Извлечение и анализ тайваньского зеленый прополиса

Резюме

Мы представляем протокол для использования этанола в качестве растворителя для извлечения и характеризуют Тайваньская зеленый прополис обладает антибактериальной активностью.

Аннотация

Тайваньская зеленый Прополис богат prenylated флавоноиды и экспонаты широкий спектр биологических мероприятий, таких как антиоксидант, антибактериальные и противораковых те. Биоактивных соединений Тайваньская зеленый прополиса являются propolins, а именно C, D, F и G. Концентрация propolins в тайваньской зеленый Прополис варьируется в зависимости от сезона и географического расположения. Таким образом крайне важно для установления стандартной процедуры для определения качества Тайваньская зеленый прополиса. Здесь мы представляем протокол, использующий добычи на основе этанола, высокой производительности жидкостной хроматографии и анализ антибактериальной активности для характеристики качества Тайваньская зеленый прополис. Этот метод показывает, что 95% и 99,5% этанола извлечений добиться максимальной сухого вещества урожайности от тайваньской зеленый прополис, тем самым давая самые высокие концентрации propolins, имеют антибактериальные свойства. Согласно этим выводам настоящий Протокол считается надежные и повторяемые для определения качества Тайваньская зеленый прополиса.

Введение

Прополис представляет собой естественный смолистый смесь, производимые виды пчела Apis mellifera. Прополис широко использовался с древних времен в народных лекарственных средств. Исследования недавно сообщили, что прополис является полезным для предотвращения микробной инфекции и воспаления¹. Многочисленные исследования показали, что основными биологически активных соединений в прополис являются флавоноиды, фенольные кислоты эфиры, prenylated p-кумариновая кислоты и diterpenic кислоты^2,3. На сегодняшний день, были определены 10 prenylated флаванонов производные от тайваньской зеленый Прополис через высокой производительности жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)^4,5,6,7. Наиболее распространенными среди них являются propolins C, D, F и G^5,7. Значительные биологические эффекты Тайваньская зеленый Прополис коррелируют с его высоким содержанием propolins⁸.

Концентрации биологически активных соединений в прополис различаются в зависимости от сезона и географического расположения, из которого получается прополиса. Европейский Прополис содержит главным образом флавоноид aglycone и фенольные кислоты⁹. Основными биологически активных соединений в прополис из Бразилии, prenylated p-кумариновая кислоты, такие как artepillin C¹⁰. Исследование показало, что сезон является критическим фактором для определения содержания всего propolin в тайваньской зеленый Прополис¹¹. Содержание propolin в тайваньской зеленый Прополис является высоким в летнее время (Май - Июль) и низких в зима¹¹. Антибактериальные свойства прополиса было широко считается показателем биологической активности. Как правило образцы прополис, собранных из различных регионов продемонстрировали аналогичные антибактериальные свойства; Например он обычно эффективен в отношении почти всех грамотрицательных бактерий и выставок ограниченное антибактериальный эффект против грамотрицательных бактерий^10,12,13. Чтобы иметь антибактериальный эффект¹⁴были продемонстрированы синергического взаимодействия между флавоноиды в прополис. Аналогичным образом Тайваньская зеленый прополисом было сообщено иметь Антимикробный эффект против грамположительных бактерий¹⁵. Кроме того исследование также выявило Антимикробный эффект от взаимодействия propolins в тайваньской зеленый Прополис⁸.

Характеристика биологически активных соединений в прополис трудно, потому что его химический состав могут варьироваться в соответствии его источник происхождения. Таким образом необходимо установить осуществимым и повторяемые метод для определения качества Тайваньская зеленый прополиса. Однако стандартная процедура не была создана для извлечения Тайваньская зеленый прополис и последующих функционального анализа. Были предложены несколько методов, которые разнообразно применение органических и неорганических растворителей для Прополис извлечения^{16,,1718,19,20}. Потому что прополис является смесью липофильных, исследования показали, что органические извлечения лучше чем неорганических извлечения^8,18,19. Общая propolin концентрация в тайваньской зеленый прополис и его антибактериальные свойства являются ключевыми показателями качества Тайваньская зеленый прополиса. Таким образом цель настоящего исследования – представить протокол для использования этанола в качестве растворителя для извлечения и характеризуют антибактериальные свойства Тайваньская зеленый прополис.

протокол

1. Подготовка извлечено этанола соединений

1. Вес 10 г замороженных Тайваньская зеленый прополиса, которая была собрана из ульев в Тайване с мая по Июль, и растереть его с помощью специй мельницы. Подтвердите, что целые куски Тайваньская зеленый Прополис измельчается в порошок без каких-либо крупных частиц.
2. Добавьте 100 мл различных концентраций этанола (60%, 70%, 80%, 95% и 99,5%) и воды, чтобы отделить колбы и перемешать каждый концентрации с 10 г прополиса земли.
3. Инкубировать при 25 ° C и встряхнуть колбу в 250 об/мин в течение 48 часов.
4. Фильтр этанола экстракты через фильтр-бумаги с порами размером 25 мкм.
5. Воссоздать фильтратами до их первоначального объема (100 мл) с 95% этанола с помощью объемной колбу.
6. Хранить этанола выдержки при температуре-20 ° C.
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

2. Подготовка этанола экстрактов для ВЭЖХ

1. Концентрата 10 мл этанола экстрактов вакуумного испарения при 40 ° C на 15 мин.
2. Выпекать сухого вещества на 45 ° C в течение 24 ч.
3. Воссоздать сухого вещества с 10 мл этанола 95%.
4. Фильтр 1 мл этанола выдержки, с помощью стерильного шприца фильтр с размером пор 0,45 мкм.
5. Refilter экстракты этанол, с использованием стерильных шприцев фильтр с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат собирается и могут непосредственно быть проанализированы с помощью ВЭЖХ.

3. анализ содержания Propolin, с помощью ВЭЖХ

1. Создание стандартных кривых propolins
   1. Подготовка 1 Л мобильных фазы метанола: водный раствор 88.8:11.2 (v/v).
   2. Подготовить серийных разведений propolin стандарт (C, D, F и G) концентрации (15.625 мг/мл, 31,25 мг/мл, 62,5 мг/мл и 125 мг/мл, соответственно) с использованием мобильных фазы решения как растворитель.
   3. Придать 20 мкл propolin стандартной концентрации в столбце реверс фаза, последовательно от низкой концентрации в высокой концентрации.
   4. Задайте столбец ВЭЖХ на 30 ° C и скорости потока в 1 мл/мин.
   5. Установка длины волны УФ детектор до 280 Нм и рекордер время до 20 мин.
   6. Анализ стандартов по крайней мере 3 x.
   7. Участок измерения ответ (ось y) против концентрации (ось x) с помощью вычисления листа программного обеспечения и создать калибровочной кривой с помощью уравнения и значения R-квадрат.
2. Анализ этанол экстракт s
   1. Придать 20 мкл этанола экстракты, полученные из шаг 2,5 в столбце реверс фаза.
   2. Задайте столбец ВЭЖХ на 30 ° C и скорости потока в 1 мл/мин.
   3. Установка длины волны УФ детектор до 280 Нм и рекордер время до 20 мин.
   4. Анализ стандартов по крайней мере 3 x.
   5. Рассчитайте концентрацию propolin в экстракте этанола, используя уравнение для стандартной кривой, полученные из шага 3.1.7, использующий площади пика для каждого propolin.

4. Минимальный тормозной концентрации и минимум бактерицидная концентрация анализ

Примечание: Метод microdilution используется для оценки антибактериальной эффективности этанол извлечь propolins из тайваньской зеленый прополис.

1. Подготовка испытания организмов
   1. Оттепель бактериальных штаммов, золотистый стафилококк и Escherichia coli и затем, культура их в tryptic соевый бульон и питательный бульон, соответственно, при 37 ° C в течение 24 ч.
   2. Проход S. aureus , используя tryptic соевый бульон и E. coli с помощью питательный бульон для двух поколений и, затем, рассчитать колонии формирование подразделений путем подсчета отдельных колоний на плите агар.
2. Подготовка этанола экстракты для антибактериальная активность тестирование
   1. Концентрат экстрактов этанола, полученные на шаге 1.5 вакуумного испарения при 40 ° C на 15 мин.
   2. Воссоздания сухого вещества с диметилсульфоксида (ДМСО) и регулировка концентрации экстракта 12.8 мг/мл.
   3. Сделать последовательный разрежения (концентрации: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 и 640 мкг/мл) этанола экстрактов с использованием бульон.
3. Минимальная концентрация ингибирующее тесты
   1. 10 мкл разбавленного этанола экстрактов, начиная от 0,156 640.0 мкг/мл в плиту 96-луночных.
   2. С помощью бульон, отрегулируйте громкость до 100 мкл и сохранить 5% ДМСО в всех разведениях.
   3. Прививать 100 мкл бактериальной культуры (1 х 106/мл) в 96-луночных пластины.
   4. Посевные культуры, содержащие различные концентрации этанола выдержки при 37 ° C в течение 48 часов.
   5. Анализировать бактериальный рост зависимости мутности и с помощью оптической плотности (Считыватель микропланшетов) на 590 нм для определения минимальной концентрации тормозной (MIC).
4. Бактерицидная концентрация минимум тесты
   1. Прививать 10 мкл жидкого культуры от каждой скважины MIC теста, которые выставлены не роста на агаре пластину.
   2. Инкубируйте при 37 ° C в течение 24 ч.
   3. Определите бактерицидной активности путем выявления низкие концентрации, которые показали без видимых роста бактерий. Концентрации, которая полностью исключает рост клеток считается минимальным бактериальных концентратов (МБК).

Результаты

В таблице 1представлены положительные репрезентативных данных для извлечения этанола. Урожай сухой массы от тайваньской зеленый Прополис был положительно связаны с концентрацией этанола. Экстракты этанола 95% и 99,5% имели наивысший сухого вещества доходность...

Обсуждение

Исследования сообщили, что мацерации, используя различные концентрации этанола, могут использоваться для извлечения бразильский Прополис¹⁷; Однако этот процесс был длительным¹⁷. Он взял по крайней мере 10 дней для извлечения биологически активных соединений, н?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Whatman no. 4 filter paper	Sigma-Aldrich	WHA1004125
methanol	Sigma-Aldrich	34860
reverse phase RP-18 column	Phenomenex Inc.	00G-0234-E0
Staphylococcus aureus	ATCC	BCRC 10780
Escherichia coli	ATCC	BCRC 10675
tryptic soy broth	Sigma-Aldrich	22092
nutrient broth	Sigma-Aldrich	70122
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
spice grinder	Waring	WSG60K
microplate Reader	Molecular Devices	EMAX PLUS
HPLC system	Agilent	1200 Series
vacuum evaporation	BÜCHI	Rotavapor R-215