Анализ миграционных потока индуцированного сдвига мышиных маргинальные зоны B клеток In Vitro

Резюме

Маргинальные зоны B клеток (MZBs) реагировать силы сдвига потока путем переориентации их миграции путь вверх поток. Этот протокол показано, как записывать и анализировать миграции с помощью fluidics блока, насоса, Микроскоп съемочной системы и свободного программного обеспечения.

Аннотация

Маргинальные зоны B клетки (MZBs) являются население B-клетки, которые находятся в мыши селезеночной маргинальных зонах, которые окутывают фолликулов. Чтобы достичь фолликулов, MZBs необходимо перенести вверх поперечной силы потока крови. Мы представляем здесь метод для анализа этого потока индуцированной MZB миграции в пробирке. Во-первых MZBs изолированы от Хандра мыши. Во-вторых MZBs поселились на Интегрин лигандов в поток камеры слайды, подвергается сдвига потока и образ под микроскопом во время миграции. В-третьих изображения перенос MZBs обрабатываются с помощью MTrack2 автоматическая ячейки отслеживания плагинов ImageJ, и результирующий треков ячейки являются количественно с помощью инструмента хемотаксис Ibidi. Миграции данных показывают, как быстро переместить ячейки, как часто они изменить направление, ли вектор сдвига потока влияет на их направление миграции и какие Интегрин лигандов участвуют. Хотя мы используем MZBs, метод может быть легко адаптирована для анализа миграции лейкоцитов, который реагирует на силы сдвига потока.

Введение

Иммунные клетки являются наиболее подвижные клетки в организме человека и часто должны бороться с поперечной силы от крови и лимфы. Однако существует сравнительно мало исследований на сдвиг силы индуцированной миграции лейкоцитов^1,2,3,,45. Мы представляем здесь надежный и количественный протокол для анализа реакции иммунной клетки потока в пробирке. Выполнение анализа не требуется изготовление компонентов, и все оборудование и расходные материалы являются коммерчески доступными. В протокол, включая анализ очищения и миграции клеток, может выполняться в один день. Наконец хотя мы описываем миграции маргинальной зоне В-клеток (MZBs), протокол может быть адаптирована для анализа миграции против потока других типов иммунных клеток. Таким образом это возможно использовать этот assay систематически анализировать широкий спектр лейкоциты с панелью всеобъемлющего условий.

MZBs являются население B-клеток, которые, в мыши, находятся только в селезенке и трансфер между интерьер фолликулов и маргинальных зонах^6,,78,9. Маргинальные зоны — это слой клеток иммунных клеток примерно 5 – 10 толщиной. Слой клетки окружает фолликулов и состоит главным образом из MZBs и макрофагов, но также инвариантные естественных убийца клеток T (iNKT), дендритных клеток (DCs) и нейтрофилов, среди прочих¹⁰. Клетки в маргинальной зоне подвергаются однонаправленный кровотока, возникая от Селезеночной артерии, которые заканчиваются в маргинальных синуса, окружающих фолликула. Кровь течет из отверстия в маргинальных пазухи через краевой зоне и затем собраны в венозные синусы в красной пульпы и восстановлен в циркуляции¹¹. Свободный поток крови моет над MZBs и подвергает их антигенов в крови. MZBs нести антигена в фолликул челночные автоматически между маргинальной зоне и внутри фолликула, который не подвергается крови. Таким образом как MZBs к фолликул, они должны перенести вверх поперечная сила в крови поток¹² (Рисунок 1A).

В этом протоколе мы описываем как количественно определить, как иммунной клетки, такие, как MZBs реагировать или нет потока потока в пробирке, для того, чтобы выявить, как они запрограммированы для переноса в естественных условиях. На первом шаге MZBs очищаются от мыши селезенки, используя магнитные бусы, сочетании антитела от коммерчески доступных наборов. Свежевыделенных MZBs представил в колодец слайда потока камеры, разрешено селиться на Интегрин лигандов и воздействию потока миграции буфера с помощью насоса системы (рис. 2A). Клетки отражаются с помощью системы покадровой видео микроскопии. Затем изображения обрабатываются для анализа с бесплатный плагин ImageJ, MTrack2^13,14, автоматически отслеживать клетки. Треки могут быть количественно затем с бесплатный инструмент Ibidi хемотаксис¹⁵ для определения различных параметров, включая скорость прямолинейность и миграции индекс. Эти значения могут использоваться для определения воздействия миграции ингибиторы, стимуляторы клеток, chemokines и других химических веществ, влияющих на миграцию на индуцированного сдвига потока миграции для того чтобы понять силы, контролируя иммунные клетки движение в естественных условиях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты, связанные с использованием животных были ранее одобрены Landesverwaltungsamt Галле (Саксония-Анхальт), Германия, в соответствии с все руководящие принципы медицинского факультета OVGU Университета Магдебурга.

1. MZB клетки очистки

1. Изолируйте лейкоцитов.
   1. Жертву 8 до 16 недели старая мышь и удаление селезенки¹⁶. Отделить селезенки в 5 мл ледяной клеток буфера [фосфат амортизированное saline (PBS) + 0.5% свободных жирных кислот бычьим сывороточным альбумином (БСА)], либо с помощью диссоциатором ткани или аккуратно затирания селезенки через сетку фильтра клеток 70 мкм в скважину на тарелку, 6-а с поршень от шприц 5 мл.
   2. Перевод ячейки в буфер клетки в коническую пробирку 15 мл. Собирайте дополнительные ячейки, добавив еще 5 мл ледяной клеток буфера трубка диссоциатором ткани или сетки нейлона в колодец. Передать дополнительные 5 мл буфера ячейка плюс клетки Конические трубки. Центрифуга на 300 x g 10 мин при комнатной температуре (RT, 20 ° C) и удалить супернатант.
2. Выполняйте Лизис эритроцитов.
   1. Вновь приостановить Пелле клеток в 1 мл буфера lysis эритроцитов (РБК) (150 мм NH₄Cl, 10 мм KHCO₃, ЭДТА 0,1 мм), что подогретым RT. добавить еще 1,5 мл буфера lysis РБК и взболтать. Инкубируйте на RT (20 ° C) для в общей сложности 2 мин, включая время, необходимое для повторного приостановить гранулы.
   2. Добавьте 7,5 мл буфера ледяной клеток в суспензии клеток, чтобы остановить lysis. Центрифуга 300 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант.
   3. Вновь приостановить Пелле клеток в 1 мл буфера клеток и добавить дополнительные 9 мл буфера ячейка. Пипетка 10 мл суспензии клеток через разделительный фильтр 30 мкм в новой 15 мл Конические трубки для удаления мусора ячейки.
   4. Центрифуга клетки на 300 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант. Вновь приостановите Пелле клеток в 500 мкл буфера ячейка. Держите клетки холодной на всех последующих этапах процедуры до инкубации в слайды камеры потока.
3. Очищайте MZBs.
   1. Добавьте 50 мкл антител, биотина в сочетании с коммерчески доступных комплект против всех нежелательных клеток, включая CD43 (на клетки-B), CD4 (на Т-клетки), CD93 (на незрелые клетки) и Ter119 (на эритроцитах), суспензию клеток в коническую пробирку. Встряхнуть или проведите трубки осторожно смешать, но сделать не вихревой клетки. Конические трубки лежала на кровати льда под углом почти плоским и рок в 25 об/мин, 15 мин.
   2. Добавление магнитные бусы, в сочетании с антител анти биотина в суммарный объем 100 мкл суспензии клеток. По-прежнему рок суспензию клеток при 25 об/мин на льду на 20 мин мыть ячейки, добавив 5 мл буфера ячейка, центрифугирование на 300 x g и 4 ° C на 10 мин и отменяя супернатант. Вновь приостановите клеток в 1 мл буфера ячейка.
   3. Разрушающим клетки суспензию клеток магнитные шарик-в сочетании, сохраняя их на магнитной столбца. Отменить помечены клетки (все-B клетки и незрелые клетки B). Собирайте-меченых (клетки зрелых B) в 15 мл Конические трубки, которая была предварительно покрытых с приложением краткого 5 мл буфера ячейка, во избежание неспецифической адгезии к MZBs.
   4. Вымойте суспензию клеток с 5 мл буфера ячейка. Центрифуга 300 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант. Вновь приостановить клетки в 90 мкл буфера клеток и 10 мкл анти CD23-сочетании бусины. Суспензию клеток в рок мягко на льду для 20 минут 25 об/мин.
   5. Вымойте суспензию клеток с 5 мл буфера ячейка. Центрифуга 300 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант. Вновь приостановите клеток в 1 мл буфера ячейка.
   6. Разрушающим клетки суспензию клеток магнитные шарик-в сочетании, сохраняя их на магнитной столбца. Отбрасывать помеченных клеток (фолликулярные клетки B). Соберите-меченых клетки (MZBs), в 15 мл Конические трубки, который предварительно покрытых краткое приложение 5 мл буфера ячейка. Удаление 50 мкл клеток для подсчета и проверка чистоты.
4. Пятно отсортированный MZBs для проверки чистоты.
   1. Добавить 10% объема (5 мкл) ФК блока в 10 000 ячеек в 50 мкл и Инкубируйте на 4 ° C за 5 мин добавьте 50 мкл буфера ячейки, содержащие 0,3 мкл каждого B220-FITC (0,15 мкг), CD21-PE (0,06 мкг) и CD23-APC (0,06 мкг) в общем объеме 105 мкл (каждое антитело разводят 1: 350) , или любой другой комбинации флуорофоров для различения фолликулярные клетки B и MZBs. пятно клетки на 4 ° C в темноте за 15 мин.
   2. Мойте окрашенных клеток с 1 мл буфера ячейка. Центрифуга 300 x g и 4 ° C на 5 мин и удалить супернатант. Ресуспензируйте в 300 мкл буфера клеток и приобрести образцы с использованием проточный цитометр и стандартные методы. Ворота на живой лимфоцитов, затем на B220⁺ клетки и наконец на CD23^низкой CD21^{высокой} клеток (рис. 1B).
      Примечание: Процедура обычно дает 500 000 MZBs за Хандра мыши C57B/6.
5. Подготовка MZBs для потока миграции.
   1. Мыть очищенный MZBs один раз в 1-2 мл холодного миграции буфера [Hanks сбалансированного солевого раствора (HBSS) содержащий катионы, 10 мм Hepes, 0,2% свободных жирных кислот BSA], чтобы гарантировать, что буфер катион содержащих миграции не разбавлена остаточного катион бесплатная буфер PBS. Центрифуга 300 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант. Вновь приостановите MZBs в холодных миграции буфера к концентрации 50 000 MZBs за 30 мкл (эквивалент на сумму, загруженной в одной скважины потока камеры слайда).
      Примечание: Свежевыделенных MZBs должны использоваться как можно скорее. Однако они по-прежнему способны миграции до 8 час или больше после начала эксперимента для до тех пор, как они хранятся на льду. Оптимальной температуры должны быть проверены на других типов клеток. Например она может быть лучше держать культивируемых клеток T при 37 ° C до начала миграции.

2. поток эксперимент

1. Герб слайды с Интегрин лиганда.
   1. За день до этого эксперимента, оттепель Алиготе ИКАМ-1 (400 мкг/мл). Разбавьте ИКАМ-1 на коэффициент 1:80 в PBS до конечной концентрации 5 мкг/мл. 30 мкл ИКАМ-1, в одной камере на слайде потока для каждого фильма миграции требуется. Инкубируйте слайд в влажной камере при температуре 4 ° C на ночь.
      Примечание: Каждый слайд содержит 6 камер и до 8 фильмов в одном сеансе может быть легко записан.
2. Блокировать покрытием скважин.
   1. В день эксперимента мыть палата, добавив 100 мкл PBS одной скважиной и снятия 100 µL из других хорошо камеры. 100 мкл блокировки буфера (2% BSA свободных жирных кислот в PBS) к камере и инкубировать слайд в камере влажного в РТ за 1,5 часа.
   2. Вымойте палата, добавив 100 мкл PBS одной скважиной, снятия его с другими хорошо, а затем добавлять 100 мкл миграции буфера в палату. Храните слайды в камере влажного на RT до эксперимента.
3. Подготовьте устройство fluidics.
   1. Подключите в жидкости насос, Прикрепите блок fluidics и включите насос программного обеспечения. Промойте трубы с 5 – 10 мл буфера миграции, а затем добавить 11.7 мл буфера миграции одинаково в обоих водохранилищ и удалить пузырьки воздуха.
   2. Хомут трубы около 10 см от разъем кусок. Место аэрогидродинамических подразделение в камере с подогревом инкубации на микроскопе.
   3. Установка выбор слайдов «VI 0,4 мкг слайд» и НКТ «белый» в программном обеспечении. Установите желаемый касательное напряжение (например, 4 dyn см^-2). Установите время съемки до 30 мин.
   4. Задайте коэффициент калибровки трубки, определяя скорость потока через трубку в мл/мин измерения времени, необходимого для 2 мл буфера потока из одного резервуара в другой и разделите на 2. Сделайте по крайней мере 4 измерения для точности. Используйте фактического расхода для задания нужного расхода и напряжение сдвига, введя значения в программное обеспечение насоса.
4. Подготовка изображений системы.
   1. Предварительно теплой камеры микроскопа инкубации, fluidics подразделение и миграции аликвоты буфера до 37 ° C (рис. 2B). Тест, оптимизированных насоса, обеспечивая что буфере миграции потоков и обратно в водохранилищах и что есть нет воздуха пузыри в системе.
5. Тензометрические силоизмерители на слайде.
   1. Чистота в нижней части слайда с этанолом смоченной ткани. 30 мкл суспензии клеток в одну скважину камеры и вывести 30 мкл из других хорошо. Инкубируйте слайд с крышкой на чтобы предотвратить испарение при 37 ° C за 30 минут, чтобы позволить клетки для присоединения.
   2. Медленно добавьте буфер подогретым миграции каждой скважины потока камеры слайд пока положительных мениска поднимается из скважины и удалить все пузырьки воздуха с кончиком пипетки.
6. Прикрепите слайд к блоку fluidics.
   1. Зажим на слайд, чтобы микроскопа. Удалить немаркированных сторону аэрогидродинамических труб из куска соединителя и заполнить до конца с миграции буфера до тех пор, пока положительных мениска без воздушных пузырьков поднимается из конца.
   2. Флип конец трубы над и вставьте его в топ скважины потока камеры, зачистка пролитой буфер с ткани. Сохраняя трубы зажат, повторите процедуру для помеченной конец трубки.
7. Изображение клетки.
   1. Переключатель тепловизионные системы «Live», чтобы установить фокус на клетки. Выберите поле зрения, которая находится в середине слайда. Де фокус клетки слегка расширить черный контур ячейки и производят белый интерьер, который затем может быть показатели круглые черные клетки формы на белом фоне для использования с программой автоматизированного отслеживания.
   2. Запустить программу последовательности изображений и запись 1 изображения каждые 5 s 30 мин, с использованием 10 x сухой цели. Снимите скобу из труб и включите насос, то не сторонник клетки будет смыть и адэрентных клеток начинают мигрировать. Изображение для 30 минут или больше с помощью 10 x цели или выше, как хотелось. Этикетки и сохранить фильм.
8. Отсоедините аэрогидродинамических подразделение из слайда.
   1. В конце программы обработки изображений, сброс насос для следующий эксперимент: повторно прикрепить зажим для трубки, удалить труб из слайда, заново подключите разъем кусок, откройте зажим и использовать ручное управление насоса нажать несколько мл буфера от одного резерв OIR на другую, чтобы удалить пузырьки воздуха. Повторно присоедините зажим и заложить зажимается труб на микроскопа для следующего фильма.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена на неопределенный срок здесь. Если с использованием ингибитора или модификатор миграции клеток, в зависимости от способа его действий, добавьте его, либо суспензию клеток, прежде чем поселиться в зале миграции или миграции буфер в блоке аэрогидродинамических.

3. Миграция трек анализ

Примечание: Клетки могут быть отслежены автоматически с помощью плагина MTrack2 или вручную с использованием отслеживания руководство плагин¹⁷. Автоматическое отслеживание хорошо работает с MZBs, потому что эти клетки в основном раунде и оставаться таким образом во время миграции, что делает его легко порог изображение клетки объектам черный на белом фоне. Автоматическое отслеживание является более сложным, если другие типы клеток используются, такие как искусственного, активированный CD8 + Т-клеток, потому что эти клетки растянуть во время миграции и стать несколько прозрачным, что делает его трудно определить края. В этом случае либо (1) клетки могут быть окрашены с внутри жизненно Люминесцентную краску для получения изображений, которые могут быть показатели, чтобы показать объекты черный на белом фоне, или (2) другие программы, чтобы наметить клетки, такие как изображения сегментации и/или edge обнаружения может быть используется. Ручного отслеживания является полезным вариантом при производстве высокой контрастности изображения клетки контуров не возможно.

1. Выполнение ручного отслеживания с помощью плагина.
   1. Установить плагин «Руководство отслеживания» в ImageJ и откройте фильм в ImageJ. В меню «Руководство отслеживания» выберите «Добавить новый трек». Нажмите кнопку центр ячейки как фильм достижений автоматически фрейма. Если ячейка была выбрана в каждом кадре, выберите «Добавить новый трек» начать после новой ячейки.
   2. После того, как записаны, скопируйте результаты вывода в таблицу данных. Измените формат для десятичных отображения для всех ячеек таблицы в ноль места после десятичной запятой. Сохраните файл как «стоп отделенный вкладка» txt-файл для последующего анализа.
      Примечание: Как правило 50-100 клеток отслеживаются, который занимает около 1 ч для завершения для 20 минут фильма около 240 кадров.
2. Выполните автоматическое слежение с помощью плагина MTrack2. Скачать и установить плагин kt MTrack2 согласно инструкции в файле (см. дополнительное кодирование файла).
   1. Порог изображения из фильма миграции клеток. Откройте стек изображений в ImageJ. Процесс изображения в ImageJ с конвертировать видео от цвета высокой контрастности изображения показаны клетки как черные объекты на белом фоне (Рисунок 3А).
      1. Резкость изображения дважды, очищать изображения и конвертировать изображения в 8 бит. Выберите «изображение | Отрегулируйте яркость/контрастность» подменю и положил ползунок Контрастность на максимальный контраст, а затем клетки будет отображаться как белых объектов на черном фоне. Выберите «изображение | Настройка порога» подменю чтобы убедиться, что клетки появляются как черные объекты на белом фоне.
   2. Запуск автоматического ячейки отслеживания плагин «MTrack2 КТ» (см. Дополнительное кодирование файла). Установите следующие параметры в экране параметры.
      1. Задайте размер частиц, минимум на 1 пиксел и размер частиц максимум на 30 пикселов для MZBs.
      2. Для скорости (максимальное расстояние между 2 частиц на последовательных кадрах фильма) Если высока плотность клеток на слайде, это значение низко, чтобы избежать трек «прыгать» из одной ячейки в другую. Для MZBs, установите это значение на 10 пикселов для захвата останцы, хотя MZBs, как правило, не будет превышать 2 пикселей на последовательные кадры, которые 5 s друг от друга.
      3. Для минимальное количество кадров, которые частицы должен присутствовать отслеживаться, установите это значение на количество кадров в фильме для MZBs (например, 240) за 20 минут фильма с 12 кадров/мин. Однако если клетки достаточно быстро, чтобы оставить поле зрения до конца изображений, затем задайте минимальное количество кадров на меньше, чем продолжительность фильма. Например с быстро Т-клеток, задайте минимальное количество на эквивалент 5-10 мин изображений.
         Примечание: Запись макроса этих шагов (порог и MTrack2-КТ), для автоматизации этой части процедуры и сэкономить время (см. Дополнительное кодирование файла). Использование макроса для автоматического отслеживания фильм в ImageJ занимает меньше чем за минуту.
   3. Скопируйте результаты в таблицу данных. Измените формат для десятичных отображения для всех ячеек таблицы в ноль места после десятичной запятой. Добавить пустую строку в верхней части ячейки треков в электронную таблицу и удалить столбец «D». Сохраните файл как «стоп отделенный вкладка» txt-файл для последующего анализа в средстве Ibidi хемотаксис.
      Примечание: MTrack2 плагин выводит треков ячейки в строках 75 параллельных колонках. Для анализа в средстве хемотаксис Ibidi должны быть треков ячейки в одном столбце. Чтобы преобразовать вывод, MTrack2 плагин был изменен для вывода либо в оригинальном формате или как один столбец (рис. 3B) (см. Дополнительное кодирование файла «MTrack2 kt», который написан на Java). Скопируйте файл .java в папку плагинов ImageJ. В ImageJ выберите «Плагины > скомпилировать и запустить». ImageJ перезапуска и измененная версия MTrack2 должен появиться в меню плагинов.
3. Для анализа клеток треков с помощью инструмента Ibidi хемотаксис, скачать Ibidi хемотаксис и средство миграции v2.0 («самостоятельных») и откройте программу.
   1. Выберите «Импорт данных» и перейдите к файлам .txt, трек клетки. Несколько файлов могут быть выбраны в то же время. Импортированные файлы отображаются на панели «Наборы данных» в красном. Выбрать все из них и ввести правильные значения в «Инициализация» меню ниже, чтобы применить следующие параметры.
   2. Введите точное число или диапазон число срезов (количество кадров в фильме).
   3. В меню калибровки (X / Y калибровка), введите размер пикселя. Найти эту информацию в файле свойств фильма. Для MZBs был использован 10 x цель, давая размер пикселя 1.14 мкм. В «меню калибровки | Интервал времени», введите интервал времени между кадрами в фильме.
   4. Примените настройки. Выберите «Диаграмма» для просмотра трек участков и подтвердить, что трек файлы будут открыты. С этого момента много вариантов, которые описаны в документации по программе, включая маркировку треки с разными цветами на основе различных свойств и отображение индивидуальных или среднего значения для скорости, вперед миграции Индекс, непосредственность и более (рис. 3B).
      Примечание: MZBs принимать до обнаруживать и реагировать потока, предположительно, поляризационный их Интегрин комплексов к точке потока вперед ячейки около 10 мин. График индекса миграции с течением времени покажет первоначальный падение ниже нуля, соответствует первые пару минут что клетка подвергается воздействию потока, следуют постепенный подъем вверх до тех пор, пока значения индекса вперед миграции являются положительными. Таким образом это может быть оптимальным, чтобы исключить эти первые минуты в окончательные расчеты, если этот процесс не имеет интерес.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы использовали протокол, описанные выше для сравнения миграции MZBs на слайдах ИКАМ-1-покрытием без потока (0 Дин/см²) и подвергается сдвига потока (4 Дин/см²). Клетки были автоматически отслеживаются с MTrack2 и в результате трек, что файлы были обложил на фильмы ми...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы описываем метод для анализа миграции клеток, которые обнаружить силы сдвига потока и реагировать, не изменяя их миграции. Анализ MZBs показал, что MZBs спонтанно мигрируют на ИКАМ-1 и в присутствии потока, будет мигрировать вверх поток. В нашей предыдущей работы мы показали, что MZBs н?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm	VWR	10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm	Miltenyi	130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit	Miltenyi	130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC	Biolegend	103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC	BD Biosciences	558658
CD23, clone B3B4, PE	Biolegend	101608
HBSS	Biochrom	L2035
D-PBS 1x	Gibco by Life Technologies	14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free	Roth	"0052.3"
ICAM-1	R&D Systems	796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated	Ibidi	80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm	Ibidi	10963
Ibidi Pump system	Ibidi	10902