JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье мы опишем протоколы протеина выражение, очистка, кристаллизации и структуры определения N-концевой домен рецептора рианодиновыми от diamondback моли (Plutella xylostella).

Аннотация

Разработка мощных и эффективных инсектицидов, ориентация насекомых рианодиновыми рецепторы (RyRs) был большой интерес в области сельскохозяйственными вредителями. На сегодняшний день, несколько diamide инсектициды против вредителей, которые освоено RyRs, которые генерируют годовой доход в 2 миллиарда долларов США. Но понимание действия инсектицидов, RyR ориентация ограничивается отсутствием структурной информации о насекомых RyR. Это в свою очередь ограничивает понимание развития резистентности к инсектицидам в вредителей. Бугорчатая моли (ДБМ) является разрушительных вредителей, уничтожив крестоцветных культур во всем мире, который поступили также показать резистентности к инсектицидам diamide. Таким образом она имеет большое практическое значение для разработки новых инсектицидов, ориентация RyR дБм, особенно ориентация региона отличается от традиционной diamide привязки сайта. Здесь мы представляем протокол для структурно характеристики N-концевой домен RyR от дБм. X-ray Кристаллическая структура была решена путем молекулярной замена с разрешением 2,84 Е, который показывает бета трилистник складной мотив и фланкируя альфа-спираль. Этот протокол может быть адаптирована для выражения, очистки и структурных характеристик других доменов или белков в целом.

Введение

Рианодиновыми рецепторы (RyRs) являются конкретные ионные каналы, которые посредником проникновение ионов Ca2 + через мембраны саркоплазматический ретикулум (SR) в мышечных клетках. Таким образом они играют важную роль в сокращении возбуждения муфты процесса. В своей функциональной формы, RyR собирает как гомо Тетрамер с молекулярной массой > 2 MDa, с каждого подразделения, состоящий из ~ 5000 аминокислотных остатков. В млекопитающих, существует три изоформ: RyR1 - скелетных мышц, типа RyR2 - сердечной мышцы и RyR3-повсеместно выражена в различных тканях1.

В насекомых существует только один тип RyR, который выражается в мышечной и нервной ткани2. Насекомое RyR больше похож на млекопитающих RyR2 с идентификатором последовательности около 47%3. Diamide инсектициды, ориентированные на RyR чешуекрылых и Coleoptera разработаны и продаются в крупных компаний, как Bayer (flubendiamide), DuPont (Хлорантранилипрол) и "Сингента" (cyantraniliprole). С момента своего запуска относительно недавно diamide инсектициды стали одним из быстро растущих класса инсектицидов. В настоящее время продажи этих трех инсектицидов ежегодно пересекли 2 миллиарда долларов США с темпами роста более чем на 50% с 2009 года (Agranova).

Недавние исследования сообщили развитие резистентности у насекомых после нескольких поколений использования этих инсектицидов4,5,6,,78. Сопротивление мутаций в трансмембранных доменов RyRs от diamondback моли (ДБМ), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) и соответствующие позиции в томатном яблонный, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) показывают, что регион могут быть вовлечены в diamide инсектицид привязки, как этот регион известен быть критическим для стробирования канала4,8,9. Несмотря на обширные исследования в этой области точные молекулярные механизмы diamide инсектицидов остаются недостижимой. Кроме того неясно, затрагивают ли мутации сопротивления взаимодействия с гидразиды прямо или allosterically.

Ранее проведенные исследования сообщили структуру нескольких доменов RyR от видов млекопитающих и структура полнометражных RyR1 млекопитающих и RyR2 рентгеноструктурного анализа и крио электронная микроскопия, соответственно10,11, 12,13,14,,1516,,1718,19,20,21 . Но пока что, нет структуры насекомых RyR сообщалось, который запрещает нам понимание молекулярных тонкости функции рецепторов, а также молекулярные механизмы действия инсектицидов и развития резистентности к инсектицидам.

В этой рукописи мы представляем обобщенных протокол для структурной характеристики N-терминальный β-трилистник домена рецептора рианодиновыми от моли diamondback, разрушительных вредителей, заражая крестоцветных культур во всем мире22. Конструкция была разработана согласно опубликованной кролик RyR1 NTD кристалл структур23,24и крио EM структурной модели16,,1718,19, 20 , 21. это первый разрешением структура для насекомых RyR, который раскрывает механизм для стробирования канала и предоставляет шаблон важные для развития вегетационных инсектицидов, с использованием проектирования на основе структуры наркотиков. Для разяснения структуры мы заняты рентгеноструктурного анализа, который рассматривается как «золотой стандарт» для определения структуры белка в вблизи атомных резолюции. Хотя процесс кристаллизации является непредсказуемым и трудоемкий, этот шаг за шагом протокол поможет исследователям выразить, очищают и в целом характеризуют другие домены насекомое RyR или любые другие белки.

протокол

1. клонирование гена, выражение протеина и очистки

  1. PCR усиливает ДНК, соответствующий протеин интереса (остатки 1-205 дБм RyR, Genbank соотв. нет. AFW97408) и клонов в ПЭТ 28a-HMT вектор клонирования перевязка-независимые (LIC)25. Этот вектор содержит гистидина, MBP тег и сайт расщепления протеазы ТэВ на N-го15.
    1. Дизайн LIC Праймеры для амплификация гена целевой с LIC-совместимых 5' расширений:
      Форвард LIC грунт:
      5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3'
      Обратный LIC грунтовка:
      5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'
    2. Объединить компоненты реакции (50 мкл): 1 мкл ДНК шаблонов (100 нг/мкл), 1 мкл вперед праймера (10 мкм), 1 мкл обратного праймера (10 мкм), 0.5 мкл ДНК полимеразы (нос), 5 мкл реакции 10 x буфер, 1 мкл dNTP (25 мм) , 40,5 мкл РНКазы бесплатно ddH2O.
      1. Поместите смесь реакции в машину ПЦР и запускать следующую программу.
      2. Инкубируйте на 95 ° C в течение 3 мин, а затем запустить 30 циклов (95 ° C за 30 сек, 58 ° C 15 s, 72 ° C в течение 1 мин). Инкубируйте на 72 ° C за 5 мин и затем провести на 4 ° C.
      3. Запуск всего реакция смеси (50 мкл) на 2% агарозном геле и извлекать с комплектом извлечения геля. Следуйте производителя протокол.
    3. Перевязка независимые клонирования (LIC)
      1. Выполнять SspI пищеварения (60 мкл): 20 мкл дна вектора (50 нг/мкл), 6 мкл 10 x буфер реакции, 4 мкл SspI и 30 мкл ddH2O. инкубировать при 37 ° C для запуска всего реакция 3 h. mix на гель агарозы 1% и извлекать с комплектом извлечения геля. Следуйте производителя протокол.
      2. Проводить лечение T4 полимеразы дна вектора и вставьте ДНК. Объединить следующее: 5 мкл вектор или Вставка ДНК (50 нг/мкл), 2 мкл 10 x T4 ДНК-полимеразы буфера, 1 мкл dGTP (25 мм) для вектора или 1 мкл дЦТФ (25 мм) для вставки ДНК, 1 мкл DTT (100 мм), 0,4 мкл T4 ДНК полимеразы (уточненное LIC) и 9.6 мкл ddH2O. инкубировать реакций при комнатной температуре за 40 мин, тепло инактивирует фермент на 75 ° C в течение 20 мин.
        Примечание: LIC вектор и вставка ДНК должны рассматриваться в отдельном реакциях.
      3. Выполните LIC, отжиг реакции. Объединить следующее: 2 мкл лечение T4 Вставка ДНК, 2 мкл лечение T4 LIC вектор ДНК. Инкубируйте реакции при комнатной температуре в течение 10 мин.
  2. Трансформировать BL21 (DE3) E. coli клетки с этой рекомбинантных плазмид.
    1. Оттепель сведущие клетки (50 мкл в микро пластиковых пробирок) на льду.
    2. Добавить примерно 1 мкл (50 нг) плазмидной в трубу. Смешайте клетки и ДНК, нежно стряхивая трубки 2 – 3 раза. Место труб на льду за 20 мин.
    3. Тепло шок при 42 ° C 40 s. место трубки на льду снова добавить по 1 мл 2 мин комнатной температуре LB СМИ к трубе.
    4. Место смесь трубки в шейкер 250 об/мин при 37 ° C на 45 мин распространение 150 – 200 мкл смеси на выбор плит. Инвертировать пластину и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  3. Выберите один колонии и культуры клетки в 100 мл 2YT среде, содержащей 50 канамицин мкг/мл при 37 ° C на ночь. Следующее утро, прививать 1 Л 2YT среде, содержащей 50 мкг/мл канамицин с 10 мл на ночь культуры и инкубировать в 37 ° C шейкер инкубатор на 250 об/мин, до тех пор, пока ОД600 достигает ~ 0,6. После этого вызвать культуры с IPTG до конечной концентрации 0,4 мм и расти еще 5 ч на 30 ° C.
  4. Урожай клетки центрифугированием в 8000 x g 10 мин при температуре 4 ° C, собирать клетки и клетки каждые 10 г в 40 мл буфера lysis (10 мм HEPES рН 7,4, 250 мм KCl, β-меркаптоэтанол 10 мм, 25 мкг/мл лизоцима, 25 мкг/мл DNase Ресуспензируйте 1 мм PMSF).
    1. Срывать его, sonication на 65% амплитуды на 8 мин с 1 s на и 1 s выкл. Удалите мусор клетки центрифугированием на 40000 x г за 30 мин при 4 ° C. Фильтр супернатанта, проходя через 0,22 мкм фильтр и загрузить его в пример цикла.
  5. Очистить протеин сплавливания, Клив тег и повторно очищают целевого белка.
    1. Очистить протеин сплавливания с помощью Ni-НТА столбца (привязки буфера: 10 мм HEPES рН 7,4, 250 мм KCl; Элюирующий буфер: 10 мм HEPES рН 7,4, 250 мм KCl, 500 мм имидазола) и очистить системой очистки, с помощью линейного градиента имидазола 20 – 250 мм.
    2. Рассекающий удар eluted целевого белка с ТэВ протеазы (1:50 соотношение) на ночь при 4 ° C.
    3. Очистить смесь реакции расщепления с помощью столбца амилоза смолы (привязки буфера: 10 мм HEPES рН 7,4, 250 мм KCl; Элюирующий буфер: 10 мм HEPES рН 7,4, 250 мм KCl, мальтоза 10 мм) и столбец Ni-НТА удалить тег и ТэВ протеазы. Целевого белка будет в проточную часть этих двух столбцов.
    4. Dialyze образец против диализа буфера (10 мм трис-HCl рН 8,8, 50 мм KCl, β-меркаптоэтанол 10 мм для уменьшения концентрации соли. Очищение образца на анион обменной колонны (привязки буфера: 10 мм трис-HCl рН 8,8, 10 мм β-меркаптоэтанол; Элюирующий буфер: 10 мм трис-HCl рН 8,8, 1 M KCl, 10 мм β-меркаптоэтанол) линейный градиент 20 – 500 мм KCl в Элюирующий буфер.
    5. В качестве последнего шага в процессе очистки концентрат белка, используя концентратор центробежные (10 кДа MWCO) и вставляют Superdex 200 26/600 лари фильтрации столбца для проверки однородности.
  6. Проверьте чистоту белка, запустив его на 15% SDS страницы.
    Примечание: Все столбцы запущены на систему очистки белков с 2 мл/мин скорость потока привязки и скорость потока элюции 4 мл/мин за исключением гель фильтрации в 1 мл/мин.

2. белка подготовка и кристаллизации

  1. Концентрат очищенный протеин образца до 10 мг/мл, используя концентратор центробежные (10 кДа MWCO) и буфер обмена кристаллизации буфер перед сохранением на-80 ° C.
  2. Выполнить проверки кристаллизации (соотношение 1:1, 200 nL белков и 200 nL водохранилище буфера), сидя падение метод диффузии паров на 295 K с несколькими кристаллизации наборы, с помощью автоматизированных жидкости, робототехнические системы в формате 96-луночных обработки.
    Примечание: Мы использовали наборы от молекулярных размеров и Hampton исследований и грифона автоматизированной системы обработки жидких.
  3. Уплотнение 96-луночных кристаллизации пластины для предотвращения испарения и позволить уравновешивания белка падение с буфером водохранилище. Затем сохраните пластины в инкубаторе кристалл на 18 ° C.
  4. Проверьте 96-луночных пластины, периодически с помощью световой микроскоп для мониторинга роста и формирования кристалла.
  5. Чтобы дифференцировать белковых кристаллов от кристаллов поваренной соли, используйте краска белка. 1 мкл красителя, падение целевой. Подождите около 1 h и наблюдать под микроскопом. Кристаллы белка будет синим.
  6. Используйте положительные кристаллизации условия (сульфат аммония 1,5 М, 0,1 М трис pH 8.0) для дальнейшей оптимизации кристаллы, используя висит drop метод диффузии паров в 24-ну пластины.
    1. Оптимизируйте pH от 7,0 до 8,5 с 0,5 рН единичный интервал каждый шаг. Оптимизируйте концентрации сульфата аммония от 1,2 М до 1,7 М с интервалом 0,1 М каждый шаг. (В нашем случае лучшие условия производства крупных кристаллов, плита образный был сульфат аммония 0,1 М HEPES pH 7.0 и 1.6 М)

3. Монтаж, кристалл рентгеновские сбора данных и определения структуры

  1. Монтировать кристаллы в cryoloop и флэш прохладно в жидком азоте с помощью водохранилище раствора, содержащего 20% глицерин как крио Протравитель. Место кристаллы в unipuck для хранения и транспортировки.
  2. Предварительно просматривать белковых кристаллов с помощью Rigaku доме рентгеновского diffractor. Выберите лучшие из них с высоким резолюций для сбора данных на объектах синхротрона (наш набор данных была собрана из BL17U1 в Шанхае синхротронного излучения).
    1. Используйте программное обеспечение для контроля излучение BluIce26 монтировать и центр кристаллы функцией автоматической или ручной центрирования. Выполните тест воздействия для определения стратегии сбора данных, включая начиная угол, выдержка, детектор расстояния, ширина кадра и чисел.
    2. Сбор данных соответственно (мы собрали 180 кадры с 1 s выдержка, ширина кадра 1° и детектор расстояние 350 мм).
  3. Индекс, интегрировать и масштаб dataset с помощью HKL2000 люкс27. Сначала выполняют функцию поиска пик найти дифракции пятна и затем индекс пятна и выберите группу правой пространства. После интеграции пик масштаб набор данных с моделью надлежащего ошибки и сохраните файл вывода .sca.
  4. Решить проблему фазы, молекулярные замены с помощью Phaser28 в Феникс29.
    1. Вычислите количество белковых молекул в группе асимметричных копии Xtriage30.
    2. Посмотрите для надлежащей структуры шаблонов с высокой последовательности идентичности и структурно сходство как целевого белка, используя известные структуры из литературы или модели, создаваемые сервером Предсказание структуры таких Phyre231 (мы использовали кролик RyR1 NTD как Поиск модели, PDB ID 2XOA).
    3. Запустите Phaser, используя файл данных дифракции, шаблон структуры файла и файл последовательности белка найти решение.
  5. Выполните автосборки32 в Феникс29 для создания первоначальной модели с помощью выходного файла от Phaser и файл последовательности от целевого белка.
  6. Создание структуры в модифицированных экспериментальной электронной плотности, используя Лысуха33 и уточнить с помощью phenix.refine34 в итерационные циклы вручную.
  7. Проверка конечной модели, с помощью средств проверки в PHENIX18.

Результаты

Очистка

N-концевой домен дБм RyR была выражена как синтез белка с hexahistidine тегов, тег MBP и ТэВ протеазы расщепления сайта. Мы последовали за пять этапов очистки стратегию для получения чистого белка, подходит для цели кристаллизации. Во-первы...

Обсуждение

В этой статье мы описать процедуру recombinantly выразить, очищают, кристаллизация и определить структуру дБм RyR NTD. Для кристаллизации важнейшее требование заключается в получении белки с высокой растворимости, чистоты и однородности. В нашем протокол мы решили использовать ПЭТ 28a-HMT вектор, ?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Финансирование этого исследования была предоставлена: Национальный исследовательский ключ и Программа развития Китая (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), национальный характер науки фонд Китая (31320103922, 31230061) и программа проекта национальных фундаментальных исследований (973) Китай (2015CB856500, 2015CB856504). Мы благодарны сотрудникам на излучение BL17U1 на объекте Шанхай синхротронного излучения (SSRF).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
pET-28a-HMT vectorThis modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strainNovagen69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)GE Healthcare45-000-325
Amylose resin columnNew England BiolabsE8021S
Q Sepharose high-performance column GE Healthcare17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)MilliporeUFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column GE Healthcare28-9893-36
Automated liquid handling robotic system Art Robbins InstrumentsGryphon
96 Well CrystalQuickGreiner bio-one82050-494
Uni-PuckMolecular DimensionsMD7-601
Mounted CryoLoop - 20 micronHampton ResearchHR4-955
CryoWandMolecular DimensionsMD7-411
Puck dewar loading toolMolecular DimensionsMD7-607
Nano dropThermo ScientificNanoDrop One
Crystal incubatorMolecular DimensionsMD5-605
X-Ray diffractorRigakuFRX
PCR machineEppendorfNexus GX2
Plasmid mini-prep kitQiagen27104
Gel extraction kitQiagen28704
SspI restriction endonucleaseNEBR0132S
T4 DNA polymeraseNovagen2868713
KanamycinScientific Chemical25389940
IPTGGenview367931
HEPESGenview7365459
β-mercaptoethanolGenview60242
CentrifugeThermo ScientificSorvall LYNX 6000 
SonnicatorScientzII-D
Protein purification systemGE HealthcareAkta Pure
Light microscopeNikonSMZ745
IzIt crystal dyeHampton ResearchHR4-710
Electrophoresis unitBio-Rad1658005EDU
Shaker IncubatorZhichengZWYR-D2401
Index crystal screenHampton ResearchHR2-144
Structure crystal screenMolecular DimensionsMD1-01
ProPlex crystal screenMolecular DimensionsMD1-38
PACT premier crystal screenMolecular DimensionsMD1-29
JCSG-plus crystal screenMolecular DimensionsMD1-37

Ссылки

  1. Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
  2. Takeshima, H., et al. Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster. FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).
  3. Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals. Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).
  4. Steinbach, D., et al. Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).
  5. Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China. Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).
  6. Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).
  7. Guo, L., et al. Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole. Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).
  8. Troczka, B., et al. Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).
  9. Roditakis, E., et al. Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).
  10. Borko, L., et al. Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias. Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).
  11. Sharma, P., et al. Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor. FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).
  12. Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface. Nature Communications. 4, 1506 (2013).
  13. Lau, K., Van Petegem, F. Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain. Nature Communications. 5, 5397 (2014).
  14. Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
  15. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
  16. des Georges, A., et al. Structural Basis for Gating and Activation of RyR1. Cell. 167 (1), 145-157 (2016).
  17. Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).
  18. Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2. Science. 354 (6310), (2016).
  19. Wei, R. S., et al. Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1. Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).
  20. Yan, Z., et al. Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution. Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).
  21. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  22. Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects. Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).
  23. Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
  24. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
  25. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
  26. Stepanov, S., et al. JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).
  27. Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  30. Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation. CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).
  31. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  32. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).
  33. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  35. Lin, L., et al. Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).
  36. Qi, S., Casida, J. E. Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

141

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены