обнаружения белков в парафин врезанных мыши эпидидимальных секций и тех, кто увековечен эпидидимальных клеточной линии (mECap18). Мы также описывают протоколы для изоляции секреторной белков от эпидидимальных жидкости и кондиционером ячейки СМИ.

Аннотация

Млекопитающих придатка генерирует один из самых сложных жидкостей внутрипросветная любой эндокринной железы с целью поддержки после яичка созревания и хранения сперматозоидов. Такая сложность возникает из-за совместная деятельность секреторных и освоения накладки эпителиальных клеток. Здесь мы описываем методы для анализа эпидидимальных белкового синтеза и секреции, сосредоточив внимание на модели белков семейства Динамин (ДНМ) mechanoenzymes; большие GTPases, которые имеют потенциал, чтобы регулировать двунаправленным мембраны оборота событий. Для изучения экспрессии белков в эпидидимальных ткани мы описываем надежной методологии Этикетировочный иммунофлуоресценции белков-мишеней в парафин врезанных секций и последующего обнаружения пространственного распределения этих белков через иммунофлуоресценции. Мы также обсудим оптимизированный методологии для изоляции и характеристика exosome как пузырьки, известный как epididymosomes, который выделяется в эпидидимальных люмен участвовать в межклеточные связи с созревания сперматозоидов. Как дополнительный подход мы также описывают иммунофлюоресценции обнаружение целевых белков в увековечен SV40 мыши caput эпидидимальных эпителия (mECap18) клеток линии. Кроме того мы обсуждаем утилита mECap18 клеточной линии как модель подходит в пробирке с для изучения регулирование эпидидимальных секреторную активность. Для этой цели мы описываем культивирования требования для поддержания линии клеток mECap18 и использование селективного фармакологических ингибирование схем, которые способны влиять на их профиль белка секреторных. Они легко оценить через уборки кондиционером питательной среды, концентрация секретируемые белки через трихлоруксусной кислоты/ацетон осадков и их последующего анализа через SDS-PAGE и immunoblotting. Мы утверждаем, что эти комбинированные методы подходят для анализа альтернативных эпидидимальных белковых мишеней в качестве прелюдии к определению их функциональной роли в созревания сперматозоидов и/или хранения.

Введение

Сперматозоиды всех видов млекопитающих приобретать потенциал для отображения вперед прямолинейное и оплодотворить яйцеклетку во время их продолжительного спуска через придатка, узкоспециализированные региона мужской экстра яичка канальные системы, которая может 7-14 дней для навигации (в зависимости от вида)1. Из-за экстремальных конденсации отцовской хроматина и пролития часть цитоплазмы, которая сопровождает чувствующего сперматозоидов в яичках их последующее функционального созревания управляется исключительно их взаимодействия с эпидидимальных микроокружения. Это окружение в свою очередь, создается секреторную и освоения активность Сома эпидидимальных накладки и отображает исключительный уровень сегмента сегмент вариант1. Таким образом наиболее активных сегментов с точки зрения белкового синтеза и секреции являются те, которые расположены в проксимальной части придатка (а именно, caput и корпус)2. Эта деятельность отражает профиль функциональной сперматозоидов, с началом первой ячейки для отображения клейма функциональной компетенции (т.е., прямолинейное и возможность привязки к солюбилизирован кислоты zona гликопротеинов) следующие их проход через caput придатка3. Эти функциональные атрибуты продолжают развивать до достижения оптимального уровня как сперме достигнуть дистальной эпидидимальных сегмента (конского), где они хранятся в состоянии покоя в готовности для эякуляции. Формирование и поддержание этого водохранилища хранения спермы также тесно связаны с подкладкой эпителия, что в конского доминирует сильный освоения деятельности4,5. Хотя анатомические различия были сообщил6,7,8, такие регионализованное разделение труда, как представляется, характеристика придатка, которая является общей среди большинства млекопитающих учился на сегодняшний день, включая наш собственный9,10. Действительно с точки зрения клинической, известно, что эпидидимальных дисфункция делает важный вклад этиологии мужского фактора бесплодия11, таким образом подчеркнув важность понимания регулирования этой специализированной ткани.

Поэтому весьма прискорбно, что наше понимание эпидидимальных физиологии и механизмов, которые регулируют последовательных этапов созревания сперматозоидов и хранение в пределах этой ткани, по-прежнему быть полностью урегулирован. Среди факторов ограничивающих прогресс в исследованиях эпидидимальных являются общей сложности этой ткани и знаний о механизмах, которые оказывают регулирующего контроля над его Люминал микроокружения. Анатомически мы знаем, что помимо различия caput, корпус и конского сегментов, придатка могут подразделяться на несколько зон (Рисунок 1A), каждый разделены перегородками12 и характеризуется дискретных профили гена/белка выражение13,14,,1516,17,18. Действительно на основе подробного транскрипционный анализ профиля экспрессии генов сегментарный в придатка, как 6 и 9 различных эпидидимальных зон были зарегистрированы в моделях мыши и крысы, соответственно19,20. Такие сложности предположительно отражает состав эпидидимальных сома, псевдомногослойный эпителия, состоящий из многочисленных различных типов клеток; Каждый различные их изобилие, распределения и секреторную/освоения деятельности вдоль тракта. Таким образом основные клетки являются, на сегодняшний день наиболее распространенным эпидидимальных ячейки типа составляют свыше 80% всех эпителиальных клеток. Соответственно основные клетки несут ответственность за основную часть эпидидимальных белка биосинтеза и секреции5. Напротив Светлоклеточная население, которое выстраивают в ряд как вторым наиболее распространенным типом ячейки в пределах эпидидимальных сома, занимаются прежде всего избирательного поглощения Люминал компонентов и подкисление этой микроокружения5. Добавляя еще один уровень сложности, андрогены и других факторов lumicrine яичек происхождения оказывают Дифференциальный контроль над каждым из этих типов эпидидимальных ячеек в зависимости от их размещения вдоль тракта.

Несмотря на ограничения, введенные на такие сложности продолжают быть существенных успехов в решении механистический основу эпидидимальных функции. Ключ для этих исследований был применение стратегий передовых масс-спектрометрии для установления широких масштабах инвентаризации эпидидимальных протеома в тандеме с детальным анализом отдельных белков, отобранных из числа этих первоначальных обследований. Примером такого подхода является нашей недавней характеристика DNM семьи mechanoenzymes в мыши модель21. Наш первоначальный интерес в ДНМ был вызван его двойного действия в муфте экзо - и endocytotic процессов. Опираясь на эти замечания, мы смогли продемонстрировать, что три канонические изоформ DNM (DNM1 - DNM3) сильно выражена в мыши придатка и надлежащим образом позиционируется для выполнения нормативных функций секрецию белка и поглощения21 . Кроме того мы смогли четко дифференцировать каждый DNM изоформы на основе их клеточном и субклеточном локализации, таким образом, о том, что они обладают взаимодополняющими, в отличие от избыточной, деятельность в рамках эпидидимальных эпителия21.

Здесь мы описываем экспериментальной методологии для изучения DNM выражения в мыши придатка с надеждой на то, что эта информация будет найти более широкое применение в характеристике альтернативных эпидидимальных белков и тем самым способствовать нашей понимание функции этого важного элемента мужского репродуктивного тракта. В частности мы описывают развитие надежной методологии иммунофлюоресценции маркировки белков-мишеней в парафин врезанных эпидидимальных секций и последующего обнаружения пространственного распределения этих белков через иммунофлуоресценции микроскопия. Мы далее документ нашего недавно оптимизированный протоколы22 для изоляции и характеристика epididymosomes; малые exosome как пузырьки, которые представляют собой ключевые элементы эпидидимальных секреторной профиля и появляются провести важную роль в продвижении сперматозоидов созревания23. Как дополнительный подход мы также описывают иммунофлюоресценции обнаружение целевых белков в увековечен мыши caput эпидидимальных эпителия (mECap18) клеток линии и использования этого ресурса в качестве модели с для изучения регуляции эпидидимальных секреторную активность в пробирке.

протокол

Все экспериментальные процедуры, связанные с коллекцией тканей животных были утверждены университета Ньюкасла животных уход и Комитета по этике.

1. иммунофлюоресценции окрашивания от парафин врезанных эпидидимальных секций (рисунки 1 и 2)

  1. Сразу же после эвтаназии взрослых мышей через CO2 ингаляции (швейцарский мышей, более 8 недель), тщательно анализировать придатка (используя хирургические ножницы и щипчики) бесплатно вышележащих соединительной ткани и жира и погрузиться в Bouin с фиксатором решение (> 10 раз объем/ткани вес) для фиксации на ночь.
  2. Стирать ткани с 70% этанол с 2 × изменения ежедневно в течение 2 дней и затем обезвоживает через градуированные этанола (70%, 95% и 100%), в рамках подготовки к инфильтрации и встраивания в парафин блок.
  3. Раздел парафиновых блоков толщиной 4-6 мкм и горе на слайды в рамках подготовки к пятнать иммунофлюоресценции.
  4. В Зонта dewax эпидидимальных парафиновых срезах, добавив достаточное количество ксилол слайд банку, чтобы полностью погрузиться в разделе ткани (3 × 5 мин каждый раз).
  5. Увлажняет разделов ткани путем погружения в градуированных этанола решения разводят в очищенной H2O (100% этанола 5 мин, 100% этанола 5 мин, 90% этанола 1 мин, 80% этанола 1 мин., 70% этанол 1 мин и 50% этиловом спирте 1 мин).
  6. Мыть разделы в банку слайд один раз за 5 мин с достаточной фосфатный буфер (PBS) полностью погрузить весь ткани секции (следуйте этим инструкциям для всех последующих моек).
  7. Декант соответствующие антигена поиска решения (т.е., 10 цитрат натрия ммоль/Л, 50 ммоль/Л трис рН 10.5 или альтернативных антигена извлечения дополняя, в зависимости от антигена для обнаружения) в стойку слайд и микроволновая печь до кипения. Погружать слайды в это решение и подлежит разделов ткани условий извлечения тепла индуцированной антигена оптимизирован для отдельных антител (см. таблицу 1).
    Предупреждение: Убедитесь, что слайды полностью погружены в антиген поиска решения во время процесса извлечения антигена.
  8. Удалите контейнер слайд из микроволновой печи и остыть до комнатной температуры.
  9. Промойте слайды с PBS и использовать жидкость репеллент слайд маркер для отслеживания вокруг секции ткани.
  10. Слайды в увлажненные контейнер (созданные смоченной ткани на базе контейнера) и применить блокировки раствор (3% BSA/PBS, ранее фильтруется через фильтр 0,45 мкм) за 1 ч при 37 ° C.
  11. Промойте слайды с PBS.
  12. Проинкубируйте разделы с соответствующим основное антитело, разбавляют до экспериментально оптимизированной концентрации в отфильтрованных 1% BSA/PBS на 4 ° C на ночь (1: 60 для анти DNM1, DNM2 и DNM3 антител; 1: 100 для антитела анти ATP6V1B1, см таблица материалов подробности антитела).
    Примечание: Различать конкретные от неспецифических антитела binding, надо включать строгие отрицательной (т.е., вторичное антитело только, первичные антитела preabsorbed против вакцинации пептида) и позитивные элементы24.
  13. Согревать слайды, поместив при комнатной температуре за 30 мин.
  14. Вымойте слайды 3 × с PBS на тряску платформе (60 об/мин) за 10 мин.
  15. Проинкубируйте разделы с соответствующие вторичные антитела, разводят в 1% BSA/PBS (фильтруется через фильтр 0,45 мкм) при 37 ° C в течение 1 ч (разбавления 1: 400 для всех вторичных антител, смотрите Таблицу материалы антитела).
    ВНИМАНИЕ: Держите контейнер слайд в темноте от этот шаг далее. Для двойной маркировки, выбрать совместимый комбинацию вторичных антител (т.е., вторичные антитела должны были подняты в разных видов).
  16. Вымойте слайды 3 × с PBS на тряску платформе (60 об/мин) за 10 мин.
  17. Counterstain разделы с пропидий йодидом (PI, 7.48 мкмоль/Л) или 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 мкмоль/Л) для 2 мин при комнатной температуре на этикетке клеточного ядра.
  18. Вымойте слайды дважды с PBS на тряску платформе (60 об/мин) 5 мин.
  19. Смонтировать разделы с 10% в растворе глицерина 30% в 0,2 моль/Л трис (рН 8,5) подготовлен Mowiol 4-88 и 2,5% 1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-октановое число.
  20. Печать coverslip лаком для ногтей и хранить слайды на 4 ° C для будущего наблюдения.
    ВНИМАНИЕ: Рекомендуется выполнять изображений слайдов как можно только после подготовки во избежание чрезмерной потери флуоресценции.

2 изоляция Epididymosomes из придатка яичка Caput мыши (рис. 3)

  1. Сразу же после эвтаназии взрослых мышей через CO2 ингаляции (швейцарский мышей более 8 недель) perfuse их сосудистую с PBS (предварительно разогретую до 37 ° C) для сведения к минимуму загрязнение крови эпидидимальных ткани.
    Предупреждение: плазмы крови содержит разнообразные популяции exosomes, которые являются аналогичного размера epididymosomes25. Эффективность очистки крови от эпидидимальных ткани могут быть доступны через инспекции первоначального этапа, высоко васкуляризированной эпидидимальных сегмент расположен проксимальный сегмент caput (т.е., зона 1 на рисунке 1A)
  2. Тщательно анализировать придатка свободной от вышележащих жира и соединительной ткани и полоскания с модифицированных Biggers, Уиттен и Уиттингем среднего (BWW; рН 7,4, осмоляльность 300 ммоль/кг воды26,27) уменьшить любые возможности для поверхности заражение крови.
  3. Блот эпидидимальных ткани, чтобы удалить излишки средств массовой информации, вскрыть caput придатка яичка (т.е., зон в 2-5 Рисунок 1A) и передать свежие Петри (35 × 10 мм) BWW среда. Убедитесь, что количество средних является достаточным для окончательного восстановления.
    Примечание: Для 6 caput epididymides, рекомендуется использовать 1.1 мл средства для восстановления ~ 900 мкл, который затем равномерно разделить и применяется на вершине 2 заранее подготовленных градиентов (см. шаг 2.9).
  4. Сделайте несколько небольших разрезов в caput ткани с лезвием бритвы. Не фарш ткани и таким образом избежать загрязнения образца с чрезмерным цитозольной содержимое. Инкубируйте пластину, содержащий ткань с мягким перемешиванием при 37 ° C за 30 мин до выпуска Люминал содержимое.
  5. Фильтровать результирующий подвеска через 70 мкм мембраны для удаления сотовой мусора.
  6. Сбора фильтрата и подвергать это шаги последовательных центрифугированием при 4 ° C с увеличением скорости для того, чтобы ликвидировать сотовой мусора (т.е., 500 × g, 2000 × g, 4000 × g, 8000 × g, 5 мин каждый; 17000 g × 20 мин и наконец 17000 × g дополнительные 10 минут или до тех пор, пока не гранул образуется после центрифугирования).
    Предупреждение: Важно оценить цвет гранул после первоначального шага центрифугирования g 500 × чтобы убедиться, что загрязнение минимально крови присутствует. Отменить любые образцы, в которых этот Пелле отображает розовой окраской.
  7. Подготовьте разрывными iodixanol градиентов (в составе 40%, 20%, 10%, 5% слои) путем разбавления плотность градиента среднего (в составе 60% (w/v) водный iodixanol) с раствором сахарозы 0,25 моль/Л и 10 ммоль/Л трис (рН 7,5).
  8. Подготовьте градиента в ультрацентрифуга трубки (11 × 35 мм), с каждой фракции 450 мкл (рис. 3). Осмотрите градиента после применения каждой фракции обеспечить, что интерфейсы успешно образуются между каждым слоем до загрузки образца эпидидимальных жидкости. Подготовка каждого градиента свежий день использования, однако, эпидидимальных Люминал жидкости образцы могут быть сохранены на 4 ° C для до 2 ч перед погрузкой.
  9. Тщательно 450 мкл эпидидимальных Люминал жидкости подвеска (соответствующий собранного материала от caput 3 epididymides) на вершине одного градиента.
  10. Ультрацентрифуги градиенты на 160 000 × g при 4 ° C для 18 h.
    Предупреждение: Поскольку этот центрифугирования проводится на очень высокой скорости, все ультрацентрифуга трубы должен быть паре и точно сбалансированы. Проверьте трубы для обеспечения, что они свободны от каких-либо видимых повреждений, которые могут нарушить их целостность.
  11. Аккуратно удалите 12 равных долях (состоящих из 185 мкл) начиная с верхнего слоя и прогрессирует в нижней части градиента. Бильярд эквивалентные дроби, оправился от каждого градиента, если применимо (до двух градиентов).
    Примечание: Мышь, epididymosomes наиболее сильно обогащенный в дроби 9-1122, смотрите Рисунок 4 и обсуждения.
  12. После восстановления и объединения фракций 9 – 11 развести в 2 мл PBS и ультрацентрифугирования образцы на 100 000 × g при 4 ° C 3 h (13 × 56 мм труба) гранул epididymosomes.
    Предупреждение: Поскольку Пелле epididymosome может быть трудно увидеть, убедитесь, что ориентация трубы отмечается как они помещаются в ротор и Марк трубки для указания выжидательного положения epididymosome гранул. Убедитесь, что каждая трубка содержит достаточный объем (т.е., более 50% общего объема) исключает риск коллапса трубки.
  13. Тщательно аспирационная и удалить супернатант не беспокоя epididymosome гранул.
  14. Оцените epididymosome чистоты (рис. 4).
  15. Ресуспензируйте гранулы epididymosome в нужную среду согласно течению заявки(заявок). Например средней BWW обычно используется для экспериментов с участием совместного инкубации с сперматозоидов, или же соответствующие литического буфера в подготовке резолюции эпидидимальных протеома через SDS-PAGE.

3. иммунофлюоресценции окрашивания клеток mECap18

  1. Подготовка стерильные coverslips (которые будут проводиться в капюшоне культуры клеток)
    1. Замочите coverslips (12 × 12 мм) в этанол 70% за 10 мин и продезинфицируйте сушки при высокой температуре выше лампой этанола.
    2. Прохладный coverslip для 10 s перед передачей 12 хорошо пластины.
    3. Применить раствор стерильный поли L-Лизин для покрытия coverslip и соглашаться на 10 мин при комнатной температуре.
    4. Отменить решение поли L-лизин и промыть coverslip с стерильных H2O или соответствующих средних.
  2. Подготовка mECap18 клетки
    1. Проход аликвоты 2 × 105 mECap18 клеток в каждой скважине 12 хорошо пластины, содержащие coverslips.
    2. Культура клетки с mECap18 клеток средних (DMEM дополнен с 1% L-глютамином, пируват натрия 1%, 1% пенициллина/стрептомицина и 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 мкмоль/Л) содержащий плода теленка 10% сыворотки (ФБС) в инкубаторе 37 ° C под атмосферу 5% CO2 на ночь.
    3. После того, как клетки придерживаться coverslip, отказаться от среднего и промойте клетки дважды с PBS.
    4. Добавьте достаточное количество параформальдегида 4% (PFA) разводят в PBS погружают весь coverslip и исправить клетки при комнатной температуре в течение 15 мин.
    5. Отменить решение PFA и промыть coverslips дважды в PBS.
  3. Иммунофлюоресценции пятнать
    1. Разрушения mECap18 клетки путем погружения в 0,1% тритон X-100 в PBS на 10 мин.
    2. Промывайте coverslips с PBS.
    3. Блок mECap18 клетки с 3% BSA и приступить к immunolabeling клеток, используя эквивалентных протоколов описанными на разделах эпидидимальных ткани.

4. изоляция белков с кондиционером клетки культуры среднего

  1. Коллекция кондиционером клеток питательной среды
    1. Проход аликвоты 4 × 105 mECap18 клеток в каждой скважине 6 также пластины с mECap18 средой клеток с 10% FBS за 24 ч.
    2. Вымыть клетки mECap18 три раза с mECap18 клеток средних (подготовлен без FBS) для удаления остаточного FBS и любые связанные с ним белковых загрязнений.
    3. Добавить 1,5 мл mECap18 клеток средних (подготовлен без FBS) в каждой скважине и инкубировать с mECap18 ячейками для 12 h в инкубаторе 37° C под 5% CO2.
      Примечание: mECap18 клеток на этом шаге может быть оценена для различных целевых антигены согласно экспериментальный дизайн.
    4. После инкубации 12 h собирайте клеток средних и центрифуги на 2000 × g за 10 минут, чтобы удалить все сотовой мусора.
      Примечание: Длительность инкубации имеет возможность быть изменены в соответствии с экспериментальной дизайн/конечной оценки и с учетом ячейки толерантности к прикладной место. Рекомендуется адаптировать сроки инкубации, основанный на конкретных экспериментальных схем для достижения оптимальных результатов.
    5. Оцените жизнеспособность клеток mECap18 через применения стандартных Трипановый синий исключения пробирного28. Выбросите весь материал, в котором жизнеспособность клеток сократилось ниже 90% до устранения предвзятости, представленный белки, освобождены от мертвых или умирающих клеток.
    6. Изолировать белки от клеток средних следующим или сохранить средне-80 ° c.
  2. Белка изоляции (проводиться в Зонта)
    1. Добавьте 20% объем охлажденного 100% трихлоруксусной кислоты 80% объема кондиционером клеток средних осадок белков, выпустили из клетки культивировали mECap18. Инкубируйте на 4 ° C на ночь при постоянном перемешивании.
    2. После инкубации, Пелле центрифугированием осажденного белка (17 000 × g, 4 ° C на 10 мин).
      Примечание: Из-за ограниченного количества белка, ожидается, что выделяется в среду, вполне возможно, что гранулы не быть легко визуализируется после центрифугирования. Поэтому важно правильно сориентироваться трубку до центрифугирования и заботиться, чтобы не нарушить беременных Пелле расположение во время удаления супернатант.
    3. Отменить супернатант и помыть лепешка дважды с охлажденной ацетона до повторного центрифугирования (17 000 × g, 4 ° C на 10 мин).
    4. Осторожно снимите и выбросьте супернатант до воздушной сушки любых остаточных ацетона в пределах зонта.
    5. Ресуспензируйте Пелле белка в буфере соответствующие добыча в рамках подготовки анализа конечной точки для определения полной белка секреторных профили и/или отдельных целевых белков (например., SDS-PAGE, immunoblotting).

Результаты

Рисунок 1 и Рисунок 2 представителя результаты иммунофлюоресценции локализации DNM в мыши caput придатка. Каждый из трех изоформ DNM расследование профили отображения отдельных локализации. Таким образом DNM1 характеризуется относи?...

Обсуждение

Эти исследования включено использование Буэна в фиксированной эпидидимальных ткани, которые подвергались встраивание парафин и стандартные протоколы секущей. Буэна фиксирующие решение состоит из смеси формальдегида, Пикриновая кислота и уксусная кислота, с каждым компонентом, имею?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы хотели бы признать национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии проект Грант APP1103176 за поддержку этой работы.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Dynamin 1 antibodyAbcamab108458Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 2 antibodySanta Cruzsc-6400Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 3 antibodyProteintech14737-1-APHost species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ATP6V1B1 antibodySanta Cruzsc-21206Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
CD9 antibodyBD Pharmingen553758Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal
Flotillin-1 antibodySigmaF1180Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ALOX15 antibodyAbcamab80221Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
TUBB antibodySanta Cruzsc-5274Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal
PSMD7 antibodyAbcamab11436Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit Alexa Fluor 488ThermoA11008Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 488ThermoA11055Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 594ThermoA11058Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat Alexa Fluor 594ThermoA11007Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit HRPMilliporeDC03LHost species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat HRPMilliporeDC01LHost species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Mouse HRPSanta Cruzsc-2005Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)SigmaD9564
propidium iodide (PI)SigmaP4170
Mowiol 4-88Calbiochem475904
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7906
fetal bovine serum (FBS)BovogenSFBS-F
DMEMThermo11960-044
L-glutamineThermo25030-081
penicillin/streptomycinThermo15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIINSigmaA8380
sodium pyruvateThermo11360-070
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SigmaT4049
Paraformaldehyde (PFA)EMS15710
XyleneVWR Chemicals1330-20-7
EthanolVWR Chemicals64-17-5
Phosphate buffered saline (PBS)SigmaP4417
Sodium citrateSigmaS1804
TrisAstral0497-5KG
GlycerolSigmaG5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octaneSigmaD2522
Poly-L-gysineSigmaP4832
Triton X-100Sigma78787
Trypan blueSigmaT6146
Trichloroacetic acidSigmaT9159
AcetoneAjax FinechemA6-2.5 L GL
SucroseSigmaS0389
Poly (vinyl alcohol)SigmaP8136
D-GlucoseAjax Finechem783-500G
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Fluorescence microscopyZeissZeiss Axio Imager A1
UltracentrifugeBECKMAN COULTEROptima Max-XP
MicrocentrifugesEppendorf5424R
IncubatorHeracell150
Large Orbital ShakerRatekOM7
MicrowaveLGMS3840SR /00
Lab pH MeterMeterLabPHM220
Liquid-repellent slide markerDaido SangyoMini
CoverslipThermo586
6 well plateCELLSTAR657160
12 well plateCELLSTAR665180
SlideMikro-GlassSF41296PLMK
0.45 µm filterMillox-HVSLHV033RS
Kimwipes Dustfree PaperKIMTECH34155
Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm)BECKMAN COULTER347356
Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm)BECKMAN COULTER362305
Cell strainer 70 µm NylonFALCON352350
Petri dish 35 × 10 mm with camsSARSTED82.1135.500
Slide jarTRAJAN#23 319 00

Ссылки

  1. Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
  2. Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
  3. Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
  4. Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
  5. Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. . The epididymis. 3, (2006).
  6. Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
  7. Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
  8. Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
  9. Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
  10. Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
  11. Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
  12. Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
  13. Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
  14. Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
  15. Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
  16. Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
  17. Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
  18. Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
  19. Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
  20. Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
  21. Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
  22. Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
  23. Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
  24. Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
  25. Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
  26. Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
  27. Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D., Daniels, J. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. , 86-116 (1971).
  28. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , (2001).
  29. Elkjær, M. -. L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
  30. Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
  31. Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
  32. Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
  33. Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
  34. Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
  35. Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
  36. Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
  37. Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
  38. Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
  39. Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
  40. Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
  41. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  42. Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
  43. Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
  44. Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

138epididymosomeexosome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены