Лентивирусные вектор опосредованной генотерапии гепатоцитов Ex Vivo аутологичной трансплантации в свиней

Резюме

Этот протокол предназначен для описания свиных гепатоцитов изоляции и ex vivo гена доставки вылечить модели метаболических заболеваний через трансплантация аутологичных клеток. Хотя эта конкретная модель имеет уникальные преимущества, которые способствуют успешной терапии, является применение соответствующей основой для решения дополнительных заболеваний и указаний.

Аннотация

Генная терапия является идеальным выбором для лечения многие врожденные дефекты метаболизма печени. Экс vivo, лентивирусные векторы успешно используются в лечении многих кроветворных заболеваний в организме человека, как их использование обеспечивает стабильное трансген выражение благодаря вектор способность интегрироваться в хост геномов. Этот метод демонстрируется применение ex vivo генной терапии гепатоцитов к большой животной модели наследственных Тирозинемия типа I. Этот процесс состоит из 1) изоляции первичных гепатоцитов из аутологичной доноров/получателей помощи животным, 2) ex vivo гена доставки через гепатоцитов трансдукция с лентивирусные вектор и 3) аутологичной трансплантации исправленные гепатоцитов через портал вен инъекций. Успех метода обычно опирается на эффективный и стерильные удаления резекции печени, тщательной обработке подакцизным образца для изоляции жизнеспособных гепатоцитов достаточно для повторного голокоренные, высокий процент трансдукции изолированных клеток, и Асептические хирургические процедуры по всему для предотвращения инфекции. Технический сбой в любой из этих шагов приведет к низкой урожайностью жизнеспособных transduced гепатоцитов аутологичной трансплантации или заражения животного доноров/получателей помощи. Свинья модель наследственной Тирозинемия человека типа 1 (HT-1) выбрали для этого подхода является однозначно поддаются такой метод, как даже небольшой процент приживления исправленные клеток приведет к заселения печени с здоровые клетки, основанный на мощный Селективное преимущество над родной больной гепатоцитов. Хотя этот рост выбор не будет справедливо для всех указаний, этот подход является основой для расширения в другие показания и позволяет для манипулирования этой среды для решения дополнительных заболеваний, как в печени и за ее пределами, в то время как контроль за воздействием вирусный вектор и возможность пробить токсичности и tumorigenicity.

Введение

Врожденные дефекты метаболизма печени — семейство генетических заболеваний, которые коллективно затрагивают как многие, как 1 в 800 живорожденных¹. Многие из этих заболеваний одного гена дефекты² и функционально могут быть вылечены путем введения одной исправленные копии гена пострадавших в достаточное количество гепатоцитов³. Фактический процент гепатоцитов, которые необходимо исправить варьируется в зависимости от заболевания⁴ и в значительной степени зависит от характера белка, который кодирует, например, экскретируется белки против цитоплазмы. В большинстве случаев эффективность любого лечения для метаболических заболеваний легко assayed через присутствие биомаркеров часто доступны в циркуляции.

HT-1 является врожденным ошибка метаболизма в печени, что приводит к от дефекта в fumarylacetoacetate гидролазы (ФА)⁵, последний шаг ферментативные тирозин метаболизм⁶. FAH дефицит приводит к построению токсичных метаболитов в печени, что может привести к острой печеночной недостаточности и смерти или в хронической формы болезни могут вызвать цирроз и гепатоцеллюлярной карциномы. Заболевание клинически управляется администрацией 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), малые молекулы ингибитора фермента вверх по течению от ФА в метаболизме тирозина. Заболевание представляет собой идеальную среду для проверки методов генной терапии, как успешной коррекции даже небольшое количество гепатоцитов в конечном итоге приведет к заселения всей печени с исправленной ячейки в больших и малых животных моделях ^{7 , 8}. это происходит потому, что исправить клетки имеют глубокие выживания преимущество над нескорректированной клетки за счет накопления токсичных метаболитов в последнем. Потеря нескорректированной гепатоцитов позволяет для выборочного расширения исправленные гепатоцитов в соответствии с регенеративной способностью печени. Лечение может легко следовать измерения сокращение циркулирующих тирозин и succinylacetone уровнях, после трансплантации.

Для того, чтобы оправдать захватнический характер процедуры, которая включает в себя частичной гепатектомии, Цель этого подхода должен быть прочный лечения. Таким образом некомпетентных лентивирусные векторы репликации используются потому, что они будут стабильно интегрироваться в геном гепатоцитов⁹. обеспечение доставки исправленные гена для всех дочерних клеток в печени растет и расширяется заменить быстрой потери нескорректированной клеток. Это выгодно над адено связанных вирусных векторов (AAV), которые существуют главным образом как episomes, которые могут передаваться только на одну ячейку дочь во время митоза¹⁰ тем самым потерять любой эффект терапии в течение нескольких недель.

Несмотря на растущий объем литературы поддерживает безопасность человека¹¹, опасения за генотоксичных события смягчаются путем ограничения трансдукции клеток хозяина в среде с контролируемой в пробирке . Бесплатные Векторные вводится никогда не системно принимающей страны при выполнении этого метода, ограничивая воздействие гепатоцитов, которые будет вновь внесен с аутологичной трансплантацией через воротной вены.

Этот доклад описывает метод хирургического и ex vivo процедуры, используемые для изоляции гепатоцитов для генной терапии ex vivo и¹² последующих аутологичной трансплантации для лечения свинья HT-1⁸. Весь процесс включает в себя 1) частичной гепатектомии, который служит источником гепатоцитов и стимулом роста для печени хоста, 2) изоляции гепатоцитов из подакцизным печени, следуют ex vivo гена коррекции и, наконец, 3) реинтродукция исправленные гепатоцитов обратно в узле. Метод, описанный для всех крупных животных моделей с некоторыми изменениями, но только свинья фа недостаточным¹³ будет иметь преимущество выборочного среды для исправленной гепатоцитов.

протокол

Все животные процедуры были проведены в соответствии с институциональных руководящих принципов и были рассматриваются и утверждаются институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) до проведения исследования. Описанные здесь процедуры выполнялись на мужские и женские большие белые ферме свиней (50% Landrace/50% большой белый генетический фон) до 3 месяцев возраста, которые считаются здоровыми и подходит для хирургии.  Животные размещены социально если считают несовместимой сотрудниками ветеринарных учреждениях.  Животные питаются соответствующие уровни Чоу дважды ежедневных и наблюдаемые клинические признаки ухода сотрудников по крайней мере один раз в день.

1. Подготовка к операции

1. Администрирование телазол 5 мг/кг и ксилазина 2 мг/кг внутримышечно, чтобы побудить седативный эффект. Администрировать бупренорфин SR подкожно в дозе 0,18 мг/кг для послеоперационного обезболивания (предполагалось анальгезии от этой дозы будет до 72 ч). Вручную проверьте животное для ответов проверить седативный эффект.
2. После того, как успокоительное, вставьте внутривенного катетера в Вену периферийных уха для фармакологической доступа.
3. Цефазолин внутривенного введения 25 мг/кг и администрировать внутримышечно 5 мг/кг Цефтиофур предоперационная.
   1. Администрировать нормальное saline внутривенно, чтобы держать артериальное давление и частота сердечных сокращений в нормальных физиологических пределах во всей процедуре.
4. Место orogastric трубки для распаковки желудка. Выполняют эндотрахеальной интубации с соответствующего размера эндотрахеальную трубку, проверки надлежащего размещения сжимая груди вручную, чтобы обнаружить выдох и затем механически вентиляции животное с изофлюрановая 1-3%.
5. Место электрокардиограммы (ЭКГ) приводит, тонометра, датчик температуры и пульсоксиметр для мониторинга и записи жизненно важные признаки. Поместите животное в лежачем положении, скраб живота от грудной клетки таз с Бетадин и драпировка среду.
6. Проветрите субъекта с 1-3% изофлюрановая во время процедуры для поддержания хирургической плоскости анестезии. Продолжать контролировать жизненно важные признаки изменения и настроить изофлюрановая соответственно для поддержания сердечного ритма на уровнях предварительного разреза, если перепады давления крови резко, уменьшить изофлюрановая и инициировать институционально утвержденного агентов, чтобы восстановить жизнеспособность, такие как внутривенно адреналин.
   1. Запись, пульс, частота дыхания, артериальное давление и температуры тела на запись хирургическая процедура, чтобы отслеживать и поддерживать благосостояние животных согласно учреждение конкретной политики для обеспечения соответствия стандартам крупных животных.

2. лапароскопическая частичной гепатектомии

1. Выполните начальный порт сайта запись с использованием открытых Хассен техника краниально к пупка. Когда визуализируется брюшины, безопасно ввести 12 мм троакар в брюшную полость. Проходят 5 мм, 30°, область через этот порт.
2. Insufflate живота с CO₂ 15 мм рт.. Под прямой визуализации с помощью лапароскопической камеры поместите два дополнительных 5 мм порты триангуляции на левой боковой доле печени. Точное размещение портов будет зависеть от размера и анатомии животных.
   1. На данный момент место лапароскоп в один из портов 5 мм.
3. Определение сегмента левой боковой точке основных трещина левой доли печени. Эта трещина отделяет медицинских и левой боковых сегментов. Обеспечения портала структур наряду с печеночной вены вдоль этой щели с помощью хирургического степлер (см. Таблицу материалы). Разрез паренхимы через этот трещина, используя последовательный обстрелов из степлер, 60, 45 или 30 мм длиной сосудистых нагрузок.
   1. При завершении Паренхиматозный резекции, оцените остатки печени для обеспечения адекватного гемостаза. Контроль, любое кровотечение из паренхимы с Прижигающая или шва.
4. Извлечь печени раздел с помощью эндоскопической graspers и эндоскопической ткани извлечения мешок.
5. Удалите порты и закрыть 12 мм порт разрез в три слоя шва Прерванный размер 0 для срединной фасции, идущий швом 2-0 для глубоких дермального слоя и работает 4-0 шовный subcuticular слоя. 5 мм портов может быть закрыт в один слой с 2-0.
6. Место стерильную повязку на разрезы (см. Таблицу материалы).
7. Когда клетки будет готова в менее чем 4 часа, сохранить животных под общим наркозом постоперационно до времени аутотрансплантации.
8. В качестве альтернативы, если Сотовый манипуляции требуют более длительных периодов (таким образом, чтобы позволить формирование гепатоцитов сфероидов или дольше трансдукции/выбор, основанный на отдельных приложений этот метод) позволяют животное, чтобы оправиться от анестезии и повторите индукции анестезии шаги до аутотрансплантация когда клетки будут готовы.

3. гепатоцит изоляции

1. Подключите Перистальтический насос с перфузии для доставки решения теплой дисперсии (поддерживается в водяной бане 43 ° C) к катетеры быть помещены в большие подвергаются сосуды печени секции, таким образом, что решение температура-38 ° C на введение в ткани. Все трубы, оборудование и решения должна поддерживаться стерильные, чтобы убедиться, что клетки для трансплантации.
   1. Премьер насос и трубы с за II до запорный позиционируется для переключения между I и II за доставку на ткани. Переключитесь % я позиции и премьер оставшуюся часть набора труб, заполнение в линии Пузырь ловушки полностью во избежание введения запорный пузырьков воздуха в ткани.
2. Подготовьте чистую поперечной сократить перпендикулярно к печеночной циркуляции раскрыть сечения ветвей воротной вены и печеночные Вены для катетеризации.
3. Catheterize доступных открытых вен с плотно пригнанной катетер, чтобы избежать утечки perfusate. Иглу, по крайней мере 1 портал и 1 печеночной вены для обеспечения адекватной перфузии тканей.
   1. Обеспечить catheter(s) заливают/бесплатно воздуха перед размещением катетер в Вену.
4. Perfuse с теплой одного в 100 мл/мин, перемещение отводной трубки от вен вен каждые 30 секунд до 1 мин цикла жилах всех доступных для 15 – 20 мин. Во время одного, инфузионная эвакуации трубки поддон процедуры в контейнер отходов под вакуумом.
5. Переключитесь на II в 100 мл/мин, велосипеде через вены как с одного, для в общей сложности 30 мин. Во время за II используйте обратный насос для корзины за II обратно в резервуар для повторного администрации для сохранения подготовка активных ферментов. Задать обратный насос меньше, чем отток насоса (т.е., 94 мл/мин), соблюдая осторожность, чтобы не возвращать излишнего воздуха к бутылке, источник.
   1. Если печень капсулы перерывы, это время может быть уменьшено.
   2. Если печень не переваривается полностью (не оставаться ямочки, с нежной фокуса давлением) могут быть выполнены дополнительные 5 мин перфузии.
6. Иногда (примерно каждые 5 минут) документ температуры поверхности Пузырь ловушки и/или печени для обеспечения гепатоцитов не становится холодно. Если печень становится холодно (< 35 ° C) увеличение тепла водяной бане для восстановления печени температуры ближе до 38 ° C. Функции печени следует Бланш мере перфузии.
7. Удаление печени стерильные пластины или Петри для транспортировки капот культуры клеток. Покрывают стерильной поле с стерильных Пелерина для поддержания целостности во время обработки гепатоцитов.
8. Предоставлять Секции печени из стерильных Пелерина и погрузите печени с холодной гепатоцитов мыть СМИ (HWM). Нарушить капсулы, перетаскивая ножницы в верхней. Стерильные перчатки, массируют печени выпустить гепатоцитов в среду.
9. Фильтр HWM, содержащие гепатоцитов через стерильную марлю в центрифуге бутылки большой (~ 200 мл). Вымойте гепатоцитов через следующую процедуру в трех экземплярах, сочетание клетки гранулы из нескольких бутылок после первого ресуспендирования (если применимо):
   1. Центрифуга 50 x g, 5 мин, 4 ° C.
   2. Аспирационная и Ресуспензируйте в 150 мл HWM.
   3. Оставьте гранулы в HWM после стирки 3^rd .
10. Граф концентрации клеток с помощью Горяева или другого устройства, как доступные. Эти клетки теперь готовы для ex vivo манипуляции интереса, включая генотерапии, сортировки клеток или другие специализации до аутотрансплантации. Окончательный объем HWM может корректироваться целевой конкретной концентрации (клеток/мл).

4. гепатоцит трансдукция

1. Ресуспензируйте гепатоцитов в средствах массовой информации (Дульбекко изменение орел средний [DMEM], 10% плода бычьим сывороточным [FBS], пенициллин-стрептомицина,-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота [HEPES] 4, дексаметазон, эпидермального фактора роста [EGF] и NTBC) на 1-2 миллион клеток / мл в коническую пробирку на льду.
2. Оттепель лентивирусные вектор при комнатной температуре и добавить в конической трубки на льду на целевой 20 кратности инфекции (МВД) для связывания клеток. Вращайте клетки на 4 ° C 10 об/мин 90 мин для привязки вирусный вектор к клеточной поверхности.
3. Передача трубы до 37 ° C на 30 – 40 мин инвертировать смешивать каждые 5 минут для облегчения векторного преобразователя связанной ячейки.
4. Центрифуга клетки на 50 x g при 4 ° C для 4 мин Ресуспензируйте Пелле клеток в солевой раствор в нужной концентрации на льду. Повторите это мыть, чтобы обеспечить удаление любой свободный вектор от подготовки.
5. Если возможно плиты достаточно аликвоты клеток (т.е., 500 000 ячеек на хорошо в 6 хорошо клетки культуры пластина) для проверки жизнеспособности, адгезии, электромеханической эффективности и т.д.
   Примечание: Это часто не позволяет оценить эти параметры до аутотрансплантация, особенно для тот же день процедур. К примеру описываемую процедуру занятых непомеченным Fah cDNA под контролем альфа-1 антитрипсина печени конкретной промоутера, который не был легко assayable в гепатоцитах до трансплантации. Однако эти позолоченные клетки могут assayed после аутотрансплантации как показатель успеха трансдукции (т.е., через западный blotting) или предсказатель общего успеха процедуры.

5. гепатоцит трансплантации

1. Идентифицировать воротной вены через УЗИ с помощью датчика 2 до 5 МГц. Прямые 18 Г, 5-дюймовый иглы к основной воротной вены проксимальнее его бифуркации.
2. Начните медленно ручной настой до 1 x 10⁹ гепатоцитов (приблизительно 10 g) с помощью шприца. Монитор портала давления во время пересадки с помощью катетера инфузии.
   1. Если портал давление возрастет более чем 8 мм рт.ст выше базовой линии, приостанавливать инфузии и позволить давление, чтобы вернуться в базовых уровней.
   2. Если портал давления не вернуться к базовой после приостановки настой на пять минут, прекратить вливания.
3. После пересадки и удаления катетера используйте ультразвук оценить наличие тромбоза и направить поток в воротной вены.

6. послеоперационное восстановление и техническое обслуживание

1. Перемещение при условии надлежащего восстановления области и наблюдать до тех пор, пока животное полностью амбулаторных, мониторинг ЧСС, Сатурация кислорода и температура тела каждые 15 – 30 мин поддержания температуры тела с теплого одеяла или обертывание подогревом воздуха, при необходимости.
2. Администрировать омепразола 1 мг/кг, рот ежедневно (до конца исследования) для уменьшения шансов желудочных язв, которые могут произойти с приступами inappetence.
3. После операции животное тесно контролируется лаборатории и ветеринарного персонала и обычно не требуют дополнительных обезболивающее отдельно от дозы предоперационное бупренорфина.  Если квалифицированного ветеринарного ухода сотрудников (разрез, охрана, inappetence, вялость) наблюдаются признаки бедствия/боли, могут назначаться противовоспалительные средства (например, Carprofen).

7. рецепты

1. В таблице 1 приведена рецепты, используемые в настоящем Протоколе.

Реагент	HWM	Реагент	За я (10 x)	За II (10 x)
Уильямс-E порошок (г/Л)	10.8	NaCl (г/Л)	83	39
NaHCO3 (г/Л)	2.2	KCl (г/Л)	5	5
HEPES (г/Л)	2.6	HEPES (г/Л)	24	240
Ручка/стрептококк (100 x, мл/Л)	10	EGTA (г/Л)	9.5	-
Плода бычьим сывороточным (мл/Л)	100	N-ацетил L-цистеин	8	8
pH	7.3	(N-A-C, г/Л)
		Нитроглицерина (мл/Л)	5	5
		CaCl2 2 H2O (г/Л)	-	7
		Коллагеназы D (мг/мл)	-	0.2
		pH	7.4	7.6

Таблица 1: Рецепты для решения, используемые в изоляции гепатоцитов из печени секций.

Результаты

Резекция печени и аутологичной трансплантации схематически представлены на рисунке 1. Представитель когорты 5 свиней, которые подверглись резекции печени, большинство было урожайности > 1 х 10⁹ гепатоцитов с приблизительно 80% жизнеспособность (

Обсуждение

В настоящем докладе описываются ex vivo аутологичной генной терапии подход к вылечить свинину модель HT-1. Она включает в себя частичной гепатектомии, следуют ex vivo изоляции гепатоцитов и трансдукция изолированных гепатоцитов с вирусом lenti, проведение корректирующих трансген. Исп?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Yecuris	20-0027
12 mm Trocar	Covidien	B12STS
5 mm Trocar	Covidien	B5SHF
Endo Surgical Stapler 60	Covidien	EGIA60AMT
Endo Surgical Stapler 45	Covidien	EGIA45AVM
Endo Surgical Stapler 30	Covidien	SIG30AVM
Endo catch bag	Covidien	173050G
0 PDS	Ethicon	Z340H
2-0 Vicryl	Ethicon	J459H
4-0 Vicryl	Ethicon	J426H
Dermabond	Ethicon	DNX12	Sterile Dressing
Williams’-E Powder	Gibco	ME16060P1
NaHCO3	Sigma Aldrich	S8875-1KG
HEPES	Fisher	BP310-1
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Fetal Bovine Serum	Corning	35-011-CV
NaCl (g/L)	Sigma Aldrich	S1679-1KG
KCl (g/L)	Sigma Aldrich	P3911-500G
EGTA (g/L)	Oakwood Chemical	45172
N-acetyl-L-cysteine	Oakwood Chemical	3631
(N-A-C, g/L)	Sigma Aldrich	A9165-100G
CaCl2 2H2O (g/L)	Sigma Aldrich	223506-500G
Collagenase D (mg/mL)	Crescent Chemical	17456.2
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Corning	15-013-CV
Dexamethasone	Fresenius Kabi	NDC6337
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0314