JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье описывается новый метод для создания опухолевых антигенов-специфических индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных тимических эмигрантов (iTE) трехмерной (3D) тимской культуры системы. iTE - это однородное подмножество Т-клеток, тесно связанных с наивными Т-клетками с способностью к пролиферации, формированию памяти и подавлению опухолей.

Аннотация

Наследование предварительно переставленных Т-клеточных рецепторов (ТКР) и их эпигенетическое омоложение делают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) т-клеток перспективным источником для приемной Т-клеточной терапии (ACT). Однако классические методы in vitro для производства регенерированных Т-клеток из iPSC приводят либо к врожденной, либо неизлечимо дифференцированным Т-клеткам, которые фенотипически и функционально отличаются от наивных Т-клеток. Недавно была разработана новая трехмерная (3D) система тимской культуры для создания однородного подмножества CD8-- антиген-специфических Т-клеток с наивным Т-клеточным функциональным фенотипом, включая способность к распространению, формированию памяти , и подавление опухоли в vivo. Этот протокол позволяет избежать аномальных урядов развития, что позволяет для генерации клинически значимых IPSC полученных Т-клеток, назначенных как iPSC полученных тима эмигрантов (iTE), а также предоставление мощного инструмента для выяснения последующих функций, необходимых для созревания Т-клеток после выбора тимии.

Введение

Приемная Т-клеточная терапия (ACT) может быть эффективным лечением для некоторых пациентов с запущенным раком. К сожалению, многие пациенты не испытывают регрессии опухоли, и переданные клетки не сохраняются после инфузии. Это может быть связано с качеством настояний Т-клеток. Модель мыши ACT показала, что по сравнению с наивными или менее дифференцированными центральными клетками памяти Т, неизлечимо дифференцированные клетки-эффекторы менее мощные из-за плохой настойчивости in vivo1, наблюдение также поддерживается клиническими данными2, 3.

В целях повышения эффективности текущего ACT, Т-клеток, полученных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (T-iPSC) были изучены широко4,5. Когда Т-клетки перепрограммируются в T-iPSC и вновь дифференцированы в Т-клетки, перестроенная конфигурация генов TCR наследуется T-iPSC, а затем и повторно дифференцированных Т-клеток. Таким образом, способность T-iPSC пройти неограниченное расширение in vitro позволяет эффективное размножение незрелых Т-клеток, несущих неоантиген-специфические Т-клеточные рецепторы (TCR), когда такие клетки разработаны из опухолевых антиген-специфических Т-клеток6 ,7. Тем не менее, точный метод дифференциации T-iPSC в зрелые Т-клетки, которые позволили бы производство рака антиген-специфических Т-клеток с менее дифференцированным фенотипом и лучшей противоопухолевой потенцией, еще предстоит выяснить.

T-iPSC дифференциации с использованием совместной культуры OP9 мурин стромальных клеток чрезмерного выражения человека Notch ligand DLL1 является устоявшимся методом для производства Т-клеток в пробирке6,7. У мышей и людей, эта система совместной культуры может последовательно дифференцировать iPSC, тем самым реквалитулируя события развития от стадии бластоциста до незрелой линии Т-клеток стадии6,7. Несмотря на эти биотехнологические достижения, физиологическая дифференциация после этапа CD4иCD8и двойного положительного (DP) этапа по-прежнему трудно достичь. Одна из причин заключается в том, что in vivo CD4иCD8- и CD4-CD8- одиночные положительные (SP) Т-клетки генерируются в тимусе, органе, ответственном за созревание и отбор Т-клеток, которые имеют чужую антиген-специфичность, но не автореактивность8. Эти селективные процессы определяются как положительный и отрицательный отбор, соответственно. Тем не менее, большинство молекулярных механизмов, необходимых для созревания Т-клеток в тимусе до сих пор полностью не изучены, что затрудняет реконструкцию этого процесса в пробирке. В попытке преодолеть это физиологическое препятствие, несколько групп стимулировали комплекс TCR с использованием анти-CD3 антител или агонист пептидов. Эти методы in vitro генерируют клеточные продукты, которые выражают ключевые маркеры Т-клеток, такие как CD3, CD8, TCR и CD62L, сохраняя при этом специфичность опухолевых антигенов. К сожалению, Т-клетки, генерируемые этими экстрагимичными методами, представляют собой широкую неоднородную популяцию клеток, характеризующуюся неполным положительным отбором, врожденными особенностями, неспецифическим убийством TCR, неспособностью к формированию памяти и непостоянные противоопухолевыеэффекты in vivo 8,9,10,11. Эти аномалии вызвали опасения, что такие клетки могут вызвать различные побочные эффекты, в том числе лимфомы и кожи и костной аномалии, если используется для терапевтических приложений12,13,14 .

Чтобы воссоздать физиологические сигналы, отсутствующие в текущих системах дифференциации in vitro, антиген-специфический T-iPSC опухолевого антигена были дифференцированы с помощью собранного тимуса. Классическая система органов тимуса плода (FTOC), которая была разработана для изучения внутритимического развития Т-клеток, была усовершенствована с помощью 3D-системы культуры, которая успешно производила Т-клетки, которые завершили тимическое образование. Эти пост-тимические Т-клетки, которые были обозначены как iPSC полученных тимских эмигрантов (iTE), выставлены наивные свойства15. iTE показал пролиферацию, формирование памяти и адекватные противоопухолевые эффекты в мышиной модели против установленных опухолей меланомы B16. Эта статья подробно описывает протокол этой новой системы FTOC с использованием 3D-системы культуры(рисунок 1).

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональными комитетами по уходу за животными и использованию Национального института рака (NCI) и проведены в соответствии с руководящими принципами NIH.

1. Подготовка клеток OP9/DLL1 для совместной культуры с iPSC

  1. Культурные клетки OP9/DLL1 в op9-носителях (-минимальная необходимая среда »-MEM» - 20% ненагретная инактивированная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) 1x пенициллин-стрептомицин , аскорбиновая кислота (50 нг/мл) и моно-тиоглицерол (100 нм) при 37-c. Когда op9/DLL1 клетки достигают 80-95% конфлюкс, мыть один раз с 1x магния, кальция и фенола красный свободный фосфат буферный солен (в дальнейшем называют PBS).
  2. Добавьте 4 мл 0,05% трипсина и инкубировать в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия. Затем добавьте 4 мл носителей OP9, разъедините клеточный слой, прокладывая трубку, чтобы сделать одноклеточное суспензию.
  3. Перенесите суспензию клетки в коническую трубку 50 мл через 100 мкм-ситечко. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию, аспирируй супернатант и повторно приостанавливай 12 мл носителей OP9.
  4. Плита 2 мл OP9/DLL1 клеточной подвески на новый 10 см клеточной культуры Петри блюдо и добавить дополнительные 8 мл OP9 средств массовой информации. Повторите проход каждые 2-3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Качество FBS и культурные условия имеют решающее значение для поддержания расширения OP9/DLL1 ячеек, не теряя при этом их способности поддерживать дифференциацию iPSC. Поэтому рекомендуется предварительно оценить много FBS и проход последовательно на 80% confluency для предотвращения клеточной дифференциации и сенесценции. Важно также, чтобы сделать достаточно замороженных запасов OP9/DLL1 клеток и оттаивать новый запас каждые 4-6 недель.

2. В экстракорпорании Дифференциация iPSC в незрелые Т-клетки

  1. На 0 день, начните iPSC совместной культуры на OP9/DLL1 конфлированные блюда.
    1. Урожай iPSC в виде одноклеточной подвески путем трипсинизации (5 мин в 0,05% трипсина при 37 градусах Цельсия), собирать клетки, и центрифуги на 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
    2. Приготовьте супернатант и отдохните клетки на уровне 1,0 х 105 iPSC на 10 мл носителей OP9. Плита 1.0 x 105 iPSC на соплокую тарелку OP9/DLL1 10 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Посуда OP9/DLL1 10 см используется для дифференциации iPSC, когда они достигают 90-100% выпуклости. Различия в стоечности могут повлиять на эффективность дифференциации iPSC.
  2. На 3-й день, аспирируйте старые носители и заменить 10 мл свежих носителей OP9.
  3. На 6-й день, проходные камеры.
    1. Вымойте каждый 10 см сливаOPили OP9 блюдо с 10 мл PBS. Добавьте 3 мл 0,05% трипсина на блюдо и инкубировать в течение 3-5 мин при комнатной температуре (RT).
    2. Добавьте 4 мл носителей OP9 и соберите ячейки нежным пипеттингом. Пройдите клетки через 100 мкм ячейки ситечко и центрифуги на 300 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта.
    3. Resuspend клетки в 10 мл дифференциации средств (OP9 СМИ с 5 нг /мл мыши Flt3 лиганд "FLT3L" и 5 нг /мл мыши IL-7) и пластины ячейки подвески на новый 10 см OP9/DLL1 слияние блюдо.
  4. На 9-й день, аспирации старых носителей и заменить 10 мл свежих средств дифференциации.
  5. На 11 день, когда кардиомиоциты наблюдаются в колониях iPSC, механически отсоединяют неадекторные клетки путем пипетки и процеживают через 100 мкм клеточный ситечко. Спин при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
    1. Аспирация супернатанта и resuspend в 24 мл дифференциации средств массовой информации. Плита iPSC в сливочную 6-колодую пластину OP9/DLL1 (4 мл/колодец).
  6. На 15 день, собрать все неприсоединения клеток и фильтр через 40 мкм ячейки ситечко.
    1. Спин при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
    2. Продолжайте пропускать неприсоединения клетки каждые 3-4 дня, повторяя шаг 2.5.1.

3. 3D Тимский орган культуры для создания iTE

  1. Урожай мыши плода тимических долей и развертывания эндогенных лимфоцитов по дезоксигуанозина (dGUO) лечение, как ранее описано16.
  2. На 7-й день лечения dGUO, возьмите четыре новых 10 см блюд и заполнить каждый с 20 мл полных средств массовой информации (Россвелл Парк Мемориальный институт Сми 1640 "RPMI 1640" (MEM-NEAA) - 1x пенициллин-стрептомицин - 1:1000 2-меркапто этанол).
  3. Перенесите все мембраны нитроцеллюлозы с тимическими долей в одну 10-сантиметровую тарелку. Отсоедините отдельные доли от мембраны щипками, что позволяет их погружать в носители. Отбросьте мембраны. Инкубировать 1 ч на RT.
  4. Перенесите тимичные доли в новую 10-сантиметровую тарелку с полным носителем и инкубину в течение 1 ч на RT. Повторите этот шаг еще 2 раза.
  5. Используя щипцы, исправить тимьяна доли блюдо (по одному в то время), а с другой стороны сделать 100-200 мкм глубокий разрез в центре и расширение половины диаметра доли для облегчения Т-клеток-прародителей миграции в доле.
  6. Перенесите тимичные доли в новую 10-сантиметровую тарелку, наполненную полной дифференциацией (полные носители: 5 нг/мл мыши IL-7 , 5 нг/мл мыши FLT3L 5 нг/мл SCF).
  7. Дополнительно, при использовании 3D-культурных пластин с сетками нижнего и верхнего уровня, заполните обе сетки стерильными PBS, чтобы предотвратить испарение и сушку висячих капель.
  8. Передача 30 злицита полных носителей, содержащих одну дГУообработанную тимику с шага 3,6 в каждую скважину 3D-культурной пластины.
  9. Сбор неприсоединения T линии клеток (iPSC полученных незрелых Т-клеток) от OP9/DLL1 совместной культуры (дни 16-21) (шаг 2,6,2) и resuspend на 2-5 х 103 T линейных ячеек на 20 мульти-медиа.
  10. Добавьте 20 ЗЛ суспензии тлинейных клеток к каждой тимической доле в 3D-культуре пластины. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
  11. Установите P200 pipet до 30 Зл и аспирировать средства массовой информации после pipetting несколько раз из каждого колодца, чтобы удалить все клетки, окружающие тимские доли. Отбросьте мультимедиа и добавьте 30 кл. полного носителя. Повторите эту процедуру 5-7 раз, чтобы удалить любые дополнительные незрелые Т-клетки, которые не мигрируют в доли. Изменение 25-30 Зл средств массовой информации ежедневно после этого.
  12. Подтвердите образование ореола тимических эмигрантов (iTE) по липучне, полученного в iTE, вокруг долей, начиная с 4-5 дня, с помощью световой микроскопии.
  13. Собирайте iTE ежедневно путем пипетки средств массовой информации без нарушения доли. Изменяйте носители каждый день и продолжайте сбор примерно до 12 дней.
  14. Собранные iTE готовы к использованию для молекулярного анализа(рисунок 2, Рисунок3, Рисунок 4, и Рисунок 5) или in vivo экспериментов по трансплантации.

4. Подготовка антигенных клеток (APC)

  1. Пожертвуйте мышью C57BL/6 путем вывиха шейки матки и поместите на лабораторный коврик, как описано выше.
  2. Удалите селезенку и поместите ее на 100 мкм ячейки ситечко. Сжать селезенку на ситечко с помощью 12 мл шприц поршень, чтобы сделать одну ячейку подвески.
  3. Перенесите суспензию клетки через стерильный 40 мкм-ситечко. Centrifuge подвески на 300 х г в течение 5 минут при 4 кв С, чтобы гранулы клеток.
  4. Усилите супернатант и повторно ежеклеточные гранулы в 2 мл лиза аммония-хлорида (ACK), чтобы исключить эритроциты (РБК). Инкубировать в течение 5 мин на RT.
  5. Утолить буфер lysis ACK, добавив 10 мл PBS. Пелле клетки центрифугации при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
  6. Аспирировать супернатант и resuspend клеточной гранулы в 10 мл полного носителя и передачи 10 см стерильной чашке Петри.
  7. Облучение спленоцитов с помощью 3500 рад с помощью облучения устройства (я-излучения) для предотвращения пролиферации клеток.
  8. Немедленно верните облученные клетки в инкубатор и культуру 37 градусов по Цельсию на ночь.
  9. Используйте облученные ячейки в качестве БТР или замораживание в ячейке банкира.

5. Пульсирующий БТР с антигеном

  1. Граф жить облученных БТР с помощью гемоцитометра Нойбауэр и trypan синий краситель. Инкубировать APC с пептидами (hgp100) или нуклеопротеином в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.
  2. Вымойте APC дважды с 10 мл PBS, чтобы удалить любой дополнительный пептид.
  3. Подсчитайте iTE и смешайте с БТР в соотношении 1:1 в полных носителях с 100 МЕ Ил-2 и 5 нг/мл Ил-7. Aliquot 100 л смеси клеток (общая концентрация: 1 х 106 клеток/мл) в каждую скважину ультра-низкой привязанности U bottom 96 хорошо пластины и культуры для 48 ч при 37 градусов по Цельсию.
  4. После 48 ч, передача клеток на новую пластину с помощью многоканального пипетки и проход каждые 2-3 дней после этого.
  5. На 3-й день проанализируйте профиль секреции цитокинов, окрашивая клетки внутриклеточными антителами и анализируйте с помощью цитометрии потока(рисунок 3).
    1. Добавьте 0,67 л/мл ингибитора переноса белка (например, GolgiStop) и инкубировать при 37 градусах По цельсии в течение 6 ч для усиления внутриклеточного накопления цитокинов. Вымойте 10 мл PBS.
    2. Приостановите работу клеток в 3 мл холодного (4 кВ) PBS и медленно добавьте 1 мл холодного 4% параформальдегида (PFA).
    3. После 10 мин, спина вниз клетки на 300 х г в течение 5 мин при 4 кв С, отбросить супернатант и вымыть с 10 мл PBS.
    4. Переплетить клетки в 1 мл PBS - 1% FBS - 0,1% неионического сурфактанта, и поместить в 4 кв. м в течение 10-15 мин.
    5. Добавить антитела, защитить образцы от света и поместить в 4 градуса по Цельсию в течение 30 мин.
    6. Спин вниз клетки на 300 х г в течение 5 минут при 4 кв С, отбросить супернатант, и мыть с 10 мл PBS.
    7. Спин вниз клетки на 300 х г в течение 5 минут при 4 КС и resuspend клеток в 1 мл PBS. Клетки готовы к анализу в цитометре потока.

Результаты

Co-культурные тимы плода были разделены для анализа ли iPSC полученных T линии клетки могут мигрировать в тимачных долей. Unseeded контрольные доли были ткани архитектуры характеризуется астроцитов, как тимский эпителиальной сети17, развернутые эндогенных КЛЕТОк CD3. С другой стороны, тимические доли, посеянные с immature T-клетками, полученными iPSC, были заселены моноядерными клетками CD3 и, что указывает на миграцию незрелых Т-клеток, полученных iPSC, в доли (рисунок2A).

Т-клетки, которые мигрировали и созрели в тимской микросреде, впоследствии выбыли как iTE. Чтобы проверить их фенотипической характеристики, поток цитометрического анализа C57BL6 тимоцитов, Pmel iPSC полученных незрелых Т-клеток (экстратимные), и клетки, которые выйти из тимических долей (iTE) было выполнено. Экстратимные Т-клетки на OP9/DLL1 показали CD4иCD8 (DP) Т-клетки и Т-клетки CD8'SP без выражения положительного маркера отбора MHC-I, в то время как iTE имела четкую популяцию CD8'SP MHC-Iи Т-клеток фенотипа, указывая на их успешный проход через положительный отбор до выхода из тимических долей. iTE последовательно выражают MHC-I и CD62L, которые являются маркерами, связанными с высокой пролиферативной компетентности, производством цитокинов, периферийным выживанием и лимфоидным самонаведением18,19,20. Этот фенотип согласуется с M2 SP тимоцитов, которые являются наиболее зрелой популяции одного положительных Т-клеток в тимуса20, что свидетельствует о том, что iTE перешли через нормальную тимическую программу развития (Рисунок 3). Для контроля эффективности генерации iTE были выделены клетки, выпавшие из отдельных тимических долей. На 7-й день, тимики доли генерируется в среднем 1 х 103 жить CD8SP CD45.1CD3 cd3iTE в день (рисунок3B). Аналогичный уровень производства iTE наблюдается со дня 6 до дня 12 3D тимской ко-культуры.

Антиген-зависимая активация и секреция цитокинов были проанализированы для наблюдения за функциональными свойствами тимически образованных незрелых Т-клеток, полученных от iPSC. При наличии нерелевантного пептида (нуклеопротеина) Пмель-иТЕ не высвобождавал значительное количество ТНФ-З, ИЛ-2 или ИФН-З. При стимуляции с коньячным пептидом для клеток Pmel T (hgp100), Пмель-iTE выпустила надежное количество ТНФ-Я и IL-2, а также производит небольшое количество IFN-Я (Рисунок 4), что свидетельствует о том, что тимически образованных iTE может распознать их коньяк пептид и секретный эффектор цитокинов с профилем, напоминающим профиль естественных недавних тимских эмигрантов (RTE).

Для изучения транскрипционных различий между iPSC-полученных T линейных клеток дифференцированных на OP9/DLL1 с или без тимического образования (т.е. iTE против экстратимных Т-клеток), РНК-сек анализ был выполнен на этих двух популяций и по сравнению к клеткам линии DP T, дифференцированным с помощью OP9/DLL1 (DP) и первичных наивных CD8и Pmel T-клеток. Выражение 102 генов, которые играют решающую роль в Т-клеток онтогена, тимоцитов активации, и формирование памяти были проанализированы15,20,21,22. Основной компонент анализа этих четырех изученных популяций показал, что экстратимически генерируемые DP и CD8SP T-клетки сгруппированы вместе, в то время как iTE сгруппированы ближе к наивным Т-клеткам(рисунок 5). В совокупности эти данные показывают, что iTE имеет фенотип ближе к наивным Т-клеткам, чем т-линии клеток, генерируемых экстратимическими методами.

figure-results-4246
Рисунок 1 : Схематический обзор дифференциации iPSC к iTE с использованием OP9/DLL1 и 3D тимической культуры. Протокол включает в себя три отдельных шага дифференциации; (Слева) от клеток iPSC к гематопоитетической линии клеток на OP9/DLL1 (день от 0 до 6), (Средний) от гематопоиетических клеток линии до незрелых Т-клеток на OP9/DLL1 с цитокинов (день 6 до 16-21), и (справа)от незрелых Т-клеток (день 16-21) до iTE с использованием 3D тимической системы культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-5138
Рисунок 2 : Иммуногистохимия тимических долей, посеянных с незрелыми Т-клетками, полученными iPSC. Вверху: H и E окрашивание тимической доли с и без посева iPSC полученных незрелых Т-клеток. От второго сверху вниз: конфокальные изображения разделенных долей, окрашенных DAPI (ядро), CD3 (T ячейка), и слияния. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

figure-results-5844
Рисунок 3 : iTE показывает посттимичный фенотип Т-клеток. (A) АНАЛИЗы FACS тимоцитов, экстрагимических Т-клеток (система сокультуры OP9/DLL1) и Pmel-iTE. Клетки в живых клетках были закрыты на конгенивных CD45. Популяции CD8 SP были дополнительно проанализированы для выражения CD62L и MHC-I. (B) Среднее количество CD8SP CD45.1 iTE производится на ночь на доли 7 дней после предварительного посева. Данные были собраны в ходе 12 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

figure-results-6721
Рисунок 4 : iTE производят различные цитокины путем антиген-специфической стимуляции. FACS анализирует внутриклеточную выработку цитокинов iTE. iTE были совместно культивированы с БТР предварительно загружены нерелевантных (нуклеопротеин) или коньяк (hgp100) пептид в течение трех дней. Цифры, показанные в верхних правых квадрантах, указывают на проценты iTE, производящего цитокин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

figure-results-7480
Рисунок 5 : Анализ всего транскриптома показывает сдвиг в экспрессии гена iTE в сторону наивного CD8 + T-клеточная программа. Принцип анализа компонентов (PCA) данных РНК-сек из DP, экстратимических CD8 SP, iTE и наивных Т-клеток. (Анализ 102 генов, связанных с тимической дифференциацией с использованием общедоступной базы данных GSE105110) 15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Обсуждение

Использование T-iPSC для регенерации опухолевых антиген-специфических Т-клеток может преодолеть многие из нынешних препятствий ACT путем создания молодых клеток с улучшенной настойчивостью. Хотя несколько методов с использованием OP9/DLL1 совместной культуры системы, как сообщается, генерировать CD8 SP-клеток6,7,10,13, которые выражают CD8 молекул и опухолевых антигенов конкретных TCRs, глобальный ген шаблоны выражения и функциональный анализ показывают, что эти экстратимически регенерированные клетки CD8 SP отличаются от наивных Т-клеток(рисунок 4). Здесь мы описываем 3D тимическую систему культуры, которая может генерировать iPSC полученных тимических эмигрантов (iTE) с высокой точностью и однородность из murine T-iPSC. iTE напоминают наивные Т-клетки в глобальной модели экспрессии генов и в функциональности, таких как формирование памяти и противоопухолевый эффект in vivo против установленной опухоли15.

Классическая система FTOC является способом повторения тимического отбора in vitro. Он был использован для изучения внутритимического развития тимоцитов23, и Есть несколько сообщений fTOC используется для создания RTE24. Тем не менее, система FTOC имеет ряд ограничений. Для того чтобы отсутсвие кислорода в искусственничной культуре органа, несколько групп использовали или semi-сухую культуру основанной мембраны23,или системы культуры субмерии кислорода25. Однако никакие современные методы не могут постоянно генерировать однородную популяцию посттимических Т-клеток. Чтобы преодолеть ограничения классической системы FTOC, мы разработали 3D тимическую систему культуры, которая обеспечивает технические усовершенствования по сравнению с обычными методами15. Например, использование нашего метода 3D тимической культуры, максимального обмена кислородом и отсутствия поверхностно-логов механического стресса держать тимские доли в более физиологической среде. Кроме того, долгосрочная культура позволяет зрелым Т-клеткам естественным образом выйти из тимических долей. Наконец, наблюдение в реальном времени и микроманипуляции позволяют обмениваться средствами массовой информации и постоянной коллекции iTE без физического нарушения тимических долей. Таким образом, метод 3D тимической культуры обеспечивает значительные технические усовершенствования, а также возможность изучения тимически выбранных наивных Т-клеток, которые ранее не были доступны.

Есть несколько ключевых моментов для успешного поколения iTE с помощью этой 3D тимской системы культуры. Качество УСЛОВИй FBS и культуры имеет решающее значение для поддержания расширения OP9/DLL1 ячеек, не теряя при этом их способности поддерживать дифференциацию iPSC. Поэтому мы рекомендуем предварительной оценки fbS много, а также последовательно прохождения на 80% confluency для предотвращения клеточной дифференциации и сенесценции. Кроме того, культура слияния OP9/DLL1 необходима для дифференциации iPSC в незрелые Т-клетки, так как различия в выпуклости могут повлиять на их эффективность. Наконец, эмбриональный возраст тимических долей имеет решающее значение для поколения iTE. Рекомендуем использовать E14.5 - 15,5 тыс. долей.

Как и в случае с любым новым протоколом, этот метод имеет ограничения и подлежит совершенствованию. Представленная здесь техника культуры в течение двух недель составляет около 1000 iTE на тимическую мебу. Увеличение генерации iTE может быть возможно с дальнейшими изменениями, включая оптимизацию концентрации кислорода, объема мультимедиа и типа 3D-культурной пластины. Добавление или удаление цитокинов, а также изменения концентрации цитокинов, также может способствовать повышению урожайности iTE.

Учитывая, что 3D тимическая система культуры, представленная здесь, может генерировать тимических эмигрантов в полностью ex vivo системы, этот метод может быть применен к различным иммунологических и приемных клеток передачи научно-исследовательских проектов, включая, но не ограничивайтесь T дифференциация клеток, посттимичное созревание Т-клеток и генерация антиген-специфических Т-клеток гематопоиетического прародителя или стволовых клеток. Хотя этот метод непосредственно не применим к пробам человека, iTE и система 3D тимской культуры имеют большой потенциал для выяснения молекулярных механизмов положительного и отрицательного отбора и могут способствовать созданию системы культуры, которая позволяет поколение клинически релевантных опухолевых антигенов конкретных наивных Т-клеток для АКТ.

Раскрытие информации

Авторы Рауль Визкардо, Николас Д. Клемен и Николас. Рестифо являются изобретателями на рассмотрении международной патентной заявки PcT/US2017/65986, поданной 13 декабря 2017 года под названием Методы подготовки изолированного или очищенного населения тимических эмигрантских клеток и методы лечения с использованием того же ".

Благодарности

Мы благодарим Хироси Кавамото и Кёко Масуда за любезное предоставление линии клеток OP9/DLL1. Мы благодарим Алана Б. Хуферинга и Эрину З. Он за графическую помощь. Это исследование было поддержано Intramural исследовательской программы Национального института рака США (ЗИА BC010763) и рак Moonshot программы для Центра клеточной терапии в NCI, NIH. Работа также была поддержана Фондом семьи Мильштейнов.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
2-deoxyguanosineSigma-Aldrich312693-72-4
2-Mercaptoethanol (1,000x)Thermo Fisher Scientific21985-023
ACK Lysing BufferGibcoA1049201
Ascorbic acid Sigma-AldrichA8960
BlasticidinThermo Fisher ScientificR21001
FBSGemini100-500
Flt-3 ligandR&D Systems427-FL
GlutaMAX (100x)Thermo Fisher Scientific35050-061
hgp100Genscript282077-1, KVPRNQDWL
Interleukin-2R&D Systems402-ML
Interleukin-7R&D Systems407-ML
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140050
MEM powderGibco61100061
MonothioglycerolSigma-AldrichM-6145
NucleoproteinGlobal PeptidesASNENMETM
Penicillin/streptomycinThermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)Thermo Fisher Scientific10010-023
PuromycinThermo Fisher ScientificA1113803
RPMI 1640Gibco11875093
Sodium PyruvateThermo Fisher Scientific11360-070
Stem Cell Factor (SCF)R&D Systems455-MC
Stemfactor LIF, Mouse RecombinantSTEMGENT03-0011-100
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher Scientific25300-062
Cell Culture Vessels and others
10 cm dishCorning, Inc. 353003
12 mL SyringeCovidien Monoject22-652-090
6 well plateCorning/Coster3516
Cell strainer 100 μmFisher Scientific22-363-549
Cell strainer 40 μmFisher Scientific22-363-547
ForcepsDUMONT0108-5PO
Lab soaker matVersi-DryCat. EF2175CX 74018-00
Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam) WhatmanWHA7408004 ALDRICH
Perfecta3D Hanging Drop PlateSigma-AldrichHDP1096
U Bottom 96 well plateCorning/Coster3799
Experimental Cell lines
CD3-iPSCVizcardo et al., Cell Report 2018N/A
MEF-iPSCVizcardo et al., Cell Report 2018N/A
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)ATCCSCRC-1040; RRID:MGI:5007926
OP9/N-DLL1Riken Bioresource centerCat# RCB2927; RRID:CVCL_B220
Pmel-iPSCVizcardo et al., Cell Report 2018N/A
Experimental mouse models
B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl Charles RiverStrain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564
C57BL/6NNCI/Charles RiverN/A
Pmel-1 miceOverwijk et al.J Exp Med 198(4):569-80
Antibodies
Anti-aTCRBiolegend109202; RRID:AB_313425
Anti-CD3abcamab11089; RRID:AB_369097
Anti-CD4BD Biosciences553730; RRID:AB_395014
Anti-CD44BD Biosciences559250; RRID:AB_398661
Anti-CD45.1BD Biosciences553775; RRID:AB_395043
Anti-CD45.2BD Biosciences553772; RRID:AB_395041
Anti-CD62LBD Biosciences560516; RRID:AB_1645257
Anti-CD69BD Biosciences552879; RRID:AB_394508
Anti-CD8aBD Biosciences557959; RRID:AB_396959
Anti-CD8bBD Biosciences550798; RRID:AB_393887
Anti-H-2KbBD Biosciences553570; RRID:AB_394928
Anti-IFN-g BD Biosciences557998; RRID:AB_396979
Anti-IL-2BD Biosciences554428; RRID:AB_395386
Anti-TCRbThermo Fisher Scientific35-5961-81; RRID:AB_469741
Anti-TCRVb13BD Biosciences553204; RRID:AB_394706
Anti-TNFaBD Biosciences557644; RRID:AB_396761

Ссылки

  1. Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
  2. Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
  3. Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320-323 (2016).
  4. Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. Reprogramming antitumor immunity. Trends of Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).
  5. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  6. Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
  7. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
  8. Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus. Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).
  9. Yamagata, T., Mathis, D., Benoist, C. Self-reactivity in thymic double-positive cells commits cells to a CD8 alpha alpha lineage with characteristics of innate immune cells. Nature Immunology. 5 (6), 597-605 (2004).
  10. Themeli, M., et al. Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy. Nature Biotechnology. 31 (10), 928-933 (2013).
  11. Serwold, T., Hochedlinger, K., Inlay, M. A., Jaenisch, R., Weissman, I. L. Early TCR expression and aberrant T cell development in mice with endogenous prerearranged T cell receptor genes. Journal of Immunology. 179 (2), 928-938 (2007).
  12. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).
  13. Maeda, T., et al. Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity. Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).
  14. Serwold, T., et al. T-cell receptor-driven lymphomagenesis in mice derived from a reprogrammed T cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (44), 18939-18943 (2010).
  15. Vizcardo, R., et al. Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System. Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).
  16. Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-treated thymus organ cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
  17. Hamazaki, Y., Sekai, M., Minato, N. Medullary thymic epithelial stem cells: role in thymic epithelial cell maintenance and thymic involution. Immunological Reviews. 271 (1), 38-55 (2016).
  18. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  19. Rosen, S. D. Ligands for L-selectin: homing, inflammation, and beyond. Annual Review of Immunology. 22, 129-156 (2004).
  20. Hogquist, K. A., Xing, Y., Hsu, F. C., Shapiro, V. S. T Cell Adolescence: Maturation Events Beyond Positive Selection. Journal of Immunology. 195 (4), 1351-1357 (2015).
  21. Best, J. A., et al. Transcriptional insights into the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation. Nature Immunology. 14 (4), 404-412 (2013).
  22. Schmitz, I., Clayton, L. K., Reinherz, E. L. Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo. International Immunology. 15 (10), 1237-1248 (2003).
  23. Nitta, T., Ohigashi, I., Takahama, Y. The development of T lymphocytes in fetal thymus organ culture. Methods in Molecular Biology. 946, 85-102 (2013).
  24. Ueno, T., et al. Role for CCR7 ligands in the emigration of newly generated T lymphocytes from the neonatal thymus. Immunity. 16 (2), 205-218 (2002).
  25. Watanabe, Y., Katsura, Y. Development of T cell receptor alpha beta-bearing T cells in the submersion organ culture of murine fetal thymus at high oxygen concentration. European Journal of Immunology. 23 (1), 200-205 (1993).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1503D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены