Одноместный клеточной РНК последовательности нейронов дневно обозначенные мыши, с помощью ручной сортировки и двойной в Vitro транскрипция с абсолютной Счетчики виртуализации (дива Seq)

Резюме

Этот протокол описывает ручной сортировки процедура изолировать одно дневно обозначенные нейронов, следуют в vitro на основе транскрипции мРНК усилители для высоких глубина одноклеточных РНК последовательности.

Аннотация

Одноклеточных последовательности РНК (РНК seq) теперь является широко используемым инструментом для assaying экспрессии генов. Коммерчески доступных платформ одноклеточных РНК последовательности процесса всех входных клетки без разбора. Иногда активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) вверх по течению используется для изоляции специально обозначенные населения интерес. Ограничение СУИМ является необходимость большого числа ячеек ввода с значительно помечены фракций, которые нецелесообразно сбора и профилирование популяций редких или малонаселенных помечены нейрон от мозга мыши. Здесь мы описываем метод для вручную собирать разреженные дневно помечены одного нейроны от свежего отделить ткани мозга мыши. Этот процесс позволяет для захвата однокомпонентным нейронов с высокой чистоты и последующей интеграции с в vitro транскрипция на основе усиления протокол, который сохраняет эндогенного Стенограмма соотношения. Мы описываем двойной линейные усилители метод, который использует уникальные молекулы идентификаторы (UMIs) для создания индивидуальных счетчиков мРНК. Два раунда результатов амплификации в высокой степени обнаружения генов в одной ячейке.

Введение

Одноклеточных последовательности РНК (РНК seq) превратил транскриптомики исследований. В то время как крупномасштабные одноклеточных RNAseq могут быть выполнены с использованием различных методов, таких как капельки^1,2, микрофлюидика³,⁴nanogrids и microwells⁵, большинство методов нельзя сортировать типы определенных клеток Это Экспресс генетически закодированный флуорофоров. Чтобы изолировать население выделите ячейку, активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) часто используется для сортировки помечены клетки в режиме одной ячейки. Однако СУИМ имеет некоторые ограничения и требует тщательной образца шаги обработки. Во-первых, большое количество ячеек ввода, как правило необходимо (часто несколько миллионов клеток / мл), значительная часть (> 15 – 20%) содержащий помечены населения. Во-вторых подготовка клетки может потребовать несколько раундов плотности градиентного центрифугирования шаги для удаления глиальных дроби, мусора и клеток сгустки, которые в противном случае может засорить сопла или потока ячейки. В-третьих СУИМ обычно работают, окрашивание и минигелей шаги для жить/мертвые окрашивание (например, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), пропидий йодидом (PI) и Cytotracker красителей), которые занимают дополнительное время. В-четвертых как правило для сортировки (например, DAPI и зеленый/красный флуоресцирующий белок (GFP/ППП)), обычно два образца-двухцветный и один элемент управления необходимы, требующих немеченого образец должен обрабатываться в дополнение к желаемой мыши штамма. В-пятых фильтрация часто выполняется несколько раз до и во время пример сортировки proactively предотвратить засорение образец линии в машине СУИМ. В-шестых необходимо выделено время, в наиболее часто используемых настроек СУИМ для инициализации и стабилизировать потоком жидкости и калибровки капли. Седьмой, управления, образцы обычно выполняются в последовательности до фактической проб настроить компенсации матрицы, Дуплет отказ, либо установка ворот, пользователей и т.д. выполните шаги, шесть и семь себя раньше времени или требуют помощь специалиста параллельно. Наконец, пост СУИМ, часто есть шаги, чтобы обеспечить, что только надписью одной клетки присутствуют в каждой скважине; к примеру путем проверки пробы в высоким содержанием скрининг установки, такие как Быстрый плита тепловизор.

Обойти шаги, описанные выше и облегчения относительно быстро, целевые последовательности небольшой численностью населения одного дневно обозначенные нейронов, мы описываем ручной сортировки процедуры следуют два раунда высокочувствительный в пробирке амплификация протокол, называемый двойной in vitro транскрипция с абсолютной Счетчики виртуализации (дива-Seq). РНК амплификации и кДНК библиотеки поколения адаптированы из Eberwine и др. ⁶ и Hashimshony и др. ⁷, с некоторыми изменениями с учетом интернейронов мыши, которые имеют меньше сотовой томов; Кроме того мы также обнаружили, что это одинаково полезны для возбуждающих пирамидных нейронов.

протокол

Все процедуры, включая животных темы были одобрены IACUC холодной весны гавани лаборатории, Нью-Йорк (IACUC #16-13-09-8).

1. Ручная сортировка дневно обозначенные мыши нейронов

1. Тянуть стекло microcapillaries (см. Таблицу материалы) до 10-15 µm выхода диаметр с помощью капиллярного съемник со следующими параметрами: тепла: 508, тянуть: пустой, vel: пустой, время: пустой.
2. Прикрепите 120 – 150 см гибкие Силиконовая трубка (~0.8 мм внутренний диаметр) до 0,2 мкм винилидена фторид (PVDF) мембранный фильтр шприц и двусторонний трубопровода клапан с помощью подходящей трубки разъемы.
3. Подготовка 500 мл охлажденного (4 ° C) искусственный спинномозговой жидкости (ФАГО, Таблица 1) и кислородом, восходящей 5% двуокиси углерода сбалансированный кислорода через распылитель для 15 минут или до тех пор, пока решение полностью очищает.
4. Подготовка 100 мл фаго с коктейлем блокаторы активности в 150 мл стакан (Таблица 1).
5. Подготовка 100 мл фаго с 1 мг/мл Streptococcus фракция IV протеазы в 150 мл стакан (Таблица 1).
6. Подготовка 100 мл фаго с 1% раствором плода бычьим сывороточным (ФБС) в 150 мл стакан и кислородом с 5% двуокиси углерода сбалансированный кислорода через распылитель.
7. Вскрыть мозг от Усыпленных мыши, открыв черепа с небольшой ножницами и извлечения свежих мозга с помощью тонкой пинцет без повреждения коры.
   Примечание: Мыши любой штамм, возраста и пола может быть использован как пожелано. Не заморозить мозг или выполнить ручной сортировки на мышах, вводится с вирусов или других опасных/инфекционных агентов.
8. Держите мозга в охлажденной и кислородом фаго, оставляя распылитель, придает кислород баланс углекислого газа 5% в течение всего срока секционирование.
9. Поместите мозг на Чак vibratome и вырезать коронковой или сагиттального секций на 300 µm толщиной. Собрать столько разделов, необходимых для получения как минимум ~ 10 – 50 помечены клетки до нескольких сотен клеток. Положите ломтики на хлопок ячеистой ломтик держатель, помещены внутри стакан, так что они купаются в насыщенной кислородом фаго.
10. Перенесите ломтики свежих в стакан, содержащие фаго активности блокаторы и блок для 15 – 20 минут при комнатной температуре. Держите восходящей кислорода, используя распылитель.
11. Переместить ломтики в стакан, содержащие фаго раствором протеазы для выполнения мягкая пищеварение при комнатной температуре: 20 – 30 мин для P4-14 животных или до 45-60 мин для животных P28-56. Держите восходящей кислорода.
12. Промойте фаго с протеазы путем перемещения фрагментов обратно в стакан, содержащие фаго раствором блокаторы активности 5-10 мин при комнатной температуре. Держите восходящей кислорода.
13. Переместить отдельные разделы в чашке Петри 100 мм, содержащие фаго с 1% FBS при комнатной температуре. Под областью флуоресцентные рассечение, microdissect районах и слои интерес иметь минимум 10-50 клеток (до нескольких сотен). Выполните microdissection с парой из тонкой щипцами или путем присоединения 22 – 28 G инъекций иглами на деревянный держатели (шашлык).
14. С помощью пипетки Пастера, переместить microdissected штук в трубу отцентрифугировать 2 мл, содержащих ~0.8 мл 1% FBS в фаго решения.
15. Нарезанных Иссеченную ткань в трубке отцентрифугировать при комнатной температуре. Сделайте три длинных стеблях пипетки Пастера с уменьшением диаметра выхода путем прокатки их над открытым пламенем. Выполнять ~ 10 ударов с каждой пипетку, начиная с крупнейших и заканчивая самым маленьким.
16. Обойтись диссоциированных клетки в чашке Петри 100 мм, содержащие кислородом Фаго (Петри может быть тонко покрытием с 5 мм агар 1% или четкие силиконовые смеси в 1:10 соотношение, по желанию). Храните при комнатной температуре.
17. Ждать ~ 5-7 мин для клеток постепенно урегулировать, а затем наблюдать GFP/ППП сигнал под микроскопом рассечение.
    Примечание: Отдельные клетки, мусора и небольшие сгустки будет видна в ярко поле (BF).
18. Выберите 10-15 GFP/ППП клетки одновременно с помощью капиллярные пипетки (из шага 1.1) придает гибкие Силиконовая трубка (0,4 – 0,8 мм внутренний диаметр) и распределить клетки в чашке Петри 100 мм, содержащий свежие кислородом фаго.
19. Блокируя конец трубопровода клапан с языком, позиция капилляра близко к клетке интерес. Захват клеток с использованием капиллярность после снятия блока и быстро блокировать снова, чтобы предотвратить проникновение пипеткой лишней жидкости. Отказаться от клетки на 100 мм Петри блюдо со свежими кислородом фаго продувкой осторожно, соблюдая кончик капилляров под флуоресцентным оптики микроскопа рассечение. Цель собрать ~ 100 – 150 клеток всего.
20. Повторите шаг 1.19 один или два раза больше (в зависимости от мусора) и передачи в общей сложности ~ 50 – 75 клетки к новой Петри 100 мм, убедившись, что такие загрязнители, как мусор, являются минимальными в ярко поле дифференциальной помехи контраст (DIC) оптика.
21. Наконец с помощью пипетки свежие микрокапиллярной каждый раз, выберите одну ячейку в не более чем 0,5 мкл объем и выслать его в единый 0.2 мл отцентрифугировать (или одну полоску восьми трубок отцентрифугировать 0,2 мл) содержащий 1 мкл пример коллекции буфера с праймерами N10B1-N10B96 (Таблица 2). Разорвать наконечник пипетки в трубке отцентрифугировать чтобы ячейка остается в буфере коллекции. Отказаться от пипетки.
22. Заморозить клетки, поставив трубы на сухой лед и хранение их долгосрочные в морозильной камере-80 ° C до тех пор, пока они готовы быть обработаны для амплификации РНК.

2. Первый раунд РНК усилители

Примечание: Следующая процедура предназначена для одной полосы восьми трубок отцентрифугировать 0,2 мл. Масштаб реакции при необходимости.

1. Синтезировать первая прядь cDNA (первый раунд).
   1. Тепла полосы от шага 1,22 на 70 ° c за 5 мин, затем 4 ° c за 5 мин; Повторите дважды.
   2. Монтаж на льду обратной транскриптазы (RT) Мастер микс/перв стренги синтеза Мастер микс используя следующие ингредиенты (см. Таблицу материалы): 10 x буфер перв стренги (2 мкл), dNTP смеси (4 мкл), АБС битор РНКазы (1 мкл) и фермента (1 мкл).
   3. Кратко центрифуга газа на настольная центрифуга собрать все в нижней части. Держите на льду.
   4. 1 мкл RT Мастер микс/перв стренги синтеза мастер смеси выше трубы (общий объем 1 мкл пример буфера из коллекции клеток + 1 мкл RT = 2 мкл/трубки). Смешайте хорошо закупорить. Кратко раскрутить, чтобы собрать все содержимое внизу и сохранить его на льду.
   5. Инкубируйте выше трубка/s при 42 ° C на 2 часа в духовке воздуха. Положите трубы на льду незамедлительно прекратить реакции и перейдите к шагу второй стренги синтеза.
2. Синтезировать второй стренги cDNA (первый раунд).
   1. Сделать второй стренги главный микс (80 мкл) на льду в следующем порядке в 1,5 мл: нуклеиназы свободной воды (63 мкл), 10 x второй стренги буфера (10 мкл), dNTP смеси (4 мкл), ДНК-полимеразы (2 мкл) и RNaseH (в 1 мкл). Смешайте ингредиенты хорошо, vortexing, а затем спина для сбора на дне и держать на льду.
   2. Начать тепловая велосипедист, запустите следующую программу для предварительного охлаждения блока, будьте готовы начать шаг 2.2.3 (крышка тепла = выкл; 16 ° C 2 h, 4 ° C hold) и пауза в 16 ° C.
   3. Добавьте 80 мкл/газа (или 10 мкл/трубка) второй стренги мастер смеси для каждой трубы газа и держать на льду. Передать газа тепловая велосипедист и возобновить шаг 16 ° C, инициировал выше. Инкубировать газа втечение 2 ч при температуре 16 ° C.
   4. После Шаг второй стренги синтеза место трубы на льду для перехода к следующему шагу очистки cDNA.
3. Очистить двойной мель cDNA (первый раунд).
   Примечание: Все centrifugations выполняются на ~ 8000 x g при комнатной температуре. Никогда не превышает 16 000 x g, чтобы избежать повреждения картриджа фильтра.
   1. Начало, Отопление 100 мкл нуклеиназы свободной воды до 50-55 ° C для последующего использования в блоке сухой Отопление. Никогда не превышайте 58 ° C для предотвращения частичного денатурации cDNA.
   2. Добавьте 250 мкл буфера привязки cDNA в 1,5 мл. Проверить наличие осадка в буфере, а затем теплый буферного раствора до 37 ° C 10 мин распустить преципитаты повторно.
   3. Передать cDNAs из одной полосы 8-трубки буфера привязки cDNA. Объединить ячейки в этом шаге, для дальнейшего технологических процессов (8 клеток в 1 тюбик). Смесь тщательно, закупорить 2 - 3 раза и стряхивая 3 - 4 раза. Спина для сбора содержимого на дне.
   4. Вставьте картридж фильтра cDNA в мыть трубы (от в vitro транскрипция (IVT) набор) твердо. Добавьте выше смеси в центр фильтра. Центрифуга на 8000 x g ~ 1 мин, или до тех пор, пока это через фильтр. Отказаться от потока через и заменить трубки мыть.
   5. Добавьте 500 мкл буфера мыть из комплекта ИВТ в столбце.
      Примечание: Убедитесь, что что этанол добавлен в буфер мыть ранее.
   6. Центрифуга на 8000 x g ~ 1 мин, или до тех пор, пока это через фильтр. Отбросить проточных и центрифуги снова на 8000 x g ~ 1 мин для пустого картриджа.
   7. Передать фильтр cDNA cDNA элюции трубки (1,5 мл свободной от нуклеиназы трубки). Обратиться в центр фильтра 8.5 мкл подогретым нуклеиназы свободной воды. Подождите 2 мин и центрифуги на 8000 x g ~1.5 мин.
   8. Элюировать снова с 8,5 мкл подогретым нуклеиназы свободной воды и немедленно приступить к первого раунда ИВТ.
      Примечание: Double-stranded cDNA тома для восстановления будет ~ 16 мкл.
4. Выполнить в vitro транскрипция (IVT) реакция усиливается РНК (Арна) продукции из кДНК (первый раунд).
   1. Установить печь гибридизации воздуха до 37 ° C.
   2. Подготовка мастер смесь для ИВТ на льду в следующем порядке: для 16 мкл eluted двойной мель cDNA от шага 2.3.8, добавить 4 мкл раствора АТФ T7 (75 мм); 4 мкл раствора T7 CTP (75 мм); 4 мкл раствора T7 GTP (75 мм); 4 мкл раствора T7 UTP (75 мм); 4 мкл T7 10 x буфер реакции; и 4 мкл T7 фермент смесь. Хорошо перемешайте, спина и держать на льду.
   3. Мкл 24 IVT мастер смеси для каждой трубы, содержащий 16 мкл cDNA. Смешайте содержимое, закупорить мягко и тщательно. Инкубируйте трубки при 37 ° C для 14 h.
      Примечание: Инкубации для < 12 h серьезно влияет на урожайность.
   4. Добавьте 60 мкл-диэтил pyrocarbonate (не DEPC) очищенной воды, RNase свободной, повышайте громкость до 100 мкл и остановить IVT реакции.
5. Очищайте Арна.
   Примечание: Все centrifugations выполняются на ~ 8000 x g при комнатной температуре. Никогда не превышает 16 000 x g, чтобы избежать повреждения картриджа фильтра.
   1. Начните, Отопление ~ 200 мкл нуклеиназы свободной воды до 50-55 ° C для последующего использования в сухой Отопление блока или ПЦР машины. Никогда не превышайте 58 ° C для предотвращения частичного денатурации Арна.
   2. Арна передачи в 1,5 мл трубку свободной от нуклеиназы. Мкл 350 Арна привязки буфера для каждого образца Арна. 250 мкл 100% этанола для каждой трубки и смешать с 3 раза, дозирования (ДУ не вихревой смешивать и спина).
   3. Передача смеси немедленно в столбце Очистка РНК, добавив его аккуратно в центре картриджа фильтра. Центрифуга на 8000 x g ~ 1 мин, или до тех пор, пока смесь полностью прошел фильтр. Отказаться от потока через и повторно использовать трубки сбора отходов
      Примечание: РНК начнет осаждения при добавлении этанола.
   4. 650 мкл буфера мытья, для каждого картриджа фильтра. Центрифуги для ~ 1 мин на 8000 x g или до тех пор, пока весь буфер прошло. Отказаться от потока через и спина фильтры для дополнительной ~ 1 мин для удаления следов мыть буфера.
   5. Передать фильтр свежие Арна коллекции трубки. 100 мкл предварительно нагретой воды, свободной от нуклеиназы (50-55 ° C), к центру фильтра. Подождите 2 минуты, а затем центрифуги для ~1.5 мин на 8000 x g или до тех пор, пока он прошел в коллекции трубку.

3. Второй раунд усилители

1. Синтезировать первый cDNA стренги (второй раунд).
   1. Арна передачи от шаг 2.5.5 трубу 200 мкл отцентрифугировать и вакуум сосредоточить 100 мкл elutant до 10 мкл. Использование нет тепла, запустить вакуумные концентратор для 65 мин по сравнению с 10 мкл воды в 200 мкл трубки для оценки сокращения объема.
   2. Разогреть духовку гибридизации воздуха до 42 ° C.
   3. Добавить 2 мкл праймеров случайных hexamer из комплекта IVT Арна, вихревой кратко и спина для сбора содержимого.
   4. Инкубировать отцентрифугировать трубки при 70 ° C для 10 мин в тепловая велосипедист, а затем поместить его на льду.
   5. Приготовить следующую смесь мастер RT: 2 мкл 10 x первый буфер синтеза прядь, 4 мкл dNTP смеси, 1 мкл АБС битор РНКазы и 1 мкл ArrayScript фермента. Смесь хорошо в трубу отцентрифугировать 200 мкл, мягко vortexing, затем спина для сбора содержимого и место на льду.
   6. Добавить 8 мкл RT мастер смесь (первая прядь) к каждой пробке отцентрифугировать. Место труб в инкубатор воздуха 42 ° C на 2 ч.
   7. 1 мкл RNaseH, выше реакции. Смесь хорошо, закупорить 2 - 3 раза и стряхивая 3 - 4 раза и спина для сбора содержимого. Инкубируйте при 37 ° C за 30 минут на машине ПЦР. После инкубации переходите к шагу второй стренги синтеза немедленно.
2. Синтезировать второй стренги cDNA (второй раунд).
   1. 3 мкл T7-RA5 грунт (на 25 нг/мкл рабочего разрежения, Таблица 2) и 2 мкл РНКазы бесплатный воды для каждого образца cDNA. Хорошо перемешать и спина для сбора содержимого.
   2. Инкубируйте на 70 ° C для 10 мин в тепловая велосипедист. Место реакции на льду.
   3. Подготовка мастер RT mix (второй стренги) на льду: 58 мкл нуклеиназы свободной воды, 10 мкл 10 x второй стренги буфера, 4 мкл dNTP смеси и 2 мкл ДНК-полимеразы. Смешайте хорошо vortexing и спина для сбора содержимого. Держите на льду.
   4. Мкл 74 выше смеси для каждой трубы из шага 3.2.2. Смесь хорошо, закупорить 2 – 3 раза и стряхивая 3 - 4 раза, затем спина для сбора содержимого. Держите на льду и удерживайте.
   5. Предварительно охладите тепловая велосипедист до 16 ° C, отключив крышкой тепла. Место труб в тепловой циклователь втечение 2 ч при температуре 16 ° C.
   6. После Шаг второй стренги синтеза место трубы на льду перейти к шагу очистки cDNA, или заморозить при температуре-20 ° C.
      Примечание: cDNA очистки рекомендуется перед замораживанием.
3. Выполнение очистки cDNA (второй раунд).
   Примечание: Все centrifugations выполняются на ~ 8000 x g при комнатной температуре. Никогда не превышает 16 000 x g, чтобы избежать повреждения картриджа фильтра.
   1. Начало нагрева нуклеиназы свободной воды до 50-55 ° C для последующего использования в блоке сухой Отопление. Никогда не превышайте 58 ° C для предотвращения частичного денатурации cDNA.
   2. Передача cDNA в 1,5 мл трубку свободной от нуклеиназы. Добавьте 250 мкл буфера cDNA привязки к каждой трубе. Проверить наличие осадка в буфере и теплый буферного раствора до 37 ° C 10 мин распустить повторно. Смесь тщательно, закупорить 2 – 3 раза и стряхивая 3 - 4 раза. Спина для сбора содержимого.
   3. Прочно поставьте картридж фильтра cDNA трубы мыть. Добавьте выше смеси в центр фильтра. Центрифуга на 8000 x g ~ 1 мин, или до тех пор, пока это через фильтр. Отказаться от потока через и заменить трубки мыть.
   4. 500 мкл буфера мытья. Убедитесь, что этанол добавлен в буфер мыть ранее. Центрифуга на 8000 x g ~ 1 мин, или до тех пор, пока это через фильтр.
   5. Отказаться от потока через и снова центрифуги на 8000 x g ~ 1 мин для пустого картриджа. Передать трубку элюции cDNA cDNA фильтр.
   6. Обратиться в центр фильтра 8.5 мкл подогретым нуклеиназы свободной воды. Подождите 2 мин и центрифуги на 8000 x g ~1.5 мин Elute снова с дополнительной 8.5 мкл подогретым нуклеиназы свободной воды.
      Примечание: Double-stranded cDNA тома для восстановления будет ~ 16 мкл.
   7. Немедленно приступить к второй раунд ИВТ или заморозить cDNA в-20 ° C на ночь.
4. Выполните второй раунд Арна производства ИВТ.
   1. Установить печь гибридизации воздуха до 37 ° C (setpoint 36 ° C).
   2. Подготовка мастер смесь для ИВТ на льду в следующем порядке: для 16 мкл eluted двойной мель cDNA от шага 3.3.7, добавить 4 мкл раствора АТФ T7 (75 мм); 4 мкл раствора T7 CTP (75 мм); 4 мкл раствора T7 GTP (75 мм); 4 мкл раствора T7 UTP (75 мм); 4 мкл T7 10 x буфер реакции; и 4 мкл T7 фермент смесь. Хорошо перемешайте, спина кратко для сбора содержимого и держать на льду.
   3. Мкл 24 IVT мастер смеси для каждой трубы, содержащий 16 мкл cDNA. Смешайте содержимое, закупорить мягко и тщательно. Инкубируйте трубки при 37 ° C для 14 h.
      Примечание: Инкубации для < 12 h серьезно влияет на урожайность.
   4. Добавьте 60 мкл не DEPC очищенной воды, RNase свободной, повышайте громкость до 100 мкл и остановить IVT реакции.
5. Выполнение очистки Арна (второй раунд).
   Примечание: Все centrifugations выполняются на ~ 8000 x g при комнатной температуре. Никогда не превышает 16 000 x g, чтобы избежать повреждения картриджа фильтра.
   1. Начните, Отопление ~ 200 мкл нуклеиназы свободной воды до 50-55 ° C для последующего использования в сухой Отопление блока или ПЦР машины. Никогда не превышайте 58 ° C для предотвращения частичного денатурации Арна.
   2. Передать Арна 1,5 мл трубки свободной от нуклеиназы. Мкл 350 Арна привязки буфера для каждого образца Арна. 250 мкл ACS класс 100% этанола для каждой трубки и смешайте 3 раза дозирования (ДУ не вихревой смешивать и спина).
      Примечание: РНК начнет осаждения при добавлении этанола.
   3. Передача смеси немедленно в столбце Очистка РНК, добавив его аккуратно в центре картриджа фильтра. Центрифуга на 8000 x g ~ 1 мин, или до тех пор, пока смесь полностью прошел фильтр. Отказаться от потока через и повторно использовать трубки сбора отходов.
   4. 650 мкл буфера мытья, для каждого картриджа фильтра. Центрифуги для ~ 1 мин на 8000 x g или до тех пор, пока весь буфер прошло. Отказаться от потока через и спина фильтры для дополнительной ~ 1 мин для удаления следов мыть буфера.
   5. Передать трубку коллекции свежих Арна фильтры. Добавьте 100 мкл предварительно нагретой воды, свободной от нуклеиназы центр фильтра. Подождите 2 минуты, а затем центрифуги для ~1.5 мин на 8000 x g или до тех пор, пока он прошел.
   6. Аликвота 2 мкл в трубку для спектрофотометр (на длине волны 260 Нм) и bioanalyzer распространение анализов для проверки Арна урожайности и качества.
      Примечание: Концентрация должна быть по крайней мере 5 нг/мкл; в противном случае отвергают образца. Образец может храниться на ~ 1 год-80 ° C. Избегайте замораживания оттаивания образцов.
   7. Проверьте образцы с использованием bioanalyzer для визуализации надлежащего распространения Арна продуктов после производителя протокол (рис. 2).

4. усиленный РНК фрагментации и очистки

1. Смешайте следующие на льду (общий объем 40 мкл, объединить 2 трубы Арна non перекроя образца штрих-кодов): 36 мкл Арна (всего 200 нг) и 4 мкл буфера фрагментации РНК. Инкубировать смеси на 94 ° C 90 s.
2. Немедленно переместить смеси льда и 4 мкл буфера стоп фрагментации РНК. Отрегулируйте громкость до 100 мкл, добавив 56 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
3. Добавить 350 мкл буфера RLT от РНК очистка kit (см. Таблицу материалы) и смешайте хорошо закупорить. 250 мкл EtOH, смешайте хорошо закупорить и передать образец столбце спин Очистка РНК. Спина для 15 s на 8000 x g.
4. Передача столбец в новой коллекции трубки и 500 мкл буфера ПЭС. Спина для 15 s в 8000 x g. отбросить потока через. В 8000 x g добавьте 500 мкл 80% EtOH и спина на 2 мин.
5. Трансфер столбец в новой коллекции трубки, откройте крышку столбца, и спина для 5 минут на полной скорости.
6. Передача столбец в новой коллекции трубки и элюировать с 16 мкл нуклеиназы свободной воды, спиннинг на полной скорости на 1 мин.

5. Библиотека подготовка

Примечание: ИВЦ могут объединяться на данный момент, если нет никакого дублирования в штрих-код используется. Время лечения фосфатазы — это 1 ч 40 мин поли нуклеотида киназы лечения время.

1. До 16 мкл фрагментированных Арна в 0,7 мл ПЦР-пробирку, мкл 4 Следующая смесь: 2 мкл 10 x буфер фосфатазы, 1 мкл Антарктики фосфатазы и 1 мкл ингибитора рекомбинантных рибонуклеазы (например, RNaseOUT). Инкубировать в тепловая велосипедист с следующий протокол: 37 ° C в течение 30 мин, 65 ° C за 5 мин и провести на 4 ° C.
2. До 0,7 мл ПЦР-пробирку с шагом 5.1, добавить 30 мкл следующей смеси: 17 мкл нуклеиназы свободной воды, 5 мкл 10 x буфер фосфатазы, 5 мкл АТФ (10 мм), 1 мкл Ингибитор рибонуклеазы рекомбинантных и 2 мкл ПНК. Инкубировать в тепловой циклователь при 37 ° C 60 мин, а затем провести на 4 ° C.
3. Выполните очистку столбца фосфатазы и PNK-лечение Арна.
   1. Отрегулируйте громкость до 100 мкл, добавляя 50 мкл воды, свободной от нуклеиназы. 350 мкл буфера RLT и хорошо перемешать. 250 мкл EtOH, смешайте хорошо закупорить и передать образец столбце спин Очистка РНК.
   2. Спина для 15 s в 8000 x g. Передача столбца новой коллекции трубки и 500 мкл буфера ПЭС.
   3. Спина для 15 s в 8000 x g. отменить потока через и 500 мкл 80% EtOH.
   4. Спина на 2 мин в 8000 x g. столбце передать новой коллекции трубки, откройте крышку столбца, и спина для 5 минут на полной скорости.
   5. Передача столбец в новой коллекции трубки и элюировать с 14 мкл нуклеиназы свободной воды, спиннинг на полной скорости за 1 мин для восстановления тома ~ 10 мкл материала. Удалить столбец. Уменьшите объем до 5 мкл, с помощью вакуума концентратор для ~ 10 мин.
4. Перевязать 3' адаптер с помощью коммерческих комплект (см. Таблицу материалы).
   1. Разбавить 3' адаптер (RA3) от TrueSeq комплект 3 складки с нуклеиназы свободной воды и хранить аликвоты при-20 ° C.
   2. Для 5 мкл фосфатазы и PNK-лечение РНК добавьте 1 мкл разбавленного 3' адаптер. Инкубируйте на 70 ° C на 2 мин, а затем сразу же поместить трубку на льду для предотвращения формирования вторичной структуры.
   3. 4 мкл следующая смесь: 2 мкл 5 x HM лигирование буфера (HML), 1 мкл битор РНКазы и 1 мкл T4 РНК лигаза (усечение) 2. Инкубируйте трубку на разогретую тепловая велосипедист на 28 ° C в течение 1 ч (неотапливаемых или с открытой крышкой).
   4. С трубки реакции, оставшиеся на тепловая велосипедист, 1 мкл стоп раствора (STP) и осторожно Пипетка весь объем вверх и вниз 6 – 8 раз, чтобы тщательно перемешать. Продолжать инкубировать реакции трубку на тепловой циклователь на 28 ° C в течение 15 мин, затем поместить трубку на льду.
   5. 3 мкл нуклеиназы свободной воды, чтобы получить общий объем 12 мкл. Использование 6 мкл и сохранить оставшиеся 6 мкл-80 ° c.
5. Выполните реакция обратной транскрипции.
   1. Объединить в ПЦР-пробирку следующее: 6 мкл адаптер лигируют РНК и 1 мкл РНК RT праймера (RTP). Инкубировать трубки при 70 ° C на 2 мин, затем немедленно поместить трубку на льду.
   2. 5.5 мкл следующая смесь: 2 мкл 5 x первая прядь буфера, 0.5 мкл, комплекса dNTP 12,5 мм, 1 мкл, 100 мм DTT, 1 мкл битор РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы. Инкубировать трубку в предварительно нагретой тепловая велосипедист при 50 ° C за 1 ч, а затем поместить трубку на льду (образцы можно хранить при температуре от-20 ° C).
6. Выполняйте амплификации PCR с 11-15 циклов для обогащения 5' 3'-грунтовка перевязаны продукта.
   1. Для каждой обратной транскрипции реакции, мкл 35.5 следующей смеси: 8,5 мкл ультра-чистой воды, 25 мкл, комплекса ПЦР (PML) и 2 мкл РНК PCR праймер (РП1). Для каждой реакции, добавить 2 мкл уникальным индексированным праймера PCR РНК (RPIX, X = 1 до 24).
   2. Усилить трубку в тепловая велосипедист, используя следующие условия PCR Велоспорт: 98 ° C за 30 сек; 12-15 циклов 98 ° c 10 s; 60 ° C на 30 сек; 72 ° C за 30 сек; 72 ° C для 10 мин; Затем, удерживая при 4 ° C.

6. ПЦР продукта очистки и выбор размера

1. Prewarm AmpureXP магнитные бусы при комнатной температуре. Вихревой бусы до тех пор, пока они хорошо рассредоточены, затем добавьте 50 мкл реакции PCR 50 мкл (1:1 ПЦР продукта: бусы). Смешайте содержимое в десять раз, чтобы тщательно перемешать.
2. Инкубации при комнатной температуре 15 мин место на магнитной подставке для по крайней мере 5 минут, до тех пор, пока жидкость появляется ясно. Снимите и выбросьте 95 мкл супернатант.
3. Добавить 200 мкл свежеприготовленные 80% EtOH. Инкубируйте по крайней мере 30 сек, затем удалить и удалить супернатант не нарушая бисер. Повторите это еще раз.
4. Просушите бусы за 15 минут или до полного высыхания. Ресуспензируйте с 32,5 мкл буфера ресуспендирования. Пипетка всего тома вверх и вниз по десять раз тщательно перемешать.
5. Инкубации при комнатной температуре на 2 мин место на магнитные постоять 5 мин, до тех пор, пока жидкость появляется ясно. Передать 30 мкл супернатант новой трубки. 20 мкл нуклеиназы свободной воды для получения 50 мкл общий объем.
6. Выполните выбор размера продуктов ПЦР с твердой фазы реверсивные иммобилизации (ОСПР) магнитные бусы.
   1. Добавьте 0.7 x тома (35 мкл) из бисера Спри подготовленный в шаге 6.5 и смесь тщательно закупорить трубку. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.
   2. Установите трубку на магнитную подставку и подождите 5 минут или до отдельных бусины. Тщательно удалите супернатант не нарушая бисер.
   3. Добавить 200 мкл свежеприготовленные 85% EtOH. Подождите 30 s, а затем удалить EtOH. Просушите Бусины для 10 мин.
7. 20 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Установите трубку обратно на магнит, подождите 5 минут и Пипетка с жидкой части без беспокойства или трогательные бисер. Магазин ДНК при-20 ° C.

7. определение библиотеки количества и качества

1. Проверка концентрации ДНК с спектрофотометром в 260 Нм длины волны (предполагается, что концентрация составляет по крайней мере ~ 5-10 нг/мкл).
2. Запуск 1 мкл каждого образца на bioanalyzer, используя обломок ДНК высок чувствительности для изучения распределения размеров (ожидается пик находится в 300-400 bp (см. рис. 3)).

8. Пример представления

1. Объединить non перекроя штрихкоды ПЦР секвенирования (соотношение 1:1). Например объединить продуктов ПЦР образцов с ИРЦ-1 и ИРЦ-2, ИРЦ-3 и ИРЦ-4 в нанограмм в равных количествах, согласно РНК последовательности ядра общей входной выборки сумма требования рекомендаций.
2. После объединения, отрегулируйте общая концентрация 5 нг/мкл и по крайней мере 10 мкл тома или как рекомендованный основного объекта последовательности.

Результаты

Используя протокол, описанных выше, ГАМК, нейроны были вручную сортируются (рис. 1) и РНК усиливается, затем сделал в библиотеку cDNA (рис. 2) и виртуализации на высокой глубиной⁸. Усиленные РНК (Арна) продукции колеблется от 200 – 4...

Обсуждение

Руководство, сортировка протокол подходит для поднадзорных РНК последовательности нейрона популяций, которые либо малонаселенных помечены в мозге мышей или представляют редкие клеток населения, которое иначе не возможно для исследования с использованием текущей ячейки высокой проп...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ERCC RNA Spike-In Control Mixes	Thermo Fisher	Cat# 4456740
SuperScript III	Thermo Fisher	Cat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher	Cat# 10777019
RNA fragmentation buffer	New England Biolabs	Cat# E6105S
RNA MinElute kit	Qiagen	Cat# 74204
Antarctic phosphatase	New England Biolabs	Cat# M0289
Poly nucleotide kinase	New England Biolabs	Cat# M0201
T4 RNA ligase2, truncated	New England Biolabs	Cat# M0242
Ampure Xp magnetic  beads	Beckman Coulter	Cat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beads	Thermo Fisher	Cat# B23317
DL-AP5	Tocris	Cat# 0105
CNQX	Tocris	Cat# 1045
TTX	Tocris	Cat# 1078
Protease from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	Cat# P5147
Message Amp II kit	Thermo Fisher	Cat# AM1751
Carbogen	Airgas	Cat# UN3156
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit	Illumina	Cat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chip	Agilent	Cat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip	Agilent	Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100	Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F).	Leica	Model MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.	Warner instruments	Model GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette puller	Sutter Instruments Co	P-97
Vibratome	Thermo Microm	HM 650V
Vibratome tissue cooling unit	Thermo Microm	CU 65