JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол производить большое количество рекомбинантных РНК в Escherichia coli совместно выразить химерных РНК, содержащий РНК интерес к вироиды леску и завод лигаза тРНК. Основным продуктом является циркуляр молекула, которая облегчает очистки до однородности.

Аннотация

С ростом интереса к биологии РНК и использования молекул РНК в сложных биотехнологических приложений, методы производить большое количество рекомбинантных молекул РНК ограничены. Здесь мы описываем протокол производить большое количество рекомбинантных РНК в Escherichia coli на основе совместного выражения химерных молекулы, содержащий РНК интерес к вироиды леску и завод лигаза тРНК. Вироиды являются относительно небольшой, без кодирования, высоко в паре базы круговой РНК, которые являются инфекционные высших растений. Узел завод tRNA лигаза является ферментом, завербован вироиды, которые принадлежат к семейству Avsunviroidae, как баклажаны латентной вироиды (ELVd), выступить посредником РНК рецензий во время репликации вироиды. Хотя ELVd не реплицируется в E. coli, прекурсор ELVd эффективно транскрибируются РНК полимеразой E. coli и обработаны рибозимы встраиваемых молот в бактериальных клетках и результате мономеров circularized совместно выразили tRNA лигаза достижения замечательных концентрации. Включение РНК интерес в ELVd леса позволяет производство десятков миллиграмм рекомбинантного РНК за литр бактериальной культуры в регулярных лабораторных условиях. Основная часть продукта РНК круговые, особенность, которая облегчает очистки рекомбинантных РНК до виртуальных однородности. В этом протоколе взаимодополняющих ДНК — (cDNA кДНК) соответствует РНК интерес вставляется в определенной позиции ELVd cDNA в выражение плазмида, которая используется, вдоль плазмида выразить совместно баклажаны tRNA лигаза, чтобы преобразовать E. coli. Сопредседатель выражения обеих молекул под контролем сильных учредительный промоутеров приводит к производства большого количества рекомбинантных РНК. Рекомбинантных РНК могут быть извлечены из бактериальных клеток и отделены от основной части бактериальных RNAs воспользовавшись его округлости.

Введение

В отличие от ДНК и белков протоколы для простой, эффективной и рентабельной производства большого количества РНК не обильные. Однако исследования и промышленность спроса все большее количество этих биомолекул расследовать их уникальные биологические свойства1, или на работу в сложных биотехнологических применений, включая их использование в качестве весьма конкретной аптамеры 2, терапевтические3или селективного пестицидов4. In vitro транскрипция и химического синтеза для производства РНК обычно используются в научных исследованиях. Однако эти методы предусматривают важные ограничения, когда требуются большие объемы продукции. Логической альтернативой является использование механизма эндогенного транскрипции живых клеток, последовал процесс очистки отделить RNAs интерес от сотовой товарищей. Следуя этой стратегии, были разработаны методы для получения рекомбинантных молекул РНК в бактериальной клетки, такие как лаборатории дружественный Escherichia coli5 или морской фиолетовый фототрофных альфа proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. Большинство методов для получения рекомбинантных РНК бактерий полагаются на выражение собственного высокостабильных РНК леску, такие как tRNA или рРНК, в котором находится РНК интерес вставлен7. Это накладывает необходимость освобождения РНК интерес из химерных молекулы, если наличие дополнительных РНК является проблемой для нисходящие приложения8. Другая концепция в рекомбинантной биотехнологии РНК является производство рекомбинантных рибонуклеопротеида комплексов, которые могут быть желаемого продукта per se или используются в качестве защитной стратегии для повышения стабильности РНК интерес9, 10. Аналогично производство круговой РНК также было предложено как стратегии для создания более стабильных продуктов11.

Мы недавно разработали новый метод производить большое количество рекомбинантных РНК в E. coli , который участвует в трех вышеупомянутых концепций: вставки РНК интерес к высокостабильных круговой РНК леску и Сопредседатель выражение рекомбинантных РНК с взаимодействуя белками вероятно производить стабильный рибонуклеопротеида комплекс, который накапливается в замечательной количествах в бактериальных клетках12. В отличие от предыдущих разработок мы использовали РНК эшафот, совершенно чужды кишечной палочки, а именно вироиды. Вироиды представляют собой особый тип инфекционных агентов высших растений, которые составляются исключительно на относительно небольшой (246-401 nt) высоко в паре базы круговой РНК13. Интересно, что вироиды не кодирования РНК, и без помощи от их собственных белков, они способны выполнять сложные инфекционные циклы в зараженных хостов14. Эти циклы относятся репликация РНК-РНК в ядрах или хлоропласты, в зависимости от семьи вироиды —Pospiviroidae или Avsunviroidae, соответственно — движение через зараженные растения и уклонение разместить защитную реакцию. Вироиды должны быть занимала среди наиболее стабильных РНК в природе, будучи голый круговой РНК и того, чтобы выжить в условиях враждебной зараженных растительных клеток. Это свойство может сделать вироиды особенно подходит как подмости для стабилизации рекомбинантной РНК в биотехнологических подходов. Кроме того новый метод на основе совместного выражения вироиды леску с взаимодействующих растительного белка. Вироиды реплицировать через механизм подвижного круга, в котором хозяин ферменты набираются стимулировать различные этапы этого процесса. Особенно некоторые вироиды, в частности тех, которые принадлежат к семье Avsunviroidae15, содержат рибозимы, которые также участвуют в репликации. В зависимости от видов вироиды транскрипция вироиды РНК при посредничестве принимающей РНК-полимераза II или хлоропластной-кодировке РНК-полимеразы (НЭП). Вироиды РНК обработки, как представляется, быть катализатором узлом РНКазы III типа, хотя в вироиды с рибозимы олигомерных РНК интермедиаты самостоятельно прилепится во время репликации. Наконец результате вироиды мономеров являются circularized, в зависимости от семьи вироиды, принимающей ДНК лигаза 1 или хлоропластной изоформы tRNA лигаза16,17. Этот последний фермент участвует в перевязки Мономерных форм вироиды в семье Avsunviroidae, как баклажаны латентной вироиды (ELVd)18.

В ходе работы проанализировать последовательность и структурных требований ELVd определяют признание, баклажаны (Solanum melongena L.) tRNA лигаза, мы создали экспериментальной системы на основе совместного выражения обеих молекул в E. coli 19. Мы заметили, что больше чем единица ELVd стенограммы самостоятельно эффективно расщеплять в клетках E. coli через встроенный молот рибозимы и что результате вироиды мономеров с 5'-гидроксильные и 2', 3'-Фосфодиэфирная Термини эффективно circularized, совместно выразили баклажаны лигаза тРНК. Даже больше результирующий РНК круговой вироиды достигли неожиданные высокой концентрации в E. coli, превышающие эндогенного теорией12. Отсутствие посредников репликации указывает отсутствие усиления ELVd РНК-РНК в эти клетки бактерий. Интересно, что вставки гетерологичных РНК в определенной позиции вироиды молекулы имел умеренное воздействие на накопление круговой вироиды производные РНК-12. Эти замечания сделал нас себе метод производить большое количество рекомбинантных молекул РНК бактерий. В этом методе cDNAs соответствующий RNAs интерес вставляются в ELVd cDNA и результате химерных РНК выражается в E. coli через сильный учредительный промоутер. Для работы системы E. coli совместно должны быть преобразованы с плазмида выразить баклажаны лигаза тРНК. Стенограмма дольше чем блок ELVd производные обрабатывается рибозимы встраиваемых молот и результате мономеров с соответствующим Термини, признаются и circularized совместно выразили лигаза тРНК. Таким образом, в очень стабильные круговые эшафот, состоящий из вироиды циркуляр молекула вставляется РНК интерес. Этот рекомбинантных химерных РНК является наиболее вероятно далее стабилизировать внутри клеток E. coli путем формирования рибонуклеопротеида комплекса путем взаимодействия с тРНК лигаза. С помощью этого метода (см. Протокол ниже), были легко производится в количестве десятков миллиграмма на литр культуры е. coli в регулярных лабораторных условиях и очищен до однородности принимая аптамеры РНК, заколка РНК и других структурированных РНК преимущество округлости12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. плазмида строительство

  1. Усилить методом ПЦР (или обратной транскрипции ПЦР если начиная с шаблоном РНК) cDNA, соответствующий РНК с помощью грунтовки с 5' расширение чтобы позволить Ассамблее в выражение плазмиду интереса. Чтобы избежать нежелательных мутации, используйте высококачественный ДНК-полимеразы.
    1. Чтобы вставить cDNA в выражение плазмида, Гибсон Ассамблеи20, добавьте следующие 5' расширения праймеры PCR: вперед, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; обратный, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X представляет нуклеотидов гомологичных терминала концы РНК интерес.
    2. Инкубируйте 30 s на 98 ° C, а затем 30 циклов 10 s на 98 ° C, 30 сек при 55 ° C и 30 s при 72 ° C и окончательное расширение 10 мин при 72 ° C.
  2. Дайджест 100 нг плазмида pLELVd-BZB с 10 U энзима ограничения типа IIS Bpi я за 1 ч при 37 ° C в 20 мкл реакции в 0,5 мл трубку в буфере G (10 мм трис-HCl, pH 7.5, 10 мм MgCl2, 50 NaCl 0,1 мг/мл BSA).
    Примечание: Все плазмид доступны по запросу соответствующего автора. BPI Я эквивалентно Bbs я.
  3. Отдельные продукты PCR и пищеварение электрофорезом геля агарозы 1% в буфер TAE (40 мм трис, уксусная кислота, ЭДТА 1 мм, 20 мм pH 7.2). Пятно гель для 15 мин путем встряхивания в 200 мл 0,5 мкг/мл ethidium метила. Визуализировать ДНК с помощью УФ transilluminator и нарезать полосы, соответствующие усиливается cDNA и я переваривается плазмида Bpi (2046 bp), с помощью лезвием скальпеля.
    Примечание: BPI Я переваривания pLELVd-BZB также выпускает 528 bp продукт, соответствующий LacZ сине белых репортер.
  4. Элюировать ДНК из фрагментов геля, с использованием столбцов силикагель (гель kit восстановление ДНК в Таблице материалов) и количественного определения концентрации ДНК спектрофотометрический анализ.
  5. Настройка реакции Ассамблеи Гибсон, используя усиливается cDNA и переваривается плазмида. Используйте вывозимому Молярная избыток вставка против вектор20. Инкубировать 1 час при температуре 50 ° C и очистить продуктов реакции, с помощью столбца силикагель (ДНК чистой и концентратор kit в Таблице материалы).
  6. Используйте чистые продукты реакции Ассамблеи Гибсон на electroporate компетентным E. coli DH5α клетки. С помощью 1-мм электропорации кюветы, применяются следующие параметры: 1500 V и 5 г-жа инкубировать 1 ч при 37 ° C в супер оптимизированный бульон с catabolite репрессий (SOC; Триптон 20 г/Л, экстракт дрожжей 5 г/Л, 0,5 г/Л NaCl, 2,5 мм KCl, 10 MgCl2 глюкозы 20 мм, pH 7.0) жидкой среде и затем распространилась на Бертани Лурия (LB; Триптон 10 г/Л, 5 г/Л дрожжевой экстракт, 10 г/Л NaCl) агар (1,5%) плиты содержащий ампициллина 50 мкг/мл.
    1. Экран для колоний, соответствующий преобразованный E. coli клоны, которые вероятно включены вставки, 15 мин до обшивки electroporated клетки, распространение 30 мкл 50 мг/мл 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) в диметилформамиде. Инкубировать пластин на ночь при 37 ° C.
  7. Выбрать несколько белых колоний и расти на ночь при 37 ° C в жидких средах фунтов. Очищения плазмиды, используя алкалический комплекта (см. Таблицу материалы) и анализировать их размеры электрофорезом геля агарозы 1% в буфер TAE.
  8. Выберите наиболее вероятно рекомбинантных плазмид, основанные на электрофорезном миграции по сравнению с pLELVd-BZB управления. Подтвердить последовательность выбранных плазмиды путем sequencing используя праймеры 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' и 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' что фланг всего выражения кассету в pLELVd-BZB.
    Примечание: Помните, что эта плазмида содержит 528 bp polylinker с маркером LacZ, который заменяется cDNA интерес. Ограничения сопоставления может помочь выбрать право рекомбинантных плазмид.

2. РНК выражение

  1. Co-electroporate (см. условия в 1.6) выбранного E. coli штамм (E. coli BL21 или производная BL21) с pLELVd-BZB-производная, содержащий соответствующий РНК интерес и плазмида p15LtRnlSm совместно выразить cDNA Баклажаны tRNA лигаза. Используйте E. coli HT115(DE3), которому не хватает РНКазы III21, чтобы выразить с регионами длинные двуцепочечные РНК.
    Примечание: Оба РНК интерес и тРНК лигаза мРНК транскрибируются РНК полимеразой E. coli . Хотя присутствие этой lysogen не имеет вредных эффектов в штамм E. coli , требуется не DE3 lysogen для Экспресс T7 РНК-полимеразы.
  2. После инкубации 1 ч при 37 ° C в жидкой среде SOC тарелка electroporated бактерий в фунтов твердых среде, содержащей 50 мкг/мл Ампициллин и 34 хлорамфеникол мкг/мл. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  3. Выберите колонии и прививать 1 Л озадаченного колбу Эрленмейера с 250 мл жидкой среды потрясающий бульон (ТБ) (Триптон 12 г/Л, 24 г/Л дрожжевой экстракт, 0,4% глицерина, 0,17 М х2PO4и 0,72 М K2HPO4), содержащий ампициллина 50 мкг/мл и 34 хлорамфеникол мкг/мл. Проинкубируйте при 37 ° C с энергичной встряхивания на 180 оборотов в минуту (об/мин). Урожай бактерий между 12 и 16 часов после прививки культуры.

3. РНК извлечение и очистка

  1. Для аналитических целей Возьмите 2 мл аликвоты культуры в точках желаемое время и центрифуги в 14.000 x g на 2 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 50 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl, pH 8.0 и 1 мм ЭДТА), vortexing.
    1. Добавьте один объем (50 мкл) 1:1 (v/v) смесь фенола (насыщена водой и достижение равновесного уровня рН 8,0 с трис-HCl, рН 8.0) и хлороформе. Разбить ячейки путем энергичных vortexing и отдельные водные и органические фазы центрифугированием на 5 мин в 14.000 x g.
    2. Тщательно восстановления водной фазы (верхний), которые содержит всего бактериальных РНК.
      Примечание: Препараты могут храниться при температуре-20 ° C для последующего анализа.
  2. Для препаративных целей наливайте культуры в центрифуге бутылка 250 мл и спин вниз клетки в 14.000 x g для 10 минут удалить супернатант. Вымойте клетки, resuspending в 30 мл воды. Трансфер в пластиковых пробирок и спин вниз клетки снова на тех же условиях.
  3. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 10 мл буфера хроматографии (50 мм трис-HCl, рН 6,5, 150 мм NaCl, ЭДТА 0,2 мм), vortexing.
    Примечание: В это время клетки могут быть заморожены при-20 ° C приступить к очистке в любой другой момент.
  4. Используя свежие или талой бактериальным препаратом, перерыв клетки, добавив 1 тома (10 mL) фенол: хлороформа (см. шаг 3.2) и vortexing энергично.
  5. Центрифуга для 10 мин на 12000 x g, восстановления водной фазе и заново распаковать с 1 тома (10 mL) метилхлороформа на тех же условиях.
    Примечание: Подготовка РНК может храниться при температуре-20 ° C на данный момент.
  6. Дальнейшего очищения всего бактериальных РНК хромотографией Анионообменная. Фильтр RNA подготовка через 45 мкм фильтром шприц и нагрузки на 1 мл diethylethanolamine (открытое) столбца.
    1. Для очистки хроматографии используйте систему жидкостной хроматографии со скоростью потока 1 мл/мин. До загрузки образца, сбалансировать столбец с 10 мл буфера хроматографии (см. шаг 3.3 для композиции).
    2. Загрузить образец и промойте колонку с 10 мл буфера хроматографии. Элюировать РНК с 20 мл буфера (50 мм трис-HCl, рН 6,5, 1 M NaCl, 0,2 мм ЭДТА) и собирать 1 мл аликвоты.
      Примечание: РНК быстро elutes в первоначальных фракций. Столбец может быть повторно использован для дальнейшего очищения. Для этого промойте колонку с 10 мл воды и хранить при 4 ° C в 20% этанола.
  7. Поскольку большая часть рекомбинантного РНК накапливается в E. coli в круглую форму это свойство можно выгоду для очистки до однородности12. Отделите круговой РНК от линейной коллегами электрофорезом двумерного гель полиакриламида (2D стр.)-денатурации и денатурировать (8 М мочевиной) условий12,22.

4. РНК анализ

  1. Подготовить 5% гель полиакриламида (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, массе) в КЭ буфера (89 мм трис, 89 мм борной кислоты, 2 мм ЭДТА) содержащий 8 M мочевины.
  2. Микс 20 мкл РНК препаратов с 1 объем загрузки буфера (98% формамида, 10 мм трис-HCl, рН 8,0, 1 мм ЭДТА, 0,0025% бромфеноловый синий и 0,0025% ксилола cyanol), (20 мкл) Инкубируйте 1,5 мин при 95 ° C в блоке Отопление и защелкните прохладно на льду.
  3. Загрузить образцы в геле полиакриламида и запустить электрофореза в соответствующих условиях в зависимости от размеров гель (например, запустить 140 x 130 x 2 мм гели для 2,5 ч в 200 V). Пятно гель для 15 минут в 0,5 мкг/мл бромид ethidium, смыть водой и визуализировать РНК под УФ светом.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Производить рекомбинантные РНК в E. coli с помощью ELVd производные системы12, РНК интерес привиты к ELVd РНК эшафот. Этот химерных РНК совместно выразили вдоль баклажаны лигаза tRNA в E. coli. После обработки, расщепляется и circularized, химерных круговой РНК, из к...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Исследуя ELVd последовательность и структура потребностей участвующих в признании, баклажаны лигаза tRNA, мы заметили, что Сопредседатель выражение обеих молекул в не хост E. coli привело к неожиданным большое накопление вироиды круговой формы в бактериальных клетках19. Мы ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что технология, описанная в настоящем протоколе был запатентован (нас патент No. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Благодарности

Эта работа была поддержана грантов BIO2017-83184-R и BIO2017-91865-EXP от испанской Ministerio де наук, Декабрь Innovación y (совместно финансируемых ФЕДЕР фонды).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseThermo ScientificF530S
Bpi IThermo ScientificER1011
AgaroseConda8010D1 low EEO
TrisPanReac AppliChemA1086,1000
Acetic acidPanReac AppliChem131008.1214
EDTASigma-AldrichE5134-500G
Ethidium bromidePanReac AppliChemA1152,00251%
Zymoclean Gel DNA RecoveryZymo ResearchD4001
NanoDropThermoFisher ScientificND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BioLabsE2621S
DNA Clean & ConcentratorZymo ResearchD4003
EporatorEppendorf4309000019
Escherichia coli DH5αInvitrogen18265-017
TryptoneIntron BiotechnologyBa2014
Yeast extractIntron Biotechnology48045
NaClPanReac AppliChem131659.1211
AgarIntron Biotechnology25999
AmpicillinPanReac AppliChemA0839,0010
X-galDuchefaX1402.1000
N,N-DimethylformamidePanReac AppliChem131785.1611
NucloSpin PlasmidMacherey-Nagel22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)Novagen69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)Ref. Timmons et al., 2001
ChloramphenicolDuchefaC 0113.0025
GlycerolPanReac AppliChem122329.121187%
KH2PO4PanReac AppliChem131509.1210
K2HPO4PanReac AppliChem122333.1211
HClPanReac AppliChem131020.1211
PhenolScharlauFE0479100090%
ChloroformPanReac AppliChemA3691,1000
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF columnGE Healthcare Life Sciences17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography systemGE Healthcare Life Sciences11001313
AcrylamydePanReac AppliChemA1089,10002K
N,N’-methylenebisacrylamideSigma-AldrichM7279-100G
UreaPanReac AppliChem146392.1211
Boric acidPanReac AppliChemA2940,1000
FormamidePanReac AppliChemA0937,2500
Bromophenol blueSigma-AldrichB8026-5G
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamineSigma-AldrichA4929-5G

Ссылки

  1. Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
  2. Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
  3. Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4(2017).
  5. Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
  6. Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268(2018).
  7. Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
  8. Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
  9. El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
  10. Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150(2013).
  11. Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
  12. Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904(1904).
  13. Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
  14. Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
  15. Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
  16. Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
  17. Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
  18. Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
  19. Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  21. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  22. Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
  23. Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
  24. Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
  25. López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

141aptamertRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены