JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для изоляции лейкозных клеток из костного мозга пациентов лейкемии и анализ состояния их метаболизма. Оценка метаболических профиля первичных лейкозных клеток может помочь лучше охарактеризовать требование начальной клеток и может способствовать более персонализированной медицины.

Аннотация

Метаболические требования раковых клеток может негативно повлиять на выживание и эффективности лечения. В настоящее время фармацевтических ориентации метаболических испытания во многих типах опухолей. Таким образом характеристика раковых клеток метаболические установки является неизбежным для правильный путь для улучшения общего итога пациентов. К сожалению в большинстве случаев рака, злокачественные клетки являются довольно трудно получить в большем количестве и биопсия тканей не требуется. Лейкемия является исключение, где достаточное количество лейкозных клеток могут быть изолированы от костного мозга. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции лейкозных клеток из костного мозга пациентов лейкемии и последующего анализа их метаболического состояния с использованием анализатора внеклеточного потока. Лейкозных клеток, изолируются градиент плотности, которая не влияет на их жизнеспособность. Следующий шаг культивирования помогает им восстанавливать, таким образом измеряется метаболических государство является состояние клеток в оптимальных условиях. Этот протокол позволяет добиться последовательного, хорошо стандартизованных результатов, которые могут быть использованы для персонализированной терапии.

Введение

Метаболические профиль является одной из основных характеристик клеток и изменены биоэнергетики сейчас считаются одним из отличительных признаков рака1,2,3. Кроме того изменения в метаболические установки может использоваться в лечении рака ориентации сигнальных путей или ферментативный машины раковых клеток4,5,6. Зная метаболических предрасположенность раковых клеток таким образом преимущество и может помочь улучшить текущий терапии.

Существует большое количество уже установленных методов, которые можно оценить метаболическую активность клеток в культуре. Что касается гликолиза, поглощение глюкозы может быть измерено радиоактивных маркировки, с использованием 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) или внеклеточная лактат уровнях измеряется ферментативно7,8. Скорость окисления жирных кислот — еще один метаболических параметр измеряется гетерогенны помечены пальмитата9,10. Скорость потребления кислорода — это метод, широко используется для определения митохондриальной активности клеток11,12, вместе с митохондриальной мембраны потенциал оценки13,14, СПС/ADP (аденозин 5 ′ трифосфата/5′ аденозиндифосфат) соотношение измерения15 или полная внутриклеточных СПС измерения16. Сигнальные пути, известный регулировать обменные процессы может определяться белок количественной и может улучшить понимание метаболических измерения17,18,19.

Однако все эти методы измерения только один, или в лучший сценарий, несколько метаболических параметров в одном образец одновременно. Важно отметить, что одновременное измерение скорости потребления кислорода (OCR) и внеклеточной подкисления (ECAR) может быть достигнуто путем анализа внеклеточного потока анализатором, например, морской конек XFp. OCR является показателем митохондриальное дыхание и ECAR является главным образом результатом гликолиз (мы не можем игнорировать CO2 производства возможно подъемные ECAR клеток с высоким Оксидативное фосфорилирование активности)20. До настоящего времени были изучены различные типы клеток с помощью этих анализаторов21,,2223.

Здесь мы описываем протокол для анализа внеклеточного поток первичного взрывов (лейкозных клеток, полученных от стадии незрелых гемопоэтических) от больных лейкемией. В меру наших знаний отдельный протокол для первичного взрывов пока недоступна.

протокол

Все образцы были получены с informed consent родителей или опекунов детей и утверждения этического Комитета Карлова университета в Праге, Чешская Республика, исследование нет. NV15-28848A.

1. Подготовка реагентов

  1. Подготовка 500 мл PBS, растворяя 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 4,3 мм Na2HPO4, 1.47 мм х2PO4, в ddH2O. Регулировка рН 7,4 с HCl. Стерилизируй-отпусти, автоклавирования.
  2. Подготовка 100 мл RPMI среды: среду RPMI 1640 с L-аланил-глютамин дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл).
  3. Подготовка 50 мл 0,1 М NaHCO3 в дистиллированной воде. Отрегулируйте пэ-аш до 8.1, фильтр стерилизовать (0,22 мкм) и хранить при 4 ° C.
    Примечание: Для двух пластин анализатор 8-Ну внеклеточного потока, подготовьте 250 мкл 0,1 М NaHCO3 рН 8.1.
  4. Готовим 1 мл 2 M D-глюкозы в дистиллированной воде. Фильтр стерилизовать (0,22 мкм) и хранить при температуре от-20 ° C.
  5. Подготовка 100 мкл 1 мм Oligomycin A в этиловом спирте. Фильтр стерилизовать (0,22 мкм) и хранить при температуре от-20 ° C.
  6. Подготовка 250 мкл 1 M 2-deoxy-D-глюкозы (2-ГД) в минимальной DMEM (средний Дульбекко изменение Eagle). Нагреть до 37 ° C и скорректировать рН 7,4 (выполняют измерения pH при 37 ° C). Фильтр стерилизовать (0,22 мкм) и хранить при температуре от-20 ° C.
  7. Подготовка 100 мкл 1 мм FCCP (карбонил цианид p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) в ДМСО. Фильтр стерилизовать (0,22 мкм) и хранить при температуре от-20 ° C.
  8. Подготовка 100 мкл 1 мм ротенон в этиловом спирте. Фильтр стерилизовать (0,22 мкм) и хранить при температуре от-20 ° C.
  9. Подготовка 100 мкл 1 мг/мл Antimycin A в этиловом спирте. Фильтр стерилизовать (0,22 мкм) и хранить при температуре от-20 ° C.
  10. Перед использованием Подготовьте 10 мл гликолиз стресс-тестирования среды. Теплый минимальный DMEM до 37 ° C на водяной бане и скорректировать рН 7,4 (выполняют измерения pH при 37 ° C).
  11. Перед использованием Подготовьте 10 мл среды стресс тест ячейка Mito с BSA. Дополнить минимальный DMEM 2 мм L-глютамином, 10 мм D-глюкоза, 1 HEPES (рН 7,4), пируват 1 мм и 0.1% BSA (бычий сывороточный альбумин). Нагреть до 37 ° C на водяной бане и скорректировать рН 7,4 (выполняют измерения pH при 37 ° C).
  12. Перед использованием Подготовьте 10 мл среды стресс тест ячейка Mito без BSA. Дополнение к минимальной DMEM с 2 мм L-глютамином, 10 мм D-глюкоза, 1 HEPES (рН 7,4) и пирувата 1 мм. Теплый Mito клетки стресс-тестирования среды без BSA до 37 ° C на водяной бане и скорректировать рН 7,4 (выполняют измерения pH при 37 ° C).
    Примечание: BSA добавляется средство стресс-тест ячейка Mito потому что клетки лучше реагировать на FCCP когда носитель дополняется BSA (были протестированы различные условия). Клетки Mito стресс-тестирования среды без BSA используется для загрузки портов как производитель не рекомендует использовать BSA в среде.

2. изоляция мононуклеарных клеток из костного мозга

Примечание: В идеале, измерения состояния метаболических первичных лейкозных клеток следует начать сразу же после изоляции коллекции и клеток костного мозга. Тем не менее соответствующие данные могут быть также получены из клеток, изолированные после транспортировки от других гематологии центров в Чешской Республике. Выполните все вложенные в стерильных культуры ткани капюшоном.

  1. Разминка PBS и градиент средней плотности до комнатной температуры.
  2. Разбавьте образца костного мозга пациента лейкемии с PBS, в соотношении 1:1. Убедитесь, что образец содержит по крайней мере 80% лейкозных взрывов.
  3. Определите процент взрывов проточной цитометрии с использованием конкретных CD маркеры для иммунофенотип характеристика типов клеток. После разделения градиента плотности обнаружить позитивные события нуклеиновых кислот с ядерной краситель для того чтобы установить общее число ячеек.
  4. Затем, определите с помощью конкретных CD маркеры для каждого типа лейкемии клеток лейкемии: B-ALL (CD19, CD45), T-ALL (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) и AML (CD45, CD33 и конкретных миелоидного маркеры)24. Разделите количество клеток лейкемии, позитивные для конкретных CD маркеры всех ядерных клеток определить процент клеток лейкемии взрыва.
    Примечание: Костный мозг должен быть собраны в пробирки с антикоагулянтами.
  5. Тщательно слой 6 мл пробы разреженных костного свыше 6 мл среды градиента плотности в 15 мл Конические трубки. Центрифуга на 400 x g 35 мин при 4 ° C в размахивая ведро ротора без тормозов.
    Примечание: Объем выборки может быть разделена более аликвоты или 50 мл Конические трубки может быть использован с большее количество градиента плотности среды.
  6. С помощью пипетки Пастера, тщательно передать межфазного слоя, который состоит из мононуклеарных клеток (рис. 1) новый Тюбик 50 мл конические с 5 мл ФСБ. Центрифуга на 400 g × 10 мин при 4 ° C в ротор размахивая ведро.
    Примечание: Перенести все слои мононуклеарных клеток в единый 50 мл Конические трубки с 5 мл ФСБ.
  7. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл стерильного PBS. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
    Примечание: Количество лейкозных клеток в 1 мл без наддува костного существенно отличается среди пациентов25.

3. ночь культивирование мононуклеарных клеток

Примечание: Выполните все вложенные в стерильных культуры ткани капюшоном.

  1. Подготовьте два T75 колбы с 20 мл RPMI. Для каждого колбу добавьте 30 х 106 изолированных мононуклеарных клеток. Инкубировать клетки с колбой, стоя на 16 – 24 h на 5% CO2 и 37 ° C.

4. Подготовка клетки клей покрытием пластин

  1. Герб двух пластин анализатор 8-Ну внеклеточного потока.
    Примечание: Выполните покрытие в стерильных культуры ткани капюшоном.
  2. Добавить 2.2 мкл клеток клея (плотность: 2.54 мг/мл) до 250 мкл 0,1 М NaHCO3, pH 8,1 и пипетки немедленно 12,5 мкл раствора в каждой скважине.
    Примечание: Клей запасов решения ячейки могут отличаются в их плотности, отрегулировать громкость, добавлены к NaHCO3 соответственно.
  3. Пусть пластины сидеть в капот для около 20 минут, а затем аспирационная клей клеток и мыть каждый хорошо дважды с помощью 200 мкл стерильной воды. Пусть это сидеть в капот с открытой крышкой, пока скважин сухим.
  4. Используйте пластины сразу или сохранить до 1 недели при температуре 4 ° C с обода, завернутые в фильме парафин, чтобы избежать конденсации. Убедитесь, что пластины подогретой до комнатной температуре (около 20 мин) в капюшоне перед посевом клетки.

5. гидратации датчик картриджа

Примечание: Гидрат два 8-Ну внеклеточного потока анализатор картриджей.

  1. Отдельные пластины утилита и датчик картриджа. Переверните датчик картридж на стенде лаборатории.
  2. Заполните каждый хорошо из утилиты пластины с 200 мкл calibrant. Заполните каждый ров вокруг лунки с 400 мкл calibrant.
  3. Возвращение датчик картридж в пластину утилиты, которая теперь содержит calibrant.
  4. Место картриджа в увлажненные, -CO2, 37 ° C инкубатор на ночь.
  5. Включите анализатор внеклеточного потока и пусть оно теплое до 37 ° C на ночь.

6. Заполнение ячейки в ячейку клей покрытием пластин

Примечание: Для гликолиз стресс-теста, используйте гликолиз стресс-тестирования среды. Для стресс-тест ячейка Mito используйте среднего стресс тест ячейка Mito с BSA.

  1. Клетки семян для стресс-тест гликолиза и стресс-тест ячейка Mito в отдельных плит. Для каждого теста используйте клеток из одной колбе с ночь культуры.
  2. Центрифуга клетки на 200 x g 5 мин при комнатной температуре. Ресуспензируйте клеток в 1 мл соответствующей среды и подсчитать их.
  3. Добавьте6 4 x 10 живых клеток в окончательный объем 400 мкл (используйте соответствующий средний).
  4. Пластина 50 мкл суспензии клеток в скважины B-G. Убедитесь, что 500000 клеток являются семенами в одной скважиной.
    Примечание: Важно семян ровно 500 000 ячеек на хорошо, как другие нормализация не производится. Таким образом, можно сравнить результаты от разных пациентов. Оптимальное количество реплицирует это шесть, как это описано здесь. Не рекомендуется использовать меньше реплицирует, поскольку главные ячейки могут иногда вести ошибочно.
  5. Добавьте 180 мкл соответствующего носителя в скважины A и H (эти скважины будет служить коррекция фона).
  6. Центрифуга пластину на 400 g x 5 мин при комнатной температуре с тормозом, равным 1.
  7. Добавьте 130 мкл соответствующего среднего скважин B-G в два 8-Ну внеклеточного потока анализатор пластины медленно и осторожно. Визуально подтвердите, что клетки стабильно соблюдаются в нижней части скважины путем просмотра под микроскопом.
  8. Поместите пластины в увлажненные, -CO2инкубатора 37 ° C за 30 мин.

7. Погрузка картридж датчик

  1. Для стресс-тест гликолиза Подготовьте 250 мкл каждого из глюкозы 100 мм, 20 мкм Oligomycin A и 1 M 2-DG, все в гликолизе стресс тест среднего.
  2. Для стресс-тест ячейка Mito, подготовить 250 мкл каждого из 20 мкм Oligomycin A, 15 мкм FCCP, 30 мкм FCCP и смесь 10 мкм ротенон и 10 мкг/мл Antimycin A, все в среде стресс-тест ячейка Mito без BSA.
    Примечание: Инъекций две концентрации FCCP в одном assay рекомендуется, поскольку есть не хватает пациентов материал для FCCP титрования. Тем не менее концентрации должны определяться исследователь.
  3. Загрузите соединений в порты соответствующие форсунки картриджа следующим образом (Таблица 1):

8. Настройка программы

  1. Для стресс-тест гликолиза настройте программу, как описано в таблице 2.
  2. Для стресс-тест ячейка Mito установите программу, как описано в таблице 3.
  3. Запустите программу. Замените пластину calibrant пластину пробирного (при появлении запроса).

9. Оценка и интерпретация результатов

  1. В гликолизе результаты стресс-тестов вычтите наименьшее значение ECAR после инъекции 2-ГД, от всех других значений ECAR.
    Примечание: Это наименьшее значение представляет не гликолитических подкисления. Обычно минимальное значение составляет от 4й измерений.
  2. Вычислить базальной подкисления, гликолиза, максимальная гликолиза и гликолитических заповедник параметры из гликолитических функции (рисунок 2A). После вычета наименьшее значение ECAR, рассчитать базальной подкисления как средство ECAR от точки первые три измерения (опустить первое значение ECAR, если он значительно отличается от двух других), рассчитать гликолиза как средство ECAR из трех измерений очков после инъекции глюкозы и рассчитать максимальную гликолиза как средство ECAR из трех измерений после Oligomycin инъекции. Рассчитать Glycolytic резерв как максимальная гликолиз минус гликолиза.
    Примечание: в качестве альтернативы, для вычисления максимального гликолиза, используйте наибольшее значение ECAR из трех точек измерения.
  3. В результатах стресс тест ячейка Mito вычтите наименьшее значение оптического распознавания текста после инъекции ротенон/Antimycin A от всех других значений OCR.
  4. Вычислить базальной дыхания, производства АТФ, максимальная дыхания и запасные емкости параметры из митохондрий (рис. 2B). После вычета наименьшее значение OCR, вычислите базальной дыхания как средство распознавания от точки первые три измерения.
    Примечание: Максимальная дыхания — высшая ценность OCR после инъекции FCCP.
  5. Для расчета производства АТФ вычтите среднее значение точки измерения трех ОРЗ после инъекции Oligomycin A от базальной дыхания. Вычислить запасных качестве максимального дыхания минус базальной дыхания.
    Примечание: Всегда Вычислите максимальное дыхания от наибольшее значение OCR, независимо от концентрации FCCP.

Результаты

Рисунок 3 показывает кривые после гликолиз стресс-тестирования и измерения стресс-тест ячейка Mito лейкозных взрывов от BCP-ALL (клетки B прекурсоров острый лимфобластный лейкоз) и AML (острый миелобластный лейкоз) пациентов. Указывается также расчет метабол?...

Обсуждение

Описанные выше протокол позволяет для измерения метаболической активности, оцениваются значения OCR и ECAR в первичной лейкозных взрывов, полученных от пациентов с острым лимфобластным лейкозом (все) или острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Преимуществом измерений с помощью анализатора внекл?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Чешской центров детской гематологии. Эта работа была поддерживается грант Министерства здравоохранения (NV15-28848A), министерством здравоохранения, Чешская Республика, Университет больница Мотол, Прага, Чешская Республика 00064203 и министерства образования, молодежи и спорта НПУ nr. LO1604.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementGibco, ThermoFisher Scientific61870-010
Fetal Bovine SerumBioseraFB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco, ThermoFisher Scientific15240-062
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761-500G
D-(+) GlucoseSigma-AldrichG7021-100G
Oligomycin ASigma-Aldrich75351-5MG
2-Deoxy-D-glucoseSigma-AldrichD8375-1G
FCCPSigma-AldrichC2920-10MG
DMSOSigma-AldrichD8418-100ML
RotenoneSigma-AldrichR8875-1G
Antimycin A from Streptomyces sp.Sigma-AldrichA8674-25MG
Seahorse XF Base Medium, 100 mLAgilent Technologies103193-100
L-glutamine solution, 200 mMSigma-AldrichG7513-100ML
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6Sigma-AldrichH0887-100ML
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280-25G
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA2153-10G
Ficoll-Paque PlusSigma-AldrichGE17-1440-02Density gradient medium
Seahorse XFp FluxPakAgilent Technologies103022-100
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue AdhesiveThermoFisher ScientificCB40240
Seahorse Analyzer XFpAgilent TechnologiesS7802A
Seahorse XFp Cell Culture MiniplateAgilent Technologies103025-100

Ссылки

  1. DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
  2. Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
  3. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
  4. Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
  5. Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
  6. Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
  7. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
  8. Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
  9. Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
  10. Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
  11. Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
  12. Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
  13. Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
  14. Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
  15. Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
  16. Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
  17. Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
  18. Lee, K. -. H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
  19. Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
  20. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
  21. Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
  22. Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
  23. Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
  24. Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
  25. Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

141

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены