Автоматизация протокол синтеза радиоиндикаторных позитронно выбросов томография (ПЭТ) для клинических производства

Резюме

Позитронно выбросов томография (ПЭТ) изображений сайты, которые участвуют в нескольких ранних клинических исследованиях испытаний нужен надёжный и универсальный радиоиндикаторных производственных возможностей. С помощью радиоиндикаторных [¹⁸F] Clofarabine в качестве примера, мы иллюстрируют способ автоматизировать синтез радиоиндикаторных, используя гибкие, основанные на кассету radiosynthesizer и проверить синтеза для клинического использования.

Аннотация

Разработка новых Трейсеры томография (ПЭТ) позитронно выбросов позволяет исследователей и клиницистов изображения все более широкий спектр биологических задач и процессов. Однако все большее число различных трассировщиков создает проблемы для их производства на radiopharmacies. Хотя исторически это был практический посвятить настроен пользовательский radiosynthesizer и горячей камере для повторного производства каждого индивидуального трассирующими, он становится необходимым изменить этот рабочий процесс. Последние коммерческие radiosynthesizers, основанные на одноразовые кассеты/комплекты для каждого трассировочного упростить производство нескольких Трейсеры с одним набором оборудования, устраняя потребность в пользовательские трассировки конкретного изменения. Кроме того некоторые из этих radiosynthesizers позволяют оператору развивать и оптимизировать свои собственные протоколы синтеза в дополнение к покупке-продаже комплектов. В этом протоколе мы описать общую процедуру как ручной синтез трассирующими нового Питомца может быть автоматизирован на одном из этих radiosynthesizers и проверяются для производства Трейсеры клинико класса. В качестве примера, мы используем ELIXYS radiosynthesizer, гибкой основе кассеты радиохимии инструмент, который может поддерживать PET трассирующими усилия в области развития, а также обычные клинические зонд производства на той же системе, производить [¹⁸F] ([Clofarabine ¹⁸ F] CFA), ПЭТ трассировщик для измерения в vivo активности фермента Дезоксицитидин киназы (ДВК). Перевод ручной синтез предполагает разрушение синтетической протокол в основных радиохимии процессы, которые затем преобразуются в интуитивно химии «группы операций» синтезатора программное обеспечение поддерживает. Эти операции могут затем быстро быть преобразован в программе автоматизированного синтеза собирая их с помощью drag-and-drop интерфейс. После основных испытаний, синтеза и очистки процедура может потребоваться оптимизация для достижения желаемой доходности и чистоты. После того, как достичь желаемой производительности, проверки синтеза проводится для определения его пригодности для производства радиоиндикаторных для клинического использования.

Введение

Расширяющийся спектр биологических показателей может динамически визуализируется в жизни предметы через молекулярной визуализации модальности ПС. PET обеспечивает в vivo анализы конкретных биологических, биохимических и фармакологические процессов с помощью конкретных radiotracers (молекул, помечены позитронно излучающих радионуклидов), которые вводят в теме до визуализации¹. Более широкое использование ПЭТ изучить широкий спектр этих процессов в фундаментальной науке и клинических исследований^2,3,4и открытие, развития и клинического использования наркотиков в стационар^{5, 6}, ведет к растущим спросом на различных radiotracers^7,8. Чтобы избежать радиационного облучения в radiochemist и обеспечить воспроизводимое производство этих недолго Трейсеры, они обычно производятся с использованием автоматизированных radiosynthesizer, находившегося в ячейке «горячие». Последние radiosynthesizers использовать одноразовые кассета/комплект архитектуру для упрощения задачи соблюдения клинико класса производства также обеспечивая гибкость подготовить несколько типов radiotracers просто путем замены кассет⁹ . Однако в ранних клинических стадиях, есть обычно не коммерчески доступные кассеты/комплекты для выполнения автоматизированных radiosynthesis; Следовательно PET наркотиков производственные мощности борьба для настройки системы для реализации возможностей производства трассирующими цГМФ класса в подходящие сроки и по разумной цене. Таким образом были разработаны radiosynthesizers, которые сочетают кассеты/комплект архитектуры с возможностями для содействия развитию и оптимизации трассировщиков.

ELIXYS FLEX/CHEM (ELIXYS) является примером гибких основанных на кассету radiosynthesizer с широким реагента, растворитель и реакции температуры совместимости¹⁰. Он имеет три реакции сосудов и использует механизм роботов для динамически настроить путь жидкости как предусмотрено Протоколом любого конкретного синтез¹¹. Синтезатор программное обеспечение позволяет создавать синтез программ (последовательностей) для различных трассировщиков, перетаскивая и снижается Операций , таких как Ловушка изотоп, Элюировать изотоп, Добавить реагента, реагировать, и выпарить¹². Каждая единица операция имеет целый ряд программируемые параметры, доступные для оператора, например Длительность, температурыили инертного газа вождение давление (давление). Понимание характера каждой операции подразделение, ручной синтез могут быть легко переведены на последовательность операций и затем быть изменены во время оптимизации протокола¹³. В сочетании с модулем ELIXYS чистая/формы комплексной системы можно также выполнить автоматизированной очистки и формулирование PET tracer. С помощью этой radiosynthesizer, мы уже ранее сообщали автоматизированного синтеза 24 различных ¹⁸F-меченых Трейсеры и протезно группы^11,14,,1516, как а также автоматизированного ферментативного radiofluorination биомолекул¹⁷, просто изменив реагентов и не конфигурация системы. Другие показали автоматизированного синтеза [¹⁸F] RO6958948 для визуализации Тау нейрофибриллярных связок¹⁸, Автоматизированный синтез протезно группы [¹⁸F] F-Py-TFP с последующей маркировки пептиды¹⁹ и автоматизированный синтез [¹⁸F] AM580 для визуализации фосфодиэстеразы 10А (PDE10A)²⁰. Кроме того, несколько групп показали производства Трейсеры подходит для клинического применения, включая 4-[¹⁸F] Fluorobenzyl-triphenylphosphonium ([¹⁸F] FBnTP) для визуализации митохондриальной мембраны потенциал²¹, [ ¹⁸ DCFPyL F] для изображений мембраны простат специфического антигена (КСМК)²², и [¹⁸F] THK-5351 для изображений Тау²³.

В этой статье, мы используем наш опыт с [¹⁸F] CFA, чтобы проиллюстрировать, как ручной radiosynthetic процедура может быть прямо и быстро переведен на автоматизированный синтез подходит для обычного производства после руководящих cGMP. Трассировщик [¹⁸F] CFA была разработана для отображения активности ДВК. Ручной radiosynthesis [¹⁸F] CFA первоначально был охарактеризован Шу и др. ²⁴ как процедура, с помощью двух реакции сосудов, промежуточные кремнезема картридж очистки и окончательный ВЭЖХ шаг (см. Дополнительные материалы, раздел 1 для подробной информации). Последние в пробирке и доклинические исследования показали исключительные специфика этого трассировщика в ДВК, и первый в человека исследования показали благоприятные накопление²⁵. Есть непосредственный интерес в более широких масштабах клинические исследования для подтверждения чувствительность [¹⁸F] CFA PET вариации в ДВК деятельности и долгосрочного интереса к потенциальным клинического применения этого трассировщика²⁶. Это может быть полезным biomarker для терапии, которые вызывают активации Т-клеток, вызвать повреждение ДНК или полагаться на ДВК зависимых нуклеозидный аналог prodrugs. В частности, [¹⁸F] CFA может включить стратификация больных для потенциальной реакции на лечение с Clofarabine. [¹⁸F] CFA может также содействовать изучению и развитию ДВК ингибиторов, которые продвигаются к клинических испытаний. Поскольку этот трассировщик синтезирована традиционно вручную, продвижения все эти исследования требует надежной, Автоматизированный синтез [¹⁸F] CFA подходит для клинического использования.

Хотя мы сообщалось ранее автоматизированного синтеза [¹⁸F] CFA для доклинических исследований¹⁶, этот протокол основан на эти усилия и описывает дополнительные изменения, необходимые для клинического производства этого трассировщика, включая интеграцию полностью автоматизированной очистки и разработке, протокол проверки и контроля качества. Общие процедуры, описанные здесь, не ограничиваются разработки автоматизированных и клинически подходит синтез [¹⁸F] CFA, но может быть обобщена простым способом разработки автоматизированного синтеза подходит для клинического использования других radiotracers помечены фтора-18.

протокол

1. Общая процедура для автоматизации и проверки Radiosynthesis протокола для клинического производства

1. Анализ приемлемости ручной синтез схемы для клинического производства
   1. Выполните анализ рисков загрязнения продукта с любых нежелательных остаточных химических веществ.
      1. Избегайте класса 1 растворители например, бензол и заменить их соответствующих альтернативных растворителей (класса 2 или класса 3).
      2. Избегайте химических веществ, которые будет трудно обнаружить в окончательной формулировки как потенциальные остаточные примеси.
      3. Выберите только химических веществ, которые являются коммерчески доступных в высокой чистоты (USP или Ph.Eur. класс желаемого) и предоставляются с сертификатом анализа.
   2. Уточните схему синтеза, если любых нежелательных химикатов или растворителей обнаруживаются путем анализа рисков и повторите раздел 1.1 до тех пор, пока никто не остаются.
2. Автоматизировать протокол синтеза
   1. Если уже создан и загружены онлайн хранилище автоматизированных протокол для трассировки, используя же синтезатор, Скачайте копию программы синтеза.
   2. Если программа автоматизированного синтеза уже не существует, создайте его.
      1. С помощью бумаги и ручки, разделить этапы ручной синтеза (например, сушка/активация [¹⁸F] фторид, Отопление для облегчения радиохимической реакции, выполняя шаг очищение и т.д.). Дальнейшего сломать этапы в дискретные, основных процессов, которые требуются. Например, схема синтеза [¹⁸F] CFA показано на рисунке 1, выявление высокоуровневых шагов показан на рисунке 2Aи разбивка процессы показано на рисунке 2B.
      2. С помощью бумаги и ручки, карта каждого процесса в отдельных подразделений операций, предоставляемых синтезатора программного обеспечения. Например, анализ сопоставления основных процессов в синтезе [¹⁸F] CFA подходит блок операций в синтезатор программного обеспечения¹³ показан на рисунке 2 c.
      3. С помощью интерфейса программирования radiosynthesizer, создайте пустую программу и добавить каждый из указанных операций в последовательности, нажав на кнопку меню (вверху слева) и выбора последовательностии выбрав новый Последовательность кнопку. Для каждой единицы операции, идентифицированную на шаге 1.2.2.2 Перетащите блок операции из доступных операций диафильма и нажмите кнопку или введите заполнить нужное значение каждого параметра единица операции. На рисунке 3 показан пример интерфейса, когда все операции синтезировать [¹⁸F] были заселены CFA, и пользователь выбрал первый РЕАГИРУЮТ блок операции для редактирования значений параметров. Окончательный сводный доклад программы для [¹⁸F] CFA описан в Дополнительный материал, Таблицы S1 и S2.
   3. Проверьте программу синтеза.
      1. Выполните пробный прогон. Установить и запустить программу как шаги 2.1-2.3, используя все реагенты и растворителей помимо радионуклидов (например, [¹⁸F] фторид) для проверки ожидаемого поведения.
      2. При необходимости измените значения параметров операции подразделение в программе (например, время или вождение давление полностью передать реагента, время и температуры для испарения растворителя до желаемого уровня и т.д.) и выполните повторное тестирование. Чтобы настроить значения параметров, во-первых, вернуться в режим редактирования , выбрав в главном меню (вверху слева) последовательностей и выберите созданную программу. Далее нажмите на нужный блок операции в представлении диафильма (внизу экрана), перейдите на нужный параметр и выберите или введите новое значение.
   4. Выполнение теста низкой активности (< 370 MBq) для оценки программы.
      1. Оптимизировать автоматизированного синтеза, регулируя значения параметров для повышения урожайности, синтез время, повторяемость, и любого другого желаемого измеримые результаты.
3. Разработка анализа процедуры контроля качества (QC)
   1. Используя ссылку нерадиоактивные конечного продукта и образцы потенциальных химических примесей, развивать аналитические радио ВЭЖХ и/или радио тонкий слой хроматографии (Радио TLC) метод с достаточное разделение видов для определения химическая чистота, Молярная деятельность, радиохимических чистоты и радиохимических личность. Проверка аналитические методы для повторяемости и линейность и определить пределы обнаружения и количественного определения.
   2. Аналогичным образом разрабатывать и проверять газохроматографическим методом анализа летучих примесей (например, остаточное количество растворителей, которые используются во время синтеза).
   3. Разработка и проверка аналитических анализов, которые позволяют обнаружения и количественного определения других возможных примесей (например, Криптанды 222 через стандартные цвета пятно тест).
   4. Используйте стандартные процедуры для определения стерильности, рН, radionuclidic личность, radionuclidic чистоты, концентрация радиоактивности, объем продукции и эндотоксинов уровнях.
4. Выполнять проверку синтеза
   1. Создание стандартных оперативных процедур (СОП) для синтеза и КК процедуры тестирования и интеграции материалов и оборудования системы слежения, совместимый с текущей хорошо производства требованиям практики (cGMP).
   2. Проверка процедуры синтеза, которые через три независимых подряд производство и работает на тех же уровнях радиоактивности, предназначенную для клинического производства после SOPs. Документ синтеза производительность и результаты тестирования КК.
   3. Все запуски подряд проверки должны пройти заранее установленные пределы КК. Если проверка завершается неудачно, повторите процесс всей проверки после надлежащего рассмотрения причину сбоя.

2. Пример: Автоматизированный синтез [¹⁸F] CFA для клинического использования

1. Подготовка radiosynthesizer
   1. Мощность на radiosynthesizer.
   2. Обеспечить подачу инертного газа включена с достаточным давлением и что необходимые клапаны открыты, так что radiosynthesizer подключен к подачу газа.
   3. Установить новые одноразовые кассеты в реакторе #1 и #2 позиции и вставьте реакционные сосуды, содержащие магнитные перемешать баров. Убедитесь, что каждая кассета передачи погружная труба указал прямо вниз.
   4. Подготовка реагента флаконов и установить их в кассеты согласно схеме на рисунке 4.
   5. Установить пустой [¹⁸O] H₂O восстановления флакон в положении W1 кассета # 1.
   6. Активировать четвертичных methylammonium (QMA) картриджа первая передача 12 мл раствора₃ KHCO 1 М через него, следуют 12 мл деионизованной воды. Условие кремнезема Сен-Пак картриджа, передав 5 мл этилацетата через него.
   7. Подключите картриджи и сделать все соединения труб кассеты, как показано на рисунке 5А. Убедитесь, что не кассеты труб (включая неиспользуемых труб) висит в интерьере, где она может помешать с роботизированной движениями.
   8. Соедините с [¹⁸F] фторид источник из циклотрон линии ввода фторид [¹⁸F] на кассету #1.
   9. Убедитесь, что контейнер для отходов является пустым. Линии место отходов от очистки/Разработка подсистемы в контейнер для отходов (т.е., пример цикла 1 отходов линии, ВЭЖХ подсистема отходов линии и линии отходов насоса шприца).
   10. Подключите входной линии ВЭЖХ. Подвижная фаза ВЭЖХ место ввода линия «А» в контейнере 25 мм аммония ацетат и ВЭЖХ подвижная фаза ввода линии «B» в контейнере EtOH.
   11. Сбалансировать очистки/Разработка подсистемы и ВЭЖХ столбец.
       1. Откройте страницу управления для очистки/разработки модуля в программном обеспечении ВЭЖХ , выбрав в главном меню (вверху слева). По умолчанию на вкладке Очистка уже будет выбрана. (Эта страница показана на рис. 6).
       2. Установите скорость потока до 5,0 мл/мин на определенный состав растворителей и выбрать какие позиция столбца, столбец очистки установлен в. Включите насос ВЭЖХ в режиме Изократические для по крайней мере 10 мин.
       3. Промойте линии продуктов и все фракции коллекции линии с мобильных фазы, каждая за 1 мин.
       4. Промойте каждого цикла выборки ВЭЖХ и ВЭЖХ пример цикла передачи трубки с 10 мл мобильных фазы, с помощью шприца.
   12. Подключите очистки/Разработка подсистемы шприц насос входных линий. Использование концентрированный хлорид натрия (90 мг/мл) для Elute линии и 0,9% физиологического раствора для воссоздания линии.
   13. Премьер разработке подсистемы.
       1. Перейдите на вкладку Разработка очистки/разработки элемента управления страницы.
       2. Премьер концентрированный хлорид натрия (90 мг/мл), выберите закладку Elute пресс инициализации для инициализации шприцевой насос. Отказаться от 5 мл.
       3. Премьер 0,9% физиологического раствора, выберите восстановить вкладку обойтись 5 мл.
   14. Подключение линии продукта и конечного продукта от передней части очистки/Разработка подсистемы в T-связи. Соедините выход T-подключения к фильтру стерильные (0.22 мкм), который, в свою очередь, подключен к конечного продукта стерильный флакон. Вставьте иглу вентиляционные с фильтром стерильные headspace флаконе конечного продукта. Фотография настройке окончательной системы показано на рисунке 5B.
   15. Добавьте сухой лед и EtOH или метанола в холодную ловушку.
2. Запустите программу синтеза
   1. Перейти к списку программ, выбрав последовательности из кнопки главного меню (вверху слева). Выберите [¹⁸F] программы CFA и запустите программу, нажав на кнопку Run .
   2. Тщательно пройти через каждый элемент до выполнения контрольного перечня и отмечайте их как они будут завершены. На рисунке 7показана часть экрана предварительного выполнения контрольного списка.
   3. Нажмите продолжить , чтобы убедиться, что установка завершена и вызвать автоматизированного синтеза начать.
      1. При желании, мониторинг синтеза в режиме реального времени через визуальную обратную связь (реактор камеры), датчиков (например, температура, давление, вакуум, чтение излучения, и т.д.) и таймер. Представитель скриншот показан на рисунке 8.
      2. Во время операции очистки блока выберите продукт , когда пик продукт начал появляться на Хроматограмма детектор излучения. Представитель скриншот в ходе этой операции подразделение (содержащий Хроматограмма УФ детектор и детектор излучения выход) показано на рисунке 9.
      3. После того, как пик Хроматограмма детектор излучения вернулся к базовой линии, выберите отходов отвлечь пути потока подсистемы ВЭЖХ в контейнер для отходов.
3. Установка и запуск программы разработки
   1. Из списка программ (экранпоследовательности ), откройте [¹⁸F] формулировка CFA программы.
   2. Отрегулируйте параметры операции группы разработки.
      1. Расчет объема собранного продукта дроби (_частьV), основанный на скорости потока насос ВЭЖХ и продолжительность часть коллекции.
      2. Рассчитайте объем дополнительных натрия хлорида (90 мг/мл), необходимых для достижения isotonicity и рассчитать количество дополнительных физиологического раствора, необходимых для разбавления концентрацию EtOH ниже 10%.
      3. Измените программу с этими значениями. Объем натрия хлорида (90 мг/мл) вводится для Elute шаг и для воссоздания шаг вводится объем физиологического раствора. (Расчеты описаны в Дополнительный материал, Рисунок S2).
      4. Сохраните программу.
   3. Запустите программу. Система будет разбавить собранных очищенный продукт дроби с хлорид натрия и физиологического раствора для обеспечения isotonicity разработки и доставить его через фильтр для стерилизации в ампулу стерильного продукта.
4. Сбор сформулировал [¹⁸F] CFA для контроля качества и отгрузки
   1. Удалите продукт CFA сформулировал [¹⁸F] из горячей клетки.
   2. Использование стерильных рабочих методов, снять двух выборок (300 мкл) выполнять тесты контроля качества.
   3. Используйте первый образец для проверки стерильности окончательную формулировку путем прививки жидкости thioglycolate СМИ и tryptic соевый бульон для 14 d без соблюдения какого-либо роста.
   4. Используйте второй образец для выполнения контроля качества в соответствии с процедурами, разработанными в шаге 1.3. Ниже приводится описание процедур, установленных на UCLA Ahmanson биомедицинских циклотрон объекте в соответствии с Фармакопеи США.
      1. Оцените внешний вид путем визуального осмотра.
      2. Оценка рН с индикаторной бумагой.
      3. Оцените содержание бактериальных эндотоксинов с помощью кинетических хромогенных бактериальных эндотоксинов тест (BET).
      4. Оцените радиохимической личность с аналитической радио ВЭЖХ, проверяя совместное Элюирующий радиоактивных образца и составные нерадиоактивные ссылку.
      5. Оцените радиохимической чистоты с аналитической радио ВЭЖХ, сравнивая площадь под кривой (AUC) радиоактивных примесей в гамма детектор хроматограммы с АУК, соответствующий желаемого продукта.
      6. Оценка химической чистоты с аналитической ВЭЖХ путем определения АУК в УФ детектор Хроматограмма всех УФ активных примесей.
      7. Оценить Молярная активности и перевозчик массы с аналитической радио ВЭЖХ, определяя АУК, соответствующий необходимый продукт в УФ детектор хроматограммы.
      8. Оцените half-life зонда измерения свою деятельность на двух разных timepoints и распада кривой.
      9. Оцените остаточное содержание растворителей формулировки методом газовой хроматографии.
      10. Оценка энергии радионуклидов с помощью гамма-спектрометр.
      11. Оцените Криптанды 222 содержимое с помощью TLC-тестов на основе пятно.
   5. Если все тесты проходят, отпустите зонд формулировка для отгрузки к месту клинических изображений.
5. После запуска системы и завершения работы
   1. Промойте столбце очистки ВЭЖХ и все трубы используются для сбора продукта с 70% (v/v) EtOH в воде. Это должно быть сделано с странице PURE/формы управления, подобный шаг 2.1.12.
   2. Завершите работу radiosynthesizer через кнопку питания на программное обеспечение. Всплывающее окно будет указано, когда питание системы может быть отключена.
   3. Выключите снабжения сжатым воздухом и инертного газа, закрытие соответствующих запорной арматуры.
   4. Подождите некоторое время остаточная радиоактивность в горячую камеру к гниению (обычно на ночь).
6. Очистить radiosynthesizer
   1. Удалить и утилизировать все кассеты, картриджи, реактор флаконов и реагента флаконы используются во время синтеза.
   2. Вылейте содержимое холодную ловушку.
   3. Чистота жидкости путей очищения подсистемы.
      1. Откройте существующую программу очистки или создайте новую программу, которая содержит одну операцию очистки блок очистки режиме (то есть, с чистой флажок). Смотрите Дополнительные материалы, S9 рисунок в качестве примера.
      2. На странице Настройка параметров выберите столбец, который был использован для очищения и линии ввода подвижная фаза ВЭЖХ, который подключен к бутылке, содержащие 70% EtOH в воде. Программа скорость потока 2 мл/мин, полоща продолжительность для каждой инъекции цикла 5 мин, полоща длительность для каждого продукта и часть вывода 30 s. Выберите Сухой линии и программа продолжительностью 30 s.
      3. Поместите все фракции линейных выходов в большой контейнер для отходов.
      4. Запустите программу.
      5. После завершения Опорожните контейнер для отходов.
   4. Чистота жидкости путей разработки подсистемы.
      1. Откройте существующую программу или создать новую программу, которая содержит одну операцию разработки блока очистки режиме (то есть, с чистой , флажок на вкладке Clean ). Смотрите Дополнительные материалы, Рисунок S10 для примера.
      2. Заполните резервуар чистой разрежения (в передней части очистки/Разработка подсистемы) с EtOH 100 мл.
      3. Место очистки/Разработка подсистемы линии ввода Elute в EtOH водохранилище (содержащие > 50 мл EtOH).
      4. Место промыть и воссоздания входных линий в контейнер для отходов вместе с линией вывода конечного продукта.
      5. Запустите программу.
      6. После завершения Опорожните контейнер для отходов.

Результаты

Метод для автоматизации производства [¹⁸F] CFA была разработана и три проверки пакетов были синтезированы. Синтеза, очистки и формулирование [¹⁸F] CFA была достигнута в 90 ± 5 мин (n = 3) и не исправлены распада радиохимической урожайность составила 8,0 ± 1,4% (n = 3). Доходность деятельности трех запусков были 3.24 GBq, 2,83 GBq и 3.12 ГБК, начиная от 34.3 ГБК, 41,8 GBq и 41.1 ГБк, соответственно. Полученные [¹⁸F] CFA формулировки прошел все тесты контроля качества (Таблица 1). В настоящее время автоматизированный протокол используется для производства клинико класс [¹⁸F] CFA для поддержки клинических испытаний.

Контроль качества данных	Проверка запуска 1	Проверка запуска 2	Проверка запуска 3
[требование для «Pass»]
Внешний вид	Перевал	Перевал	Перевал
[прозрачный, бесцветный, свободный твердых частиц]
Концентрация радиоактивности в EOS	213 MBq/мл	210 MBq/мл	180 MBq/мл
[≤ 740 EOS @ MBq/мл]
pH	6	5.8	6
[5,0 – 8,0]
Период полураспада	115 мин	108 мин	112 мин
[105-115 мин.]
Радиохимический чистоты	99%	99%	99%
[> 95%]
Радиохимический идентичности время относительного сохранения (РРТ)	1.01	1.01	1.01
[1.00 < RRT < 1.10]
Молярная активность	314 ГБК/мкмоль	> 370 ГБК/мкмоль	> 370 ГБК/мкмоль
[≥ 3,7 мкмоль/ГБк]
Масса общая перевозчика в конечный продукт	3.1 мкг	< 1 мкг	< 1 мкг
[≤ 50 мкг/доза]
Масса всего примесей в конечном продукте	ND	ND	ND
[≤ 1 мкг / доза]
Максимальный допустимый инъекции объем на основе общего перевозчика массового ≤ 50 мкг/доза и всего примеси массовой ≤ 1 мкг/доза	Весь пакет	Весь пакет	Весь пакет
Остаточное содержание EtOH компанией GC	8,90%	9,50%	9.60%
[≤ 10%]
Остаточное содержание EtOAc компанией GC	< 1 ppm	< 1 ppm	< 1 ppm
[≤ 5000 ppm]
Остаточное содержание MeCN компанией GC	< 1 ppm	< 1 ppm	< 1 ppm
[≤ 410 ppm]
Остаточная K222 цвета пятно испытания	Перевал	Перевал	Перевал
[< 50 мкг/мл]
Проверка целостности мембраны фильтра	Перевал	Перевал	Перевал
[пузырь точки ≥ 50 psi]
Бактериальные эндотоксины	Перевал	Перевал	Перевал
[≤ 175 ЕС/партии]
Radionuclidic чистоты методом спектроскопии гамма	Перевал	Перевал	Перевал
[> 99,5%]
Бесплодие	Перевал	Перевал	Перевал
[требованиям USP < 71 >]

Таблица 1: контроль качества (КК) тестовых данных резюме три проверки пакетов. ПСЗ = конец бомбардировка; EOS = конец синтеза; ND = не обнаружено.

Рисунок 1: схема radiosynthesis [¹⁸F] CFA. MMT = Monomethoxytrityl. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: перевод ручной синтеза на автоматизированной последовательности операций. (A) Эта группа дает обзор высокого уровня шагов в ручной синтез [¹⁸F] CFA. (B) Эта группа показывает основные процедуры, необходимые для выполнения каждого из шагов, высокого уровня. (C) Radiosynthesizer конкретных операций используется для выполнения основных процедур отображаются в виде карты. Каждая единица операция имеет свой собственный набор значений параметров (показано как подчеркнутый) которые настраиваются с помощью программного обеспечения. Обозначение «R1» и «R2» свидетельствуют о реакции сосудов #1 и #2, соответственно. Реагентов, соответствующий реагент номера указаны на рисунке 4. Серия операций сохраняется как последовательность и выполняется программное обеспечение для выполнения автоматизированного синтеза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рис: скриншот интерфейса программного обеспечения radiosynthesizer (ELIXYS) для создания программы синтеза. Унитарные операции помещаются в нужном порядке в Диафильм с помощью drag-and-drop интерфейс. На этом снимке экрана реагируют операции блок выбран, и его значения редактируемых параметров приведены в основной части экрана. В этом примере фторирование реакция будет осуществляться в реакционный сосуд #1 (герметичный) при 120 ° С за 10 мин с активного перемешивания. Судно будет охлаждаться до 35 ° C, после того, как прошло время реакции. Подробная информация о значения параметров, которые могут быть запрограммированы для других операций приводится в Дополнительном материале, раздел 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рис: скриншот экрана конфигурации реагент. Для последовательности синтеза CFA [¹⁸F] все реагенты загружаются в одноразовые кассета #1, который отображается выделенное в области Выбор компонентов. Для синтеза CFA [¹⁸F], описанные здесь элюента 1,0 мг K₂CO₃ + 5.0 мг K222 в 0,4 мл, H₂O/0.5 мл MeCN, предшественник — 6 мг CFA прекурсоров в 0,6 мл MeCN и ВЭЖХ Mobile фаза 85:15 v Ацетат аммония/v 25 мм: этанол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Установка Radiosynthesizer для синтеза [¹⁸F] CFA. (A) это схематическое изображение кассету жидкости путей, соединения к картриджи и подключение для передачи окончательного сырой продукт из модуля radiosynthesis в модуле очистки/разработки. (Оба модуля контролируются с помощью одного интерфейса компьютера и программного обеспечения). (B) это фотография radiosynthesizer внутри горячей камере после подготовки для синтеза CFA [¹⁸F]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рис: скриншот интерфейса управления модуля очистки/разработки. Этот экран осуществляется оператором вручную управлять ВЭЖХ и разработке подсистемы во время установки синтеза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: экран предварительного хода контрольный. Оператор вводит серийный номер кассет, установленные в системе и должны проверить каждый элемент для обеспечения системы должным образом настроены и подготовлены для синтеза. Помимо этих разделов, оператор также предлагается ввести имя и описание синтеза запуска (раздел 1) и много номеров для всех замотают (раздел 2) и попросил проверить все реактор видео каналы работают правильно (раздел 6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8: Скриншот radiosynthesizer программного обеспечения во время выполнения последовательности синтеза CFA [¹⁸F]. Программное обеспечение отображает порядок операций в районе Диафильм. Завершенные операции greyed вне и выделены в белом, текущей операции будет выделена серым цветом и предстоящих операций указаны в темно-серый. Центр области экрана показывает статус активного юнита операции, включая выполняется какой подкоманды, а также текущее состояние системы (реактор видео-каналы и данные датчиков). Это особенно реагируют блок операция является реакция фторирования. В районе Temp текущую температуру реактора отображается рядом с целевой (программируемый) температуры. Ниже, области деятельности отображает значения датчика радиации из трех датчиков, связанных с шагом реакции. Наконец видео-канал на левой стороне показывает живой вид реактора флакона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9: Скриншот radiosynthesizer пользовательского интерфейса во время выполнения операции очистки подразделение во время синтеза [¹⁸F] CFA. УФ детектор и детектор излучения выходы модуля очистки/разработки отображаются на графе Центральной в режиме реального времени. Дополнительные отзывы от детекторов и ВЭЖХ насос показаны на правой стороне экрана. Оператор собирает пик продукта, временно выбора продукта , когда пик начинает появляться и переключение отходов , после того, как видел полный пик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Этот протокол определяет основные шаги, которые должны быть приняты при автоматизации ручной синтеза протокол для достижения производства клинической класс трассирующими формулировки. Весь цикл разработки, включая контроль качества развития, подтверждается радиоиндикаторных [¹⁸F] CFA (для изображения ДВК активности). Особое внимание уделялось изменения автоматизированного синтеза для обеспечения трассировщик пригодность для клинического использования. Синтез влечет за собой основные процессы активации [¹⁸F] фтор, radiofluorination прекурсоров молекулы, промежуточный патрон очистки, удаления защиты группы и полу препаративные ВЭЖХ очищения и разработки для инъекций. Эти основные процессы включают в себя Стандартный репертуар, который является достаточным для синтеза подавляющего большинства Трейсеры ¹⁸F-меченых животных.

При проектировании синтеза, выбор реагентов и их качества имеет особое значение для клинического использования. Обеспечение правильного программирования и надлежащего соединения, выполняя макет синтеза (только растворителей) необходимо устранить непредвиденные ошибки, когда синтез проводится с радиоактивностью. Последующих синтеза оптимизации (растворители, томов, суммы, температуры, времени реакции и условия очистки) зависят от конкретных PET tracer в развитии. В ходе этих экспериментов особое внимание следует светил на химических и радиохимических чистоты конечного продукта, который может быть достигнут, поскольку они должны отвечать строгим требованиям для клинического использования. Синтез, который надежно производит чистый продукт ниже, но достаточной активности урожайности обычно предпочтительнее более высокоурожайные процесс, который имеет риск потерпеть спорадически. После того, как синтез должным образом оптимизированы, окончательный процесс должен пройти проверочные тесты (нормативным требованием) для обеспечения клинического пригодности. Проверяемое синтеза метод может затем использоваться для производства ПЭТ трассировщик для клинического использования. Когда обобщения трассирующими PET согласно одобренного метода, стандартные оперативные процедуры следует тщательно. Для обеспечения соответствия, программное обеспечение запрограммирован иметь оператор подтвердить завершение ключевых шагов через предварительно выполнения контрольного списка после нажатия на Запуск для запуска синтеза. В то время как система будет выполнять синтеза в автоматическом режиме, очистка шаг требует ручного вмешательства. Оператор должен, таким образом, пристально наблюдать хроматографического экрана во время выполнения очистки ВЭЖХ и вручную вводить в режиме реального времени, когда для запуска и остановки сбора часть продукта.

В рамках нашей автоматизации и оптимизации усилий для синтеза CFA [¹⁸F] мы упорядочили полу препаративный метод ВЭЖХ очищения продукт смеси с помощью инъекционные жидкостной системы, состоящей из раствора ацетата аммония и EtOH ; Наш предыдущий метод требуется дополнительный шаг для обмена растворителя после очистки¹⁶. Последующие разработки процесса, таким образом, только необходимо уменьшить содержание EtOH собираемой фракции разрешенные уровни и обеспечить ее isotonicity, оба из которых может быть достигнуто путем разбавления. На этапе разработки проводилось с использованием второй программы, состоящей из одной операции группы разработки позволяет переменной тома дополнений растворов NaCl очищенный продукт фракция через разработку модуля учета для переменной объем полученной после очистки ВЭЖХ. Если объем доли собранного продукта был установлен вместо быть постоянным, операция блок разработки могут быть включены в программу основных синтеза, избегая необходимости независимой программой. Альтернативный подход к избежать ручного вмешательства будет использовать полную функциональность модуля разработки (например, разбавить очищенный трассировщик с водой, ловушки на картридж твердофазный извлечения C18, мыть, элюировать с фиксированным объемом EtOH и наконец, разбавить его с фиксированным объемом физиологического раствора).

Техника, представленные здесь для автоматизации и проверка синтез протокол для клинического использования предназначен быть довольно общий характер. Посредством выбора radiosynthesizer (ELIXYS) широкий спектр синтезы можно автоматизирован и проверены. Это включает в себя комплекс 3-горшок синтезов, или синтезы с участием высоких температур летучих растворителей. Оптимизация синтез может достигаться путем изменения параметров, программного обеспечения. Синтезатор имеет возможности контролировать влияние изменений, таких как позиционирование реакции сосудов для удаления образцов для радио TLC или радио ВЭЖХ анализа. Однако, без модификации системы, система в настоящее время не позволяют для обработки тома очень низкой реагента (~ 5-20 мкл), промежуточный продукт перегонки или обработки [¹⁸F] Альф, ⁶⁸га, или другие radiometals. Если ручной синтеза чтобы автоматизировать содержит такие шаги, и они не могут быть обойдены, автоматизации и проверки с другой radiosynthesizer платформа может быть целесообразной.

Хотя эта работа была сосредоточена на разработке протокола для автоматизированного производства [¹⁸F] CFA для клинического применения, синтез многих других Трейсеры PET может быть автоматизированы в пригодном для клинического производства, следуя той же логике и методы. После метода, представленные здесь, мы адаптировали Автоматизированный синтез 9-(4-[¹⁸F] фтор - 3-[гидроксиметил] бутил) гуанин ([¹⁸F] FHBG) и протестированы для клинического использования. Пользователь установил протоколы могут быть загружены и загружаются из SOFIE зонд сети, веб-портал для синтеза программы обмена и сопроводительной документации среди различных radiopharmacy сайты²⁷. Это может избежать дублирования усилий в рамках сообщества и способствовать многоцентровые клинические исследования с участием PET изображений.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ELIXYS FLEX/CHEM	Sofie (Culver City, CA, USA)	1010001	Radiosynthesizer
Radiosynthesizer cassette	Sofie (Culver City, CA, USA)	1861030400	Cassette for ELIXYS FLEX/CHEM
ELIXYS PURE/FORM	Sofie (Culver City, CA, USA)	1510001	Radiosynthesizer purification module
[O-18]H2O	IBA RadioPharma Solutions (Reston, VA, USA)	IBA.SP.065	>90% isotopic purity
[F-18]fluoride in [O-18]H2O	UCLA	N/A	Produced in a cyclotron (RDS-112; Siemens; Knoxville, TN, USA) by the (p,n) reaction of [O-18]H2O. Bombardment at 11 MeV using a 1 mL tantalum target with havar foil.
Deionized water	UCLA	N/A	Purified to 18 MΩ and passed through 0.1 µm filter
Acetonitrile (MeCN)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	271004	Anhydrous, 99.8%
Ethanol (EtOH)	Decon Laboratories, Inc. (King of Prussia, PA, USA)	2701	Anhydrous, 200 proof
Sodium hydroxide (NaOH) solution	Merck (Burlington, MA, USA)	1.09137.1000	1M solution
Hydrochloric acid (HCl) solution	Fisher Chemical (Hampton, NH, USA)	SA48-500	1M solution
Ethyl acetate (EtAc)	Fisher Chemical (Hampton, NH, USA)	E195SK-4	HPLC grade
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Chemical (Hampton, NH, USA)	S-640-500	USP grade
Ammonium acetate	Fisher Chemical (Hampton, NH, USA)	A639-500	HPLC grade
Potassium carbonate (K2CO3)	Fisher Chemical (Hampton, NH, USA)	P-208-500	Certified ACS
CFA precursor	CalChem Synthesis (San Diego, CA, USA)	N/A	Custom synthesis
Cryptand 222 (K222; Kryptofix 2.2.2)	ABX Advanced Biochemical Compounds (Radeberg, Germany)	800.1000	>99%
Sodium chloride (NaCl) solution (saline)	Hospira (Lake Forest, IL, USA)	0409-4888-02	0.9%, for injection, USP grade
Silica cartridge	Waters (Milford, MA, USA)	WAT051900	Sep-pak Classic
Quaternary methylammonium (QMA) cartridge	Waters (Milford, MA, USA)	WAT023525	Sep-pak Light Plus
Sterile syringe filter (0.22 µm)	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	SLGSV255F	Millex-GV
Glass V-vial (5 mL)	Wheaton (Millville, NJ)	W986259NG	Used for reaction vessels
Septa	Wheaton (Millville, NJ)	224100-072	Used for reagent vials
Crimp cap	Wheaton (Millville, NJ)	224177-01	Used for reagent vials
Amber serum vial (2 mL)	Voigt (Lawrence, KS, USA)	62413P-2	Used for reagent vials
Magnetic stir bar	Fisher Scientific (Hampton, NH, USA)	14-513-65	Used for reaction vessels