Убийство Assay сфероида клетками T автомобилей

Резюме

Этот протокол предназначен для оценки иммунотерапевтических перенаправленный цитотоксичность T-клеток (автомобилей Т-клеток) против 3D структурированные раковые клетки (сфероидов) в режиме реального времени.

Аннотация

Иммунотерапия стала полем растущий интерес к борьбе против рака в противном случае неизлечимого. Среди всех методов иммунотерапевтических химерных антигена рецепторов (автомобиль) перенаправлены Т-клеток, полученные наиболее впечатляющих результатов, в частности с детской B-острый лимфобластный лейкоз (B-ALL). Методы классической проверки автомобилей Т-клеток полагаются на использование специфики и анализов функциональность автомобиля Т-клеток против клеток-мишеней в суспензии и в моделях ксенотрансплантата. К сожалению, замечания, сделанные в пробирке часто отделены от результатов, полученных в естественных условиях, и много усилий и животных можно избежать, добавив еще один шаг: использование 3D культуры. Производство сфероидов из потенциальных клеток-мишеней, которые имитируют 3D структура опухолевых клеток, когда они являются прижившимися в животной модели является идеальной альтернативой. Здесь мы приводим доступный, надежный и простой способ получения сфероидов от линии transduced толстого кишечника клетки как инструмент проверки для приемных клеточной терапии (здесь подтверждается CD19 автомобилей Т-клетки). Этот метод в сочетании с передовой живой тепловизионной системы, которая может следовать сфероида роста, эффекторные клетки цитотоксичности и опухоли апоптоза клеток.

Введение

Приемных клеток передачи (ACT) представляет следующее поколение лечения рака. Он полагается на инъекции эффекторных клеток (Т - и NK-клеток) в пациента. Эти клетки могут быть генетически модифицированных с рецепторами, которые будут направлять их в свои цели, опухоль и уничтожить его. Недавно этот подход был показан быть осуществимым, когда рецептор химерных антигена (автомобиль), направленных против B-клетки маркер CD19 был введен в клетки пациента T убить его рака¹. В случае автомобиль, который является искусственным рецепторов, конструкция состоит из фрагментов специфическое антитело, антиген привязки домене сокращен до сущности назначенный одной цепи переменных фрагмента (scFv), связан с Т-клеточной сигнализации доменов. Хотя есть несколько конструкций, наиболее часто используемые версии упоминаемый как второго поколения автомобилей конструкций, состоят из CD3z для сигнализации TCR и один co-stimulatory домен (CD28, 4-1BB, OX40, и т.д.) ^{1 , 2}. поле иммунотерапии направлено большую часть своего внимания к этой новой форме акта когда CD19 автомобилей-Т-клетки эффективно многочисленных пациентов с B клетки злокачественных опухолей^3,4. После этого успеха исследователи пытались использовать подобные конструкции, ориентация другие epitopes для солидных опухолей с ограниченным успехом. К сожалению нехватка специфических антигенов тумора и жестче опухоли микросреды, оказываемых автомобилей T клетки менее эффективными, к⁵солидных опухолей.

В настоящее время наиболее часто используемых в vitro проверки стратегии полагаются на двухмерный (2D) систем, которые касаются только фрагмент проблем уже упоминалось твердые опухоли. Классически 2D в vitro систем представляет собой смесь автомобилей Т-клеток и целевой рак клеточных линий как монослои оценить функциональность и специфика этих клеток-эффекторов. Хотя эти стратегии являются важной и неотъемлемой частью исследований, они не учитывать сложную морфологию и трехмерные (3D) Структура клетки рака⁶. Раковые клетки культивировали в 3D систем, именуемый сфероидов, приобрести новые фенотипических признаков путем внесения изменений в ген выражение профиля⁷, которые могут повлиять на признание перенаправленный эффекторных клеток. Birgersdotter и коллеги продемонстрировал, что линия клетки лимфомы (HL) Ходжкина когда только выращенные в модели 3D культуры приобретает профиль выражение гена, который похож на первичной опухоли образцы⁸. Таким образом сфероидов или аналогичных 3D культуры методологии предложение более актуальными в моделях in vitro в отличие от стандартных 2D систем. Такие системы аналогичны также в vivo исследований, которые рассматриваются как последний шаг в процессе проверки данного автомобиля. Учитывая, что 2D системы не могут имитировать морфология рака кластеров, сфероидов предлагают аналогичные образований оценить функциональность автомобиля Т-клетки до в естественных условиях модели. В одном исследовании, Pickl et al. определили, что модель сфероида рецептора человека эпидермального фактора роста (HER2), экспрессирующих раковые клетки продемонстрировали аналогичные сигнализации профили в естественных условиях модели⁹. Это далее поддерживает сфероидов предлагают более актуальной и закрыть чтобы в vivo оценки автомобиля Т-клеток. Кроме того, проверка автомобилей Т-клеток против сфероидов может помочь более критически оценить их эффективность и предотвратить некоторые из образцов от переезда в vivo исследований преждевременно¹⁰; Таким образом вклад этически соответствующих исследований, жертвуя меньше животных. Кроме того протоколы, используя сфероидов не дороже, чем классический 2D систем и гораздо быстрее по сравнению с классической в vivo исследований. Взятые вместе, можно предсказать, что включение исследований сфероида вскоре станет стандартной практикой для увязки исследований в vitro и in vivo.

Здесь мы представляем подготовки сфероидов от линии клетки рака толстой кишки HCT 116. Эта линия клетки была изменена, чтобы выразить человека CD19 молекулы оказать чувствительны к CD19 автомобилей Т-клеток и обеспечить четкую оценку убийства, используя клинически проверенных автомобиль конструкт.

протокол

1. поколение сфероидов от колоректального рака клеток линии

1. Мыть HCT 116 (стабильно преобразованы выразить Кластер дифференцировки 19 (CD19) и зеленый флуоресценции белков (ГПУП)) клеток монослои с фосфатом буфер солевой раствор (PBS; 5 мл на 25 см² или 10 мл флакон² 75 см). Добавить трипсина (0,5 мл на 25 см² или 1 мл раствора для в колбу² 75 см) и инкубации клеток при 37 ° C за 5 мин.
2. Проверьте ячейки отряд под микроскопом и нейтрализовать фермента диссоциации клеток с полным Розуэлл парк Мемориальный институт 160 среднего (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + гентамицин; 10 мл 25 см² или 20 мл флакон² 75 см).
3. Суспензию клеток центрифуги на 500 x g для 5 минут удалить супернатант с помощью пипетки и Ресуспензируйте, закупорить вверх и вниз несколько раз с 5 мл полного среднего RPM1 1640.
4. Подсчет количества ячеек, с помощью исключения Трипановый синий на совместимый мобильный счетчика.
5. Суспензию клеток центрифуги на 500 x g для 5 минут удалить супернатант с помощью пипетки и Ресуспензируйте в среде RPMI для получения 5 x 10³ клеток/мл.
6. Передать резервуар стерильной суспензии клеток и отказаться от 200 мкл/колодец в 96-луночных вокруг нижней пластины с помощью многоканальных дозаторов.
7. Передать пластины аппарата автоматизированных изображений внутри инкубатора (37 ° C, 5% CO₂, влажность 95%).
8. Войдите в приобретении программного обеспечения, выберите Расписание для приобретения | Добавить запуска корабля | Сканирование по расписанию | Создать судна: новые.
9. Выберите тип сканирования: сфероида. Выберите каналы интерес: фаза + Brightfield (последовать сфероидов роста), зеленый (следовать опухоли сигнал, приобретение время 300 мс) и красный (следовать апоптоза, приобретение время 400 мс).
   1. Выберите нужный масштаб: 10 x.
   2. Выберите модель пластины и его позиции в ящик. Выберите положение скважин для изображения. Введите описание эксперимента: имя, тип клеток, количество ячеек.
10. Для анализа программы установки выберите Отложить анализ пока позже. Щелкните правой кнопкой мыши на временной шкале и выберите параметр Задать интервал группировки выбран сканирования и задать Добавить сканирует каждый -4 h и в общей сложности до 24 ч. установите желаемое время начала (по крайней мере 1 час после инкубации в автоматизированной обработки изображений аппарат).
11. Проверьте каждые 2 дня для роста сфероидов, войдя в программу обработки изображений.
    1. Выберите параметр Представление последних сканирует и дважды щелкните нужный эксперимент. Выберите Brightfield на панели каналов изображения, а затем используйте инструмент мера изображения возможности измерить диаметр сфероидов. Она занимает 6 дней на сфероиде достичь желаемого размера: 0,5 мм в диаметре. 50 мкл полного RPMI среды за хорошо в день 4 ограничить средний испарения эффект.

2. поколение CD19 автомобилей Т-клеток

1. Расширение CD19 автомобилей Т-клеток
   Примечание: Стабильные выражение CD19 автомобилей Т-клеток была приобретена компанией массовых ретровирусных трансдукции здорового донора получения как описано¹⁶. Кодирование ретровирусной конструкции для автомобиля CD19 второго поколения автомобилей и состоит из fmc63 scFv цепи, CD8 петли и трансмембранных доменов, домен co-stimulatory 4-1BB и, наконец, CD3ζ домена.
   1. Для расширения, культуры transduced T клетки присутствии анти CD3/28 Магнитные бусы с ячейкой шарик соотношение 1:1 для 10-11 дней. Во время расширения, клетки находятся в полной среды (X-VIVO 15, 5% сыворотки замены и 100 ед/мл рекомбинантного человеческого IL-2).
      Примечание: Идеальной плотности для эффективного расширения — 1-2 х 10⁶ клеток/мл. В зависимости от первоначального числа клетки могут быть расширены в колбах (25 см² фляги по 20 мл, флакон² 75 см до 40 мл общего объема) в инкубатор культуры клеток (37 ° C, 5% CO₂, 95% влажности).
   2. Как группа отрицательный контроль для следующих анализов включают не преобразованы репликацию (будет упоминаться как макет) расширения протокола параллельно CD19 автомобилей Т-клеток.
   3. День 3, добавить свежие среднего каждый день и разделить более колбы культуры клетки, при необходимости.
   4. День 10-11, центрифуги клетки на 500 x g для 5 минут удалить супернатант и объединить все клетки в один тюбик 50 мл и Ресуспензируйте клетки в ~ 30 мл свежего полный средств массовой информации.
   5. Место Тюбик 50 мл, содержащие ресуспензированы клеток на магнитной подставке отделить магнитные шарики от питательной среды.
   6. Подождите 2-3 мин для Бусины для сбора на стороне трубки.
   7. Удаление питательной среды с пипеткой и передачу новой трубки не прикасаясь к магнитного шарик коллекции зон.
   8. Повторите шаги относительно изъятия из бисера (2.1.5–2.1.7) еще раз, чтобы ограничить количество бисера в окончательном питательной среды.
   9. Ресуспензируйте и подсчитать количество ячеек, регулировка плотности от 1 до 2 х 10⁶ клеток/мл в полной среды.
   10. Остальные клетки для по крайней мере 4 ч до ночлега. Затем непосредственно заморозить их вниз на-80 ° C и передать жидким азотом танка флаконов на следующий день для длительного хранения. Кроме того один можно продлить остальные до на ночь для немедленного использования.
2. CD19 автомобиль выражения управления на первичных клеток T
   1. Подсчитать количество расширенных Т-клеток, как цифры могут немного отличаться, после ночи культуры или умеренно после замораживания/оттаивания.
   2. Передача 5 x 10⁵ клетки от обоих автомобилей CD19 и макет основной Т-клетки для разделения потока цитометрии трубы.
   3. Вымыть клетки с 200 мкл буфера потока (2% FBS в PBS) и центрифуги, трубы на 500 x g за 5 минут, повторите Стиральная избавиться от каких-либо артефактов, вызванных питательной среды.
   4. Подготовьте основное антитело (биотина коза анти мыши IgG, F(ab') ₂ конкретного фрагмента), выполняя разбавления 1: 200 в буфере потока.
   5. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл антител смеси в трубку и инкубировать на льду за 15 минут повторите предыдущий шаг Стиральная дважды, чтобы удалить избыток антитела.
   6. Готовить вторичные антитела (стрептавидина-PE) в разведении 1: 400 в буфере потока.
   7. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл антител смеси в трубку и инкубировать на льду за 15 минут повторите предыдущий шаг Стиральная дважды, чтобы избавиться от избыточных антитела.
   8. Ресуспензируйте клетки в 200 мкл буфера потока в трубку и проанализировать его на проточный цитометр.
   9. Использовать макет Т-клеток созданы негативные и позитивные ворота и анализировать CD19 автомобилей преобразованы Т-клеток, соответственно.

3. 3D опухоли сфероида убийство Assay

1. После 6 дней или один раз сфероидов достичь желаемого размера, удалить пластину из инкубатора. С помощью многоканальных дозаторов, аккуратно удалите 100 мкл/ну полный RMPI 1640 среды из плит сфероида.
   1. Для этого шага, угол советы к внутренней стены пластины 96-Уэллс, избегая контакта с нижней части скважины для того, чтобы свести к минимуму нарушение сфероидов. Остальные тома должно быть около 100 мкл.
2. Подготовьте раствор 1: 200 Annexin V красный, смешивая 50 мкл Annexin V красный с 9,95 мл полного среднего RPMI 1640.
3. Добавьте 100 мкл/ну 1: 200 красный Annexin V решение.
4. Передача пластину в инкубатор (37° C, влажность 95%, 5% CO₂), 15 мин.
5. Урожай transduced автомобиль CD19 Т-клеток в 15 мл трубки и центрифуги их в 500 x g для 5 минут удалить супернатант с помощью пипетки и Ресуспензируйте, закупорить вверх и вниз несколько раз с 2 мл полного среднего RPM1 1640.
6. Подсчет количества ячеек, с помощью исключения Трипановый синий на совместимый мобильный счетчика.
7. Суспензию клеток центрифуги на 500 x g для 5 минут удалить супернатант с помощью пипетки и Ресуспензируйте в среде RPMI для получения 2 x 10⁵ кл/мл.
8. Передать резервуар стерильной суспензии клеток и отказаться от 100 мкл/колодец в 96-луночных раунд сфероида днище с помощью многоканальных дозаторов.
9. Передача пластины обратно в аппарате автоматизированных изображений внутри инкубатора (37 ° C, влажность 95%, 5% CO₂).
10. Войти в приобретении программного обеспечения, выберите расписание для приобретения.
    1. Щелкните правой кнопкой мыши на шкале времени сканирования и выберите пункт Изменить сроки. Щелкните правой кнопкой мыши на группе сканирования и удалите его. Щелкните правой кнопкой мыши на временной шкале и выберите параметр Задать интервал группировки выбран сканирования и Добавить сканирует каждый 1,5 ч и в общей сложности до 24 ч.
    2. Установите нужное время начала (по крайней мере 1 час после инкубации в автоматизированной обработки изображений аппарат). Выберите сохранить расписание сканирования.

4. автоматизированный анализ

1. Войдите в приобретение, выберите параметр Просмотр последних сканирует и выберите опцию Запустить анализ . Выберите создать новое определение анализ | Тип анализа: сфероида. Отметьте каналы изображения для анализа (фаза + Brightfield, зеленый и красный).
2. Выберите по крайней мере 10 представитель изображения: как правило, 1 за состояние и по крайней мере 3 моменты времени (начало, середину и конец приобретения).
3. Предварительный просмотр по умолчанию проанализировать процедуры в стеке всего изображения.
4. Измените параметры для brightfield маска. Типичные параметры: чувствительность 10, отверстие заполнения 1000 мкм², мин области 1000 мкм². Предварительный просмотр в стеке все изображение и убедитесь, что выбранные параметры точно обнаруживать сфероидов.
5. Измените параметры для зеленой маски (ГПУП). Типичные параметры являются: Top hat сегментации с радиусом 200 мкм и порог 3 ОПП, край отделились, отверстие заполнения 5000 мкм², отрегулируйте размер -2 пикселей, площадь мин 3000 мкм². Предварительный просмотр в стеке все изображение и убедитесь, что выбранные параметры точно обнаруживать сфероидов.
6. Измените параметры для Красная маска (Annexin V). Типичные параметры являются: Top hat сегментации с радиусом 150 мкм и порог 2 ОПП, край отделились, отверстие заполнения 5000 мкм², отрегулируйте размер 0 пикселей, площадь мин 1000 мкм². Предварительный просмотр в стеке все изображение и убедитесь, что выбранные параметры точно обнаруживать сфероидов.
7. Запуск анализатора.
   1. После анализа, извлечения измерения интереса. Выберите анализируемый файл, а затем параметр Граф метрики . Выберите метрики интересов, сканирования и хорошо. Как правило общая интенсивность красного и зеленого в границах brightfield дают наиболее точные измерения ограничивая сигнал флуоресценции сфероидов границы определяется маска brightfield (рис. 3). Извлечение выбранных метрик в нескольких формат файла, нажав на «Экспорт данных».
8. Приступить к добыче изображения и фильмы, выбрав анализируемого файла, а затем выберите параметр экспортировать изображения и фильмы . Доступны два варианта, либо как «отобразить» для получения изображений и фильмов как увидено на изображений программное обеспечение (обычно композитных изображений), либо «как хранится» для получения необработанных данных для внешнего анализа через третья часть программного обеспечения.

Результаты

Как видно на рисунке 1, важно проверить подачей cytometry уровень выражения CD19 автомобиля на Т-клеток (рис. 1A) и уровень CD19 на HCT116 опухолевых клеток линии (рис. 1B). Рисунок 2 иллюстрирует результат эксперимента т?...

Обсуждение

Использование сфероидов как новаторский инструмент для проверки будущих рака лечение стало поле растущий интерес в последние годы. Сфероидов представляют собой промежуточный шаг между классического 2D в пробирке анализа и оценки в естественных условиях. Метод также проводит много об?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	-
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 mL tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience