Побуждение и оценки мышиных модели экспериментальной близорукости

Резюме

В настоящем протоколе мы описываем процесс полной экспериментальной близорукость склонения в мышах с помощью недавно разработан ОПРАВЫ и техника, необходимые для достижения стабильной и воспроизводимость результатов в глазной параметр измерения.

Аннотация

Мышиных модель близорукость может быть мощным инструментом для близорукости исследований из-за сравнительно легко генетические манипуляции. Один из способов заставить близорукости в животных это поставить четкие минус линз перед глазами недель (объектив индуцированная миопия, Лим). Однако сохранившиеся протоколы для побуждения и оценки варьируются от лаборатории в лаборатории. Здесь мы описали весьма практичным и воспроизводимый метод побудить Лим мышей с использованием недавно разработан ОПРАВЫ. Метод исправления объектив стабильно перед мышь глаз во время позволяет объектив снимается для очистки или актуальные наркотиков администрации. Фенотипа является надежной и эффективной, и разница невелика. Метод, описанный здесь может применяться для мышей сразу после отнятия от груди, который расширяет возможности продолжительность для экспериментов. Мы также дали технического Советы для достижения воспроизводимость результатов в рефракции и измерения осевой длины. Мы надеемся, шаг за шагом протокол, описанные здесь и подробную статью может помочь исследователям выполнять эксперименты Близорукость миопия более плавно и сделать сопоставимые данные по всей лаборатории.

Введение

Распространенность близорукость недавно резко возросло, в то время как механизм ее возникновения и прогрессирования по-прежнему находятся неизвестный¹. Наиболее характерным фенотип близорукости является удлинение осевой длины (AL), который увеличивает риск для сетчатки осложнений или даже слепоты². Лучше понимать патогенез близорукости и разработать эффективные методы лечения, необходимы надежные близорукий Животные модели и стабильной фенотип оценки.

Кратко, для вызывая близорукий государств в животных существуют два метода: формы лишение миопия (FDM) и объектив индуцированная миопия (LIM)³. Бывшие места диффузоры перед глазом или зашивает веко, чтобы скрыть изображение, которое влияет на нормальное развитие глазного яблока, что приводит к близорукости фенотип. Последние места минус линз перед глазом для перемещения координационным центром за сетчаткой. Сетчатки определяет смещение фокуса и удлиняется глазного яблока перестроить сетчатки и координатора. Для FDM после закрытия веко или диффузор был установлен перед глазом, требуется почти без дополнительного обслуживания. Для Лим объектив необходимо снять для очистки для того, чтобы держать его прозрачным. Таким образом FDM сравнительно легко быть наведено технически. Однако механизмы FDM и Лим отличаются и какой метод имитирует близорукости в человека лучше находится в стадии обсуждения³. Одна из сильных сторон Лим является сильнее фенотип, по сравнению с ФДМ, по крайней мере в случае мышей⁴.

Животные, которые были использованы для стимулирования близорукость включают цыплят⁵, обезьян⁶,⁷тупайи, морских свинок⁸и мышей⁴. Учитывая возможности генетической манипуляции, обильные имеющиеся антител и низкая стоимость для разведения мышей можно было первым выбором как животной модели близорукости. Однако по сравнению с другими более крупных животных, фиксации линз или диффузоры перед глазом мыши относительно сложным, особенно для молодых мышей, например право после отнятия от груди. Для экспериментов, которые нужно актуальные лекарствами или несколько измерений временных глаз это также необходимо для кадра, чтобы быть съемным. Еще одной проблемой является небольшой морфологические изменения мыши глазного яблока, которая требует сложной техники и приборов для оценки. На сегодняшний день, различные вызывающие и измерительные протоколы, используемые в различных исследовательских групп сделать его трудно сравнивать и повторить результаты через лаборатории. Необходим стандартный протокол с деталями.

Предыдущих работах описано несколько способов исправить линзы или диффузоры перед мыши глаз, таких как приклеивание⁹, шить¹⁰ и руководитель конной очки кадр^11,12. Мы объединили существуют руководитель конной изумленный взгляд техника^11,12,13 с нашей недавно разработан кадра, чтобы развивать улучшенное протокол для внедрения надежных и эффективных экспериментальных близорукость у мышей. Протокол может применяться для молодых мышей вскоре после отъема в послеродовой день 21 (p21). Мы также оптимизированы процессы для стабильной и точной оценки фенотипов, включая рефракции и др. Мы надеемся, это стандартный протокол может помочь сделать близорукий мышей модель более легко доступны для близорукости исследований.

протокол

Все процедуры были утверждены Этический Комитет по исследованию животных из школы медицины университета Кэйо придерживаться Арво заявление для использования животных в глазной и видение исследований, институциональные руководящие принципы, касающиеся экспериментов животных на Keio Университет и животное исследования: отчетность о в Vivo экспериментов (прибытие) руководящие принципы для использования животных в научных исследованиях.

1. сборка очки для мышей

1. Подготовка детали, необходимые для сборки очков (рис. 1a). Для каждой мыши, подготовить все следующие: один руководитель конной нейлон палку, один выше и один нижний титана рама, две линзы с надлежащей полномочия согласно цели эксперимента, один винт размер M1.4 с длиной 10 мм, одна гайка для M1.4 Размер винта, один обычный машина для M1.4 Размер винта с толщиной 0,3 мм и две искусственный ноготь советы (Таблица материалов).
   Примечание: Существует два вида кадров с разной высоты. Для одной мыши один выше и один нижний кадром используются как набор. Выше рамки следует ставить выше нижних для того, чтобы сделать видение поля симметричные. Оправ и линз специально разработаны и изготовлены исследовательской группой авторов. Они доступны, обратившись в соответствующие авторы этой статьи. Другие части можно найти в магазинах инструмент.
2. Соберите рамки для правого и левого глаза отдельно.
   1. Организовать кончик ногтя противостоять внешним направление для достижения лучших защитный эффект. Отрегулируйте угол между кончиком ногтя и рамку, чтобы быть около 130°, чтобы избежать, маскируя поля зрения мыши (рис. 1b). Придерживайтесь советов искусственного ногтя к раме с помощью Цианакрилатный клей.
      Примечание: Ноготь советы могут помочь для защиты объектива от поцарапать мышью. Направление ногтем советов должна быть противоположной потому что выше и ниже кадром используются для правый и левый глаз, соответственно.
   2. Подождите по крайней мере 12 h дайте полностью высохнуть, затем использовать клипер ногтя, чтобы скорректировать форму ногтя клей советы, чтобы быть около 1 × 1 см, резки и обрезки.
   3. Придерживайтесь объектива к раме с помощью Цианакрилатный клей. Положил объектив на раме вручную и удерживайте кадра по горизонтали. Придать Цианакрилатный клей от края линзы и пусть клей распространения, поверхностного натяжения.
      Примечание: Клей подорвать объектива и влияние его прозрачность, поэтому убедитесь, что клей только трогает периферийной части объектива. Используйте 0 диоптрию (D) Плано объектив как управления и минус объектив побудить близорукость. Эффект различных полномочий минус линз (–10 D –50 D) был описанных в других⁴. Чтобы максимизировать близорукость склонения, – 30 D объектив рекомендуется для вызывая близорукость. FDM может также быть наведено с того же устройства просто путем изменения объектив в Кап 1,5 мл микропробирок как диффузор.
3. Затяните винт в нейлон склеивают шайбу из плоской стороной палки. Подготовить очки и палками до эксперимента соответственно и сток для дальнейшего использования (рис. 1С).
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

2. измерения рефракции и Аль базовых.

1. Нанесите одну каплю Мидриатическая агента, содержащих Тропикамид 5 мг/мл и фенилэфрин гидрохлорид 5 мг/мл на каждой стороне глазного яблока, расширяют зрачок. Подождите, по крайней мере 5 минут перед наркозом.
   Примечание: Расширяют зрачок под командованием генерала анестезии приведет к обратимым катаракты, которая влияет на измерение потом. Всегда расширяют зрачок перед общей анестезией и подождите по крайней мере 5 минут. Одна капля (примерно 0,05 мл) Мидриатическая агента является достаточно для расширяя зрачок глаза мыши, в то время как более агент будет делать никакого вреда на следующие шаги.
2. Поместите мышь под общим наркозом. Понять назад кожа мыши мягко, чтобы держать мышь от bumping ее глаз до тех пор, пока он полностью невосприимчивы. Судья глубина общей анестезии будет достаточно, если мышь не двинуть вокруг, когда он положил на стол свободно.
   Примечание: Сочетание мидазоламом (40 мкг/100 мкл), medetomidine (7.5 мкг/100 мкл) и Буторфанол тартрата (50 мкг/100 мкл) используется здесь для общей анестезии для мышей с объемом 0,01 мл/г внутрибрюшинной инъекции. Как правило менее чем за 5 мин необходимы для мышей, чтобы заснуть. Долгое время общей анестезии вызывает понижение температуры тела и медленное биение. Чтобы избежать потенциального влияния общей анестезии для измерения, отделка все измерения в течение 10 мин после инъекции анестетика рекомендуется. Буторфанол в анестезии коктейль обеспечивают примерно 4 часа анальгезии. Надлежащего рецепта для общей анестезии может различными учреждениями.
3. Измерьте рефракцию глаза мыши, с помощью инфракрасного photorefractor^4,9,14. Отрегулируйте направление одного из глаза мыши, чтобы сохранить первое изображение Пуркинье в центре зрачка и измерить рефракцию вдоль оптической оси. После измерения измерения противоположный глаз с теми же процедурами (рис. 2a).
   Примечание: Значение измеряется для преломления сильным влиянием позиции мыши глаза вдоль оптической оси. Убедитесь, что первая Пуркинье Изображение выравнивается в пределах ±3 ° от центра зрачка. Верстак спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Окт) система может использоваться для тонкой настройки направления ученика в рефракции измерения⁴.
4. Измерьте Аль мыши глаза с помощью SD-Окт системы^4,,1516. Определите Аль как расстояние от роговицы вершина до ярких границы вблизи зрительного нерва (рис. 2b).
   Примечание: Аналогичные с измерения рефракции, Аль сильно зависит от направления мыши глаза. Роговицы вершина может быть подтверждена точка как отражение на поверхности роговицы. Граница в сторону сетчатки будет очень туманно точке зрительного нерва. Отрегулируйте направление немного, чтобы граница быть достаточно ясным для измерения, но не слишком далеко от оптического нерва.

3. Фиксация кадра на черепе мыши.

1. Нанесите одну каплю 0,1% очищенного натрия гиалуронат глаз капли для предотвращения сухости на каждый глаз.
   Примечание: Глаз падение на поверхность глаза будут влиять значения преломления и измерения осевой длины. Не используйте капли глаз после анестезии, до тех пор, пока все измерения выполняются.
2. Положите подбородок наркотизированных мыши на склоне, сделанные из глины, или что-нибудь может использоваться как подушку сделать плоскости авансом черепа быть горизонтальным.
3. Стерилизовать волосы и кожу головы, между уши и глаза, используя ватный тампон с 70% этиловом спирте.
4. Вырежьте кожу между ушами и глазами подвергать черепа для примерно 0,8 см² используя хирургические ножницы и щипчики. Использование стоматологической травления жидкости и хлопка тампон удалить надкостницы. Стерилизуйте хирургические ножницы и щипчики с 70% этанол до операции каждой мыши.
   Примечание: Стрижки волос и стерильных перчаток может потребоваться.  Проверка положения соответствующих животных ухода Комитета перед этой процедурой. В большинстве случаев Стоматологическая травления жидкости можно найти как один из вложений в самостоятельного лечения стоматологических адгезивной системы. Если не доступен Стоматологическая травления жидкости, используйте 70% этиловом спирте.
5. Соберите набор фреймов без объектива, чтобы помочь исправить палку на правом положении. Положите на голову мыши кадры. Тщательно Отрегулируйте положение кадры, чтобы убедиться, что оба глаза находятся в середине пустая рамка.
6. Используйте самостоятельного лечения стоматологических адгезивной системы прикрепить ручку на голову мыши. Будьте осторожны, чтобы не позволить жидкости придерживаться системы потока в мышь глаз.
   Примечание: Метод использования самостоятельного лечения стоматологических адгезивной системы отличается между продуктами. Обратитесь к инструкции внимательно.
   Предупреждение: Некоторые из реагентов в системе стоматологического клея могут быть токсичными.
7. Подождите около 5 минут и снять кадр и гайку тщательно не меняя позиции ручки (рис. 3a).
8. Придать Атипамезола гидрохлорид 0,75 мг/кг внутрибрюшинно быстрее помочь мышь для восстановления от анестезии. Поместите мышь в отдельные клетки до тех пор, пока полностью выздоровел. Не оставляйте мыши без присмотра, до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency. Протокол может быть приостановлена здесь.

4. начало близорукости индукция и поддержание потом

1. Подождите по крайней мере 24 часа после операции, чтобы позволить мышь полностью оправиться от анестезии. Возьмите ручку и положить на кадрах с линзами. Склонения начинается в этот момент времени (рис. 3b).
   Примечание: Чтобы свести к минимуму дискомфорт во время восстановления после анестезии и дать достаточно времени для стоматологического клея системы коагуляции, настоятельно рекомендуется поставить на раме после мышей полностью оправился от анестезии. Смола цемента адгезивной системы полностью будет охватывать разрез кожи головы. Таким образом без конкретных после хирургического лечения необходима для предотвращения инфекции и смягчения послеоперационные боли. Сразу после первой сдачи на раме мышь будет более сознательного существования объектива и поцарапать его много. Валового поведение будет вернуться к нормальной после нескольких часов. Мышей с линзы могут храниться с такой же плотности для обычных мышей.
2. Удалить рамку и очистить линзы и ногтем советы с ватные тампоны по крайней мере два раза в неделю для поддержания прозрачности хрусталика.
   Примечание: Это не нужно положить мышь под анестезией для удаления и положить на раме. Предоставляют поддержку для мышей, чтобы сидеть на, вместо них висят во время работы с ними могут уменьшить бедствия.
   1. При необходимости временного измерения, поместите мышь под наркозом и измерить мыши как описано ранее. Побуждение может быть продолжена после мыши, восстановление от анестезии.
3. Чистите клетку по крайней мере два раза в неделю.
   Примечание: Это поможет сохранить четкость объектива. Ввод сети между мышью и нижней клетке для фильтрата пищевые отходы также может быть полезно.
4. Контролировать вес тела и грубые поведения. Сравните их с теми же возраст нетронутой мышей в процессе всей экспериментальной.
   Примечание: За исключением некоторых царапин поведение, никаких существенных изменений, включая вес тела находится между эксперимента мышей с необработанной мышей.

Результаты

На во-первых, проверьте, если все необходимые части готовы (рис. 1a). Пример кусок собранные очки показан на рисунке 1b. За исключением основной рамы и гайку все остальные части одноразовые для каждой мыши. Набор заполненных ОПРАВЫ показан ?...

Обсуждение

Чтобы убедиться, что очки стабильно крепится на голове мыши, несколько шагов в этом протоколе необходимо уделять большое внимание. Надкостницы должны быть полностью удалены перед использованием стоматологического адгезивной системы. Кровь на черепе также должны быть очищены с осторо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan