Индукция и оценки инбридинга кресты с использованием Ant, Vollenhovia Emeryi

Резюме

В этом протоколе описаны методы для проведения инбридинга кресты и для оценки успеха этих крестов, для муравей Vollenhovia emeryi. Эти протоколы являются важными для экспериментов, направленных на понимание генетическую основу системы определения пола в перепончатокрылые.

Аннотация

Генетические и молекулярные компоненты определения пола Каскад активно изучались в пчелы Apis mellifera, организм hymenopteran модель. Однако мало что известно о механизмах определения пола, в других-модель hymenopteran таксонов, как муравьи. Из-за сложного характера жизненные циклы, которые развивались в hymenopteran видов трудно поддерживать и проводить экспериментальные кресты между этими организмами в лаборатории. Здесь мы описываем методы для проведения инбридинга кресты и для оценки успеха этих кресты в муравей Vollenhovia emeryi. Вызывая инбридинга в лаборатории с использованием V. emeryi, является относительно простым из-за уникальной биологии видов. Конкретно этот вид производит андрогенетическое мужчины, и женский самцами экспонат крыло полиморфизма, который упрощает выявление фенотипы в генетических кресты. Кроме того оценки успеха инбридинга проста, как мужчины могут производиться непрерывно инбридинг кресты, в то время как самцы появляются только в четко определенных репродуктивного сезон в поле. Наш протокол допускает использование V. emeryi как модель для изучения генетические и молекулярные основы системы определения пола в муравьи.

Введение

Hymenopteran эусоциальных таксонам, как муравьи и пчелы, развивались системы определения пола haplodiploid, в котором люди, которые являются гетерозиготных на один или несколько дополнительных секс определение локусов (КУР) становятся женщины, в то время как те, которые являются гомо - или hemizygous стать мужчины (рис. 1A)¹.

Генетические и молекулярные компоненты, участвующие в секс решимость каскадных хорошо изучены в пчелы Apis mellifera,^3,2,hymenopteran модели организма⁴. Недавние исследования в области сравнительной геномики показывают, что муравьи и пчелы разделяют многие предполагаемые гомолог в секс определение пути, такие как первоначальный секс определение гена, кур⁵. Однако доказательства для функциональных сохранения этих гомолог по-прежнему отсутствует в муравьях.

Для решения этой проблемы, инбридинга линии должны разрабатываться как они имеют важное значение для картирования генетических и молекулярных исследований. Однако это трудно поддерживать и проводить экспериментальные кресты между этими организмами в лаборатории из-за сложного характера жизненные циклы, которые эволюционировали.

Здесь мы используем Vollenhovia emeryi как модель для изучения генетические и молекулярные основы системы определения пола в муравьи^6,7. Инбридинг линии этого вида были разработаны ранее для сопоставления связь локусов количественных признаков (QTL) для черты, связанные с определением секс в первый раз в муравьи⁶. Кроме того Каскад молекулярных определение пола была исследованы⁷. Этот вид развивалась необычные репродуктивной системы, которая использует гиногенез и андрогенез (рис. 1Б)^8,9. Большинство новых Королев и мужчины клонально изготавливаются из материнской и отцовской геномов, соответственно. Кроме того, работники и некоторые Королев производятся сексуально⁸. Эта система воспроизводства особенно хорошо подходит для генетических исследований, потому что инбридинг кресты, вырабатываемый сексуально производится Квинс и мужчины генетически эквивалентна классической backcross. Так как сексуально производимых Квинс морфологически отличаются от Квинс, производится из материнской геномов¹⁰ (рис. 1Б), проведения и оценки инбридинга кресты значительно упрощается с помощью этого метода.

В этой статье, методы для создания лаборатории колоний для пересечения теста, применение инбридинга пересекает используя полный СИБ пар и оценки успеха эти кресты, используя генотипирования членов колонии и рассечение мужского потомства гениталии описаны в V. emeryi.

Независимо от репродуктивной системы используемых применение инбридинг кресты часто является важным первым шагом в любом расследовании секс определение систем в перепончатокрылые. Например, в Cardiocondyla obscurior, почти полное отсутствие диплоидных мужчины после 10 поколений полный СИБ спаривания в лабораторных условиях демонстрирует отсутствие кур Локус¹¹. Это позволяет предсказать количество локусов кур от соотношение самцов, производимых в инбридинга кресты^6,12,13.

протокол

1. полевой сбор и ведение V. Emeryi колоний в лаборатории

Примечание: Гнезда V. emeryi находятся в загнивание бревен и упал распадаясь дерево branchesin вторичных лесов по всей Японии. Этот вид показывает два вида колоний, т.е. (1) колонии производит только Лонг крылатый Королев и (2) колонии, главным образом производить короткие крылатый Королев в дополнение к небольшое количество Лонг крылатый Квинс^8,14. В этом протоколе мы собрали последний тип колоний в префектуре Исикава, Япония.

1. Соберите V. emeryi колонии в начале лета.
   Примечание: Для получения достаточного числа сексуальных людей в течение сезона репродуктивного, колоний, содержащий более чем 300 человек являются предпочтительными.
2. Передача образцов муравей из собранных филиалов искусственный гипс гнездо с стеклянной крышкой с помощью аспиратор (рис. 2, слева).
3. Поддерживать колоний в искусственных гнезд при 25 ° C под 16:8 h свет/темно цикла. Обеспечивают водопроводной воды с бутылкой мыть для мокрой штукатурки.
   1. Добавьте около 100 мг порошка сухого крикет, завернутые в алюминиевой фольги и коричневый сахар водой наконечник (20 мкл наконечник) каждый день до тех пор, пока возникают новые самцами (F₁ крылатый Королев и F₁ мужчины).

2. Экспериментальная лаборатория кресты

Примечание: Новые самцами начинают появляться с конца лета до осени (рис. 3). Лонг крылатый Квинс производятся сексуально, и короткий крылатый Королев производятся клонально и материнской генома (рис. 1). Используйте длинные крылатый Королев и мужчины для инбридинг кресты.

1. Чтобы остановить людей от переезда, место колоний в комнате постоянной среде при температуре 4 ° C на 15 мин.
2. Удаление середине ноги 30 работников, используя пинцет под стереоскопическим микроскопом и передавать их в новые меньше гнездо штукатурки (рис. 2, право) для инбридинг кресты.
   Примечание: Ноги удаляются, чтобы отличить настоящий работников от работников, которые будут производиться путем последующего инбридинга кресты.
3. Добавьте 3-4 Личинки и куколки в гнездо штукатурка содержащая работников.
   Примечание: Рабочие Показать разведочной деятельности в колонии Королев менее₀ F. Личинки и куколки могут эффективно привлекают эти рабочие и новых самцами в центре колонии во время пересечения теста. В результате сохранить условия экспериментальной колонии недалеко от обычной колонии.
4. Передача Лонг крылатый Королева и мужчина в гнездо Штукатурка подготовлена на шаге 2.3 для инбридинг кресты.
5. Держите колонии при 25 ° C под свет/темно цикла 16:8 h с пищей и водой, как описано в 1.3 до королевы потерять ее крылья и откладывают яйца.
   Примечание: Это занимает одну неделю до месяца.
6. Проверьте ежедневно экспериментальной колонии под стереоскопическим микроскопом. После выполнения инбридинга пересекает между F₁ потомство, яйца можно наблюдать под стереоскопическим микроскопом.
7. После F₁ Королева начинает откладывать яйца, удалить F₁ мужчины и личинки или куколок, добавленной на шаге 2.3 из гнезда, чтобы избежать смешивания₁ поколения F (мужчины и женщины, используемых для инбридинга кресты) и F₂ поколения (потомство производится из инбридинга кресты).
   Примечание: Если существует несколько мужчин в колонии, его можно вызвать инбридинга кресты, используя один кобель и 1 – 3 Королев в том же экспериментальной колонии.
8. Держите колоний под же conditionsas описано в 1.3, до тех пор, пока возникают F₂ потомство.
   Примечание: Королева₁ передачи F и F₂ потомство в новых крупных гнездо штукатурки (рис. 2, слева) для долгосрочного поддержания колонии.

3. Оценка инбридинга успеха

1. Экстракции ДНК и генотипирования родительского поколения (F₀)
   1. Удалить одну ногу Королева₀ F, с помощью щипцов и передача ногу на 1,5 мл микропробирок, содержащей 100 мкл комплексообразования агента.
   2. Под стереоскопическим микроскопом вскрыть Женский живот в стеклянную посуду, заполнены с 300 мкл ультрачистая вода с помощью щипцов и изолировать сперматека, содержащие сперму с растяжением мужчины.
   3. Удаляйте ткани сперматека и изолировать спермы из ткани самка с помощью насекомых булавки.
      Примечание: Для облегчения извлечения спермы от сперматека, магазин женских особей в 100% EtOH для более чем за один день до вскрытия.
   4. С помощью микропипеткой, передача спермы в 1,5 мл микропробирок, содержащей 100 мкл комплексообразования агента.
   5. Проинкубируйте образцы F₀ Королева и сперматозоиды, подготовленную на этапе 3.1.1 и 3.1.3, соответственно, на 95 ° C в течение 20 мин Flash центрифуга Микропробирка и хранить при 4 ° C.
   6. Генотип, все образцы с использованием метода описано в других разделах⁴.
2. Экстракции ДНК из пары муравьев, используемых для инбридинга кресты (F₁)
   1. После того, как подтверждающие производство яиц, sib повязана F₁ королевы, извлечь ДНК королевы, используя ее крылья сарай или середине ноги и генотип же методом, описанным в разделе 3.1 выше.
   2. Извлечь ДНК F₁ самец, используя одну ногу и генотип их с помощью же методом, описанным в разделе 3.1 выше.
      Примечание: Образцы могут быть сохранены в 100% EtOH до экстракции ДНК и ДНК в комплексообразования агент может храниться на два месяца при 4 ° C.
3. Оценки от мужской фертильности у самцов производится из инбридинг кресты
   Примечание: Диплоидный производится из инбридинга кресты самцы часто стерильные.
   1. Вскрыть внутренних половых органов в стеклянную посуду с 400 мкл раствора PBS с помощью щипцов.
   2. Удаление PBS и добавить 4% параформальдегида (PFA) с помощью микропипеткой.
   3. Исправьте ткани, инкубации в PFA для 30 мин при комнатной температуре (15-25 ° C).
   4. Вымойте ткань 5 раз с 400 мкл PBS с помощью микропипеткой.
   5. Разбавьте 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) решения 1 мкг/мл в PBS.
   6. Удаление PBS и добавить примерно 300 мкл этой разбавленный раствор DAPI окрашивания тканей.
   7. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре (15-25 ° C) в темных условиях.
   8. Вымойте ткань 5 раз с 400 мкл PBS и передачи ткани на центр слайд стекла с помощью щипцов.
   9. Монтировать ткани на монтаж среднего содержащие Фаллоидин конъюгированных тетраметилродамина TRITC.
   10. Наблюдать за образцы лазером конфокальный сканирующий микроскоп 20 X или 63 X объективов.
   11. Используйте 405 нм лазер возбуждения и гибридные детектор 410-530 Нм для обнаружения DAPI.
   12. Используйте 561 Нм лазер возбуждения и гибридные детектор на 565-650 Нм для обнаружения TRITC.
   13. Использовать скорость сканирования 400 Гц (400 линий/сек) с разрешением 1024 × 1024 пикселей.
   14. Захват изображения с помощью программного обеспечения платформы.

Результаты

Результаты анализа микроспутник с использованием F₀ и поколения₁ F показал, что инбридинг кресты были произведены успешно (рис. 4)⁶. В результате инбридинга кресты, сочлененного queens были получены в течение одного месяца с момента ?...

Обсуждение

Эта статья демонстрирует протоколы, которые могут использоваться для побудить инбридинга кресты и оценить появление инбридинга в муравьев V. emeryi. В экспериментах Генотипирование лиц, используемых для кроссов необходимо обеспечить, что инбридинг кресты были успешными. Однако эффе...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaster powder	N/A	N/A	Any brand can be used
Charcoal, Activated, Powder	Wako	033-02117,037-02115
Slide glass	N/A	N/A	Any brand can be used
Dry Cricket diet	N/A	N/A	Any brand can be used
Brown shuger	N/A	N/A	Any brand can be used
Styrene Square-Shaped Case	AS ONE	Any size	Size varies by number of ants
Incbator			Any brand can be used
Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B	TAITEC	0014035-000
1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom	WATSON	131-715CS
Ethanol (99.5)	Wako	054-07225
Stereoscopic microscope	N/A	N/A	Any brand can be used
Forseps	DUMONT	0108-5-PO
Chelex 100 sodium form	SIGMA	11139-85-8
Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TaKaRa	T9181
Paraformaldehyde	Wako	162-16065
-Cellstain- DAPI solution	Dojindo Molecular Technologies	D523
ABI 3100xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems		Directly contact the constructor formore informations.
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
Leica HyDTM	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Directly contact the constructor formore informations.