JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для выполнения портативный сотовый аэрозольных воздействий и измерить клеточный ответ. Данный метод использует клетки, выращенных на интерфейсе воздуха жидкость, подражая физиологии в естественных условиях . Клеточный ответ на медь наночастиц аэрозоли было отмечено как Оксидативный стресс через реактивнооксигенных видов генерации и цитотоксичность как лактатдегидрогеназа релиз.

Аннотация

Этот протокол вводит новый в vitro воздействия системы, способной носили, включая его квалификации и производительности. Воздух жидкий интерфейс (Али) в vitro воздействия системы часто большие и громоздкие, затрудняя транспорта на местах и операции на источнике выбросов или в зоне дыхания. Через миниатюризация этих систем лаборатории может быть доставлен на местах, ускорить время обработки и предоставления более подходящим метод воздействия, который не меняет аэрозоля до обращения клетки. Переносные в vitro экспозиции кассеты (PIVEC) адаптирует Кассетный фильтр 37 мм для тестирования вне традиционных лабораторных условиях токсичности в пробирке . PIVEC был охарактеризован с помощью трех размеров наночастиц меди для определения эффективности осаждения на основании гравиметрических и числовой анализ концентрации частиц. Были проведены эксперименты первоначальный цитотоксичности клетки подвергаются легких для определения способности системы на хранение частиц при сохранении жизнеспособности клеток. PIVEC обеспечивает эффективность подобных или увеличение осаждения при сравнении доступны перпендикулярно потока в vitro воздействия устройства. Несмотря на нижней образца пропускной способности малый размер дает некоторые преимущества для текущей в vitro Али воздействия систем. К ним относятся возможность носить для персонального мониторинга, мобильность из лаборатории на источник выбросов, и возможность настройки нескольких систем для пространственного разрешения при сохранении ниже пользователя стоимость. PIVEC является системой, способной сбора аэрозолей в поле и в зоне дыхания на воздух интерфейсом, в пробирке модель.

Введение

Личные выборки с использованием методов в пробирке может предоставить всеобъемлющую информацию о биологических эффектов аэрозолей на рабочем месте. 1 воздействия загрязнителей в воздухе включают воздействия химических, собранных воздуха пробы, в подводных условиях, где газ вводится в суспензии клеток, прерывистый воздействия, с помощью устройства, такие как рокер, или прямой воздействия на интерфейсе воздуха жидкость (Али). 2 многие из этих методов выполняются с клетками, выращенных в подвеска или коллекции образцов до воздействия, каждый из которых может повлиять на токсикологические исследования из-за возможных изменений в аэрозоль. 3 чтобы избежать этих изменений, лаборатории могут быть доведены до поля, используя несколько в vitro Али культуры воздействия систем, которые используются в литературе,,4,5,6,7 8,9,10,11,12,13 однако, лишь немногие являются коммерчески доступными. 8 , 9 , 12 эти системы часто громоздки, особенно когда включая инструменты для регулирования температуры и влажности клеточной среды и скорость потока аэрозоля образца. С помощью PIVEC, воздействия аэрозолей может выполняться за пределами традиционных лабораторных условиях или в зоне дыхания во время имитируя условий ингаляции.

Определение аэрозольного осаждения в vitro имеет важное значение для расследования последствий для здоровья вследствие вдыхания. В зоне дыхания, район, в пределах 30 см от рот и нос,14 решающее значение для понимания воздействия наночастиц и увязки биологических эффектов в легких. 2 часто, осаждения на клетки определяется как эффективности осаждения частиц на и принятые клеток, разделенных частицы, управляемые системы6,15 или на массовой основе те же суммы. 4 , 16 текущие методы для измерения аэрозолей в зоне дыхания являются фильтр на основе, захват частиц в течение заданного выборки и использования фильтров для проведения дальнейших испытаний. 17 персонального мониторинга требует небольшой системы, которая поставляется с платой меньшее количество образцов.

Существует много подходов для определения воздействия на здоровье от воздействия аэрозоля. Али модель позволяет для аэрозолей под управлением непосредственно к клеткам через воздух как реального воздействием сценарий, но это более экономически эффективным и меньше времени, интенсивные чем в vivo исследований во время имитируя воздуха жидкость барьеры, такие как глаза, кожи и легких. Клетки легких, выращенных на Али имеют способность генерировать поляризованные барьерного слоя,18,19 , которая производит физиологические черты, которые напоминают в естественных условиях легких эпителия, включая производство слизи и ПАВ в конкретных бронхов или альвеолярного клеточных линий, реснички, избиение,19 плотные соединения,19,20 и ячейки поляризации. 18 изменения, такие, как они могут повлиять на клеточный ответ, измеряется в исследованиях токсичности. 21 Кроме того, Али в vitro модели результаты часто более чувствительны, чем клетки подвергаются через подвеска модели22 и состоянии модель острой в vivo ингаляционной токсичности. 23 , 24 Итак, Али воздействия системы, которая способна выполнять измерения в зоне дыхания является естественный следующий шаг.

Предоставляя клетки аэрозоля непосредственно у источника выбросов, исследование эффектов всех газов, полулетучих соединений и частиц, участвующих в смеси происходит. Когда смесь собираются в фильтра, газов и летучих соединений не захватываются и смеси в целом не могут быть расследованы. Кроме того растворение частиц в порошок или жидкое подвеска может привести к агрегации или частицы жидкости взаимодействиями, такими как растворение, в жидкой суспензии. 25 , 26 когда аэрозольные частицы добавляются к жидкости, есть высокий потенциал для агломерации,25,27 формирования белков Корона,28 или взаимодействия с соединениями в жидкости, которая может повлиять на осаждения и влияние биологической реакции. 29 , 30

Воздействия на Али основана на трех основных аэрозоля профили, Облако усадки, параллельных потока и потока перпендикулярно. Облако, оседая, используется интерфейс воздействия воздуха-жидкость по клеток (Алиса),4 является пакетной системы, где частицы депозит с помощью гравитационного и диффузионных урегулирования как аэрозоль рассматривается как единое целое. Параллельных потока, используется электростатический аэрозоля в vitro воздействия системы (КАРНИЗ)5 и многообразия экспозиции камеры (MEC) II,6 позволяет для осаждения путем добавления броуновского движения через профиля потока. Перпендикулярно потока, используется microsprayer,7 Nano аэрозольной камеры для In-Vitro токсичности (NACIVT),11 и коммерческих Али систем8,9,10,12, добавляет сдавление из частицы в регионе осаждения. Многие из этих систем экспозиции, большие и громоздкие, требуя избыточных систем для аэрозольных предварительного кондиционирования, насосы для потока, или даже нагрева камеры для инкубации клеток. Этот большой размер уменьшается переносимости системы. Вместо выборки непосредственно у источника выбросов, эти системы часто имеют образцы принесли в лаборатории или модели аэрозолей, созданный для анализа. Сложность выбросов аэрозолей могут быть потеряны в переводе из поля в лабораторию. PIVEC меньше, чем нынешние системы, с внешней поверхности площадью приблизительно 460 см2 и весом всего 60 грамм, с тепловлажностной управления включены в систему, позволяя для высоко портативного устройства. Уменьшение размера и веса позволяют системе изношены или принятых на источник облучения, позволяя прямой выборки.

Большой размер текущего воздействия систем также снижает способность выполнять выборки для изучения пространственных градиентов концентраций. Эта резолюция является ключевым при определении токсикологическое воздействие многих потенциальных экологических и профессиональных рисков например автомобильных выхлопных твердых частиц или на рабочем месте деятельности где аэрозолизации происходит. Сразу же после выбросов, там становится пространственной дисперсии в концентрации частиц. Это растет с течением времени, как частицы рассеивают всей атмосферы, и эти эффекты можно изменить на основании условий окружающей среды, таких как температура, давление, ветра и солнца. Частицы могут начать возраст и окисляются также раз выпущенного31,32 и разгон тарифы зависят от рельефа; более высокие концентрации будут найдены в каньоны и туннелей, где замедлился дисперсии эффекты, и более низкой концентрации можно найти там, где есть большой площади для распыления. 33 эти изменения ставок дисперсии могут иметь существенное воздействие на здоровье человека и можно видеть при сравнении количество астматических взрослых, живущих в городских и в сельских условиях. 34 в то время как многие воздействия системы обеспечивают сразу несколько образцов, несколько систем необходимы с обилием крупных оборудования для выполнения пространственного разрешения.

Собрав в лабораторию к полю, время анализа может быть уменьшена с помощью клеточных как датчик. После известных биологических механизмов и конечные точки могут помочь в определении состава аэрозолей и размер. Из-за медленного оформления методов, включая мукоцилиарный клиренс, фагоцитоз и транслокации эти частицы часто взаимодействуют с клеток примерно дней недели3 генерации оксидативного стресса, воспаления и даже смерти клетки. Эти биологические конечные точки могут быть отправной точкой для пути неблагоприятного исхода для сердечно-сосудистых заболеваний или хроническая обструктивная болезнь легких. Кроме того Wiemenn et al. выполнена массив в vitro анализов для сравнения с литературными значениями для краткосрочной перспективе в vivo ингаляционной токсичности. 35 В естественных условиях реакция была предсказана с двумя из четырех положительные результаты тестирования цитотоксичность через лактатдегидрогеназа релиз, оксидативный стресс от глутатион сокращения и перекись водорода формирования и выпуска и воспаление потенциал фактор некроза опухоли альфа-ген. Из десяти наноразмерные оксиды металлов испытания, 6 протестированы как активный (оксид титана, оксид цинка и четыре разных церия оксид) с помощью облучения в пробирке с подтверждением в естественных условиях. 

С целью изучения воздействия аэрозолей в профессиональной обстановке, наша лаборатория разработала PIVEC для воздействия на местах. Кроме того PIVEC можно носить для личного отбора проб для мониторинга и расследования вдыхания как Кассетный фильтр 37 мм36 или несколько систем может использоваться для достижения пространственное разрешение в пределах данной области. В этом протоколе обсуждается характеристика и использование PIVEC. После облучения биологические эффекты наблюдаются через цитотоксичность анализов.

протокол

Операторы должны носить средства индивидуальной защиты (например, лаборатории пальто, перчатки, очки) при выполнении шагов 1, 2, 3, 5 и 6.

1. Подготовка материалов

  1. Подготовьте материалы для системы Ассамблеи и воздействия для обеспечения повторяемости.
    1. Убедитесь, что для использования новых или очищены на 70% спирте ¼" внутренний диаметр токопроводящих труб и ¼" наружный диаметр разъемы для сборки системы.
    2. Магазин тестовые материалы, включая фильтры, PIVEC компоненты, пинцеты и частиц порошков в хорошо управляемой среде, в отношении температуры и влажности, для по крайней мере за 24 часа до эксперимента.
      Примечание: Температура должна быть около комнатной температуре приблизительно 20 ° C, при относительной влажности воздуха менее 35%. Это очень важно для достижения повторяемость между экспериментов.
    3. Подготовьте счетчики частиц с использованием изопропиловый спирт для очистки деталей и для прогрева системы в соответствии с рекомендациями производителя, включая сканирование мобильность частиц Сайзер (SMPS) и оптических частиц Сайзер (ОПС) для измерения.

2. поколение сухого аэрозоля

Примечание: Аэрозольные поколение зонта должно выполняют операторы.

  1. Собрать систему для создания сухих аэрозолей
    Примечание: Подвеска частиц в газ или жидкость должна быть подходящими для моделируемого приложения и клетки культуры. Следующий метод может быть выполнена с помощью основе жидких аэрозолей. Конструкция системы сухого аэрозоля — от Тивари и др. 37 схема сухой разгон системы показан на рисунке 1.
    1. Подключите шаровой клапан к каждому концу трубы размер резьбовое 4» 1/8, это будет служить в качестве частицы Хоппер. Подключите 2" 1/8 размера трубы к один клапан.
    2. Весят наночастицы меди, в этом исследовании массовой концентрации для каждого размера частиц был неизменным при определении эффективности осаждения. Примерно используйте 7,5 мг 40 Нм меди наночастиц, 7 мг 100 Нм меди наночастиц и 13 мг наночастиц 800 Нм меди в экспозиции. Место меди наночастиц в воронку частиц через открытый конец.
      Примечание: Количество меди наночастиц весил будет служить массы на основе управляемых концентрации.
    3. Место 3" кусок ½" внешнего диаметра (OD) трубы вокруг 2» трубы и место, HEPA фильтр внутри этой короткой трубки, таким образом, чтобы направление потока является через шаровой клапан.
    4. Подсоедините вакуумный генератор к другие шаровой клапан с помощью резьбы. Подсоедините вакуумный генератор к баллон с воздухом, поставив 5/16" OD трубопровод в связи push-lock. Используйте ¼" OD труб для подключения выходе вакуумный генератор к экспериментальной установки, помещая труб на выходе вакуумный генератор.
  2. Использование системы сухого аэрозоля для получения сухого аэрозоля
    1. Откройте баллон с воздухом, повернув основной клапан и позволяют воздушного потока в системе. Открыть вентиль на регулятор потока на баллон с воздухом и установить таким образом, чтобы поток через систему эквивалентен нужные параметры на вакуумный насос.
    2. Откройте шаровой кран ближе к HEPA фильтр, а затем откройте шаровой кран ближе к вакуумным генератором. Держать их открытыми для примерно 3 s чтобы частицы быть вытащил в поток воздуха.
    3. Закройте шаровой кран ближе к вакуумный генератор и закройте клапан ближе к фильтр HEPA. Позвольте воздуху из бака поток в течение всего эксперимента при необходимости.
    4. Закройте главный и регулятор клапаны на воздушных резервуаров, чтобы остановить поток. Чистой шаровые и вакуумный генератор с помощью 70% этиловом спирте. Металлические трубы автоклав для стерилизации.

3. осаждения эффективность измерение с помощью PIVEC

Примечание: Операторы должны выполнить воздействия аэрозолей в зонта.

  1. Измерьте осаждения, собирая меди наночастиц аэрозоля, созданного на шаге 2.2 на фильтр предварительно взвешенным. Используйте хранение дозы, измеряется с помощью собранной массы на фильтре и введенной дозы, измеряется с помощью количество взвешенных частиц меди, для определения эффективности осаждения.
    1. Держите 1,00 мкм поры светофильтры волокна в условиях низкой влажности, описанные в 1.1.2, для по крайней мере за 24 часа до измерения до контакта. Весят неиспользуемые фильтр три раза и записывать фильтр весов. Вставить место неиспользуемые фильтр в культуре клеток.
    2. Выберите соответствующую ячейку культуры вставить адаптер (6 хорошо или хорошо 24) для PIVEC для поддержки Вставка культуры клеток с фильтром. Место культуры клеток вставить кусок адаптер на верхней части основания PIVEC, установив на место, таким образом, что база адаптер кусок шире верхней.
    3. Использование пинцета поставить фильтр загружен клеточной культуры вставить в адаптер кусок. Поместите верхнюю часть на вершине кусок адаптер, влиться в место, таким образом, что база верхнюю часть шире верхней. Обертывание PIVEC с одного слоя клейкой лентой.
    4. Подключите 37 мм кассетный штук на верхней и нижней части PIVEC, нажав на место. Поместите ¼" колючая адаптеры в кассету входным и выходным отверстием.
    5. Оберните резистивный нагревательный прибор вокруг PIVEC, таким образом, чтобы провода находятся на базе. Лента для защиты.
    6. Обертывание PIVEC с ~ 8 раундов алюминиевой фольги для изоляции. Закрепите скотчем.
    7. Подключить 2" длинный кусок 1/2" наружный диаметр гибкие шланги к адаптеру на вершине PIVEC. Удаление пористых трубок из стерильной водой и место внутри труб на вершине PIVEC.
    8. PIVEC место в зажим на стенде кольцо и безопасным. Полная установка с вакуумным насосом, счетчики частиц и аэрозолей set-up.
      Примечание: На основе числа хранение доза может быть определен только если счетчики частиц помещаются перед PIVEC и после PIVEC на отдельных трассах.
    9. Подвергайте фильтры с помощью шаг 2.2 протокола и желаемой экспозиции время и скорость потока, в этом исследовании был использован выдержка 10 мин на 0,5 LPM. Удалите PIVEC из установки. Вынуть вставки культуры клеток и место подвергаются фильтр в держатель фильтра в условиях низкой влажности для по крайней мере за 24 часа до измерения.
    10. Чистый PIVEC с 70% этиловом спирте. Стерилизуйте с ультрафиолетовым светом для по крайней мере 30 минут до следующего эксперимента.
    11. Весят подвергаются фильтр три раза и записывать фильтр весов. Место подвергаются фильтр в держатель фильтра помеченных для хранения.

4. Расчет хранение дозы и эффективности осаждения

Примечание: Знание осаждения имеет важное значение для аэрозольных администрации и интерпретации клеточного ответа.

  1. Вычислить осаждения из массы на основе измерений
    1. Вычислить масса осаждавшихся на фильтры как разница между средний вес до контакта и постконтактной средний вес. Это значение — на основе масса наплавленного доза для эксперимента.
    2. Использование управляемых массы, мadmin, и на основе массы на хранение доза определяется в 4.1.1, мdep, для расчета эффективности на основе массы осаждения, ηм, для эксперимента.
      figure-protocol-7507
    3. Средние значения с 4.1.1 и 4.1.2 для по крайней мере 3 экспериментов для определения осаждения и осаждения эффективности для PIVEC для размера частиц.
  2. Вычислить осаждения на основе числа измерений
    1. Убедитесь, что выполнены измерения с счетчики частиц с счетчики после PIVEC и для определения концентрации частиц до PIVEC. Интегрировать концентрации частиц со временем для счетчика частиц затем интегрировать над диаметр частиц для определения общего числа частиц измеряется.
    2. Вычислить номер частицы осаждаются как разница между управлением частиц и частиц измеряется пост PIVEC. Это значение — на основе числа хранение доза для эксперимента.
    3. Использование управляемых частицы, nадминистратора, на основе числа на хранение дозы, ndep, объемного расхода, V и времени, t, чтобы рассчитать эффективность на основе числа осаждения, ηn, для эксперимента.
      figure-protocol-8540
    4. Средние значения от 4.2.2 и 4.2.3 для по крайней мере 3 экспериментов для определения осаждения и осаждения эффективности для PIVEC для размера частиц.

5. Аэрозольные экспозиции клеток

Примечание: Для ячейки культуры на воздухе жидкость интерфейс читателя называется пустым и др. 38 операторы должны выполнить вставить культуры клеток нагрузки (шаги 5.1.2-5.1.4) в рамках биобезопасности кабинета. Операторы должны выполнить воздействия аэрозолей в зонта.

  1. Культура клетки на интерфейс воздуха жидкость
    1. Поднимите A549 клетки от культуры колбу путем добавления трипсина ЭДТА, 3 мл для T75 колбу или 1 мл раствора для T25 колбу и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C. Добавление 7 мл полной СМИ для T75 колбу или 4 мл полной СМИ для T25 колбу в колбу и промыть колбу стена с суспензию клеток для максимального количества изъятых клеток. Передача суспензию клеток стерильные 15 мл Конические трубки, а затем центрифуги клетки на 800 x g на 3 мин.
    2. Удалить супернатант содержащие трипсина ЭДТА и Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл полной СМИ. Удаление 10 мкл суспензии клеток и добавить Горяева. Подсчитать ячейки с помощью Горяева определить концентрацию и общее количество клеток.
    3. Место 0,5 мл полной СМИ для каждой скважины в течение 24 хорошо пластины. Поместите неиспользуемые ячейки культуры вставок в скважинах. Культура клеток семян вставляет на апикальной стороне на плотность клеток вблизи 1 х 105 клеток/см2 типов клеток, которые растут со скоростью около два раза в день. Для семян A549, хорошо вставить ячейки в течение 24 вставить клетки семян на плотности 1 х 105 клеток/см2 , добавив 35000 клеток в культуре клеток.
      Примечание: Клетки с замедлением темпов роста может быть заполнена на плотность рост клеток.
    4. Добавьте полный СМИ в апикальной части Вставка культуры клеток для достижения окончательный объем (для 24 хорошо пластины окончательный объем 0,25 мл).
    5. Культура для 7 дней в подводных условиях, заменив СМИ каждые 1-2 дня. После 7 дней удалите апикальной СМИ и культуры для по крайней мере 1 день в условиях Али, заменив только базолатеральной СМИ.
  2. Соберите PIVEC
    1. Позволяют клеткам макроэкономическую к интерфейсу воздуха жидкость для по крайней мере за 24 часа до облучения.
    2. Выберите соответствующую ячейку культуры вставить адаптер для PIVEC для поддержки Вставка культуры клеток с фильтром. Место культуры клеток Вставьте адаптер кусок на вершине PIVEC база, установив на место, таким образом, что база адаптер кусок шире верхней. Добавьте 4 мл клетки культуры средств массовой информации и базы PIVEC.
    3. Использование пинцета поставить клеточной культуры вставить в адаптер кусок в шаге 5.2.3. Поместите верхнюю часть на вершине кусок адаптер, влиться в место, таким образом, что база верхнюю часть шире верхней. Осторожно оберните PIVEC с одного слоя клейкой лентой.
    4. Подключите 37 мм кассетный штук на верхней и нижней части PIVEC, нажав на место. Поместите ¼" колючая адаптеры в кассету входным и выходным отверстием.
    5. Оберните резистивный нагревательный прибор вокруг PIVEC, таким образом, чтобы провода находятся на базе. Лента для защиты.
    6. Обертывание PIVEC с ~ 8 раундов алюминиевой фольги для изоляции. Закрепите скотчем.
    7. Подсоедините короткий кусок 1/2" наружный диаметр гибкие шланги к адаптеру на вершине PIVEC. Удаление пористых трубок из стерильной водой и место внутри труб на вершине PIVEC.
    8. PIVEC место в зажим на стенде кольцо и безопасным. Завершите настройки с вакуумный насос и аэрозолей set-up.
  3. Разоблачить клетки на Али с помощью PIVEC
    1. Использование осаждения эффективность определяется в шаге 2 для расчета массы быть аэрозольных частиц. Весят соответствующей массы и добавить в аэрозольные системы, созданной после шага 2 в пределах зонта.
    2. Разоблачение клетки, следуя шаг 2,2, в этом исследовании биологического конечных точек клетки подвергаются примерно 3,5 мг меди наночастиц с скорость потока 0,5 LPM и воздействия продолжительностью 10 минут исследования управления используется увлажненный воздух для определения влияние воздуха только. Удалите PIVEC из установки. Вынуть вставки культуры клеток, в стерильных хорошо пластины и вернуться к CO2 инкубатора (37 ° C, 5% CO2, 90% RH).
    3. Аспирационная СМИ от PIVEC. Если выполнять дополнительные эксперименты, промойте нижней части PIVEC с фосфатом буфер решение, а затем повторите шаг 5.1 и 5.2.
    4. Чистый PIVEC с 70% этиловом спирте, когда закончите. Стерилизуйте с ультрафиолетовым светом для по крайней мере 30 минут до следующего эксперимента.
  4. Биологическая проба процедуры
    Примечание: Анализов, выполненных в этом исследовании были поколения оксидативного стресса через DCFH-DA пробирного и цитотоксичность посредством выпуска Лактатдегидрогеназа (LDH).
    1. Растворите 24,4 мг в 50 мл метанола, чтобы сделать раствор 1 мм DCFH-да-да-DCFH. Этот раствор можно хранить при температуре-20 ° C до 4 месяцев. Разбавьте 1 мм DCFH-DA решение путем смешивания 0,1 мл 1 мм раствор DCFH-DA с 9,9 мл HBSS сделать 10 мл 10 мкм DCFH-DA.
    2. Удалите ячейку культуры средств массовой информации и мыть ячейки культуры вставка с примерно 1 мл PBS. Добавьте 0,5 мл раствора DCFH-DA 10 мкм в каждой скважине, заменив вставки после завершения. Крышка с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить photoactivation красителя и вернуться к инкубатора 37° C за 1 ч.
    3. Удаление ячеек из инкубатора и аспирационная DCFH-DA рабочий раствор из скважин. Добавить 0,5 мл HBSS скважин и заменить вкладыши культуры клеток.
    4. Загрузить хорошо пластины пластины читателя и мера базовых флуоресценции, с помощью волны возбуждения/выбросов 485/530 Нм. Удалите пластину из плиты читателя и нагрузки Вставка в PIVEC для экспозиции.
    5. Разоблачить клетки для желаемой экспозиции продолжительность. Снимите вставку из PIVEC и вернуться к хорошо пластины. Удаление 50 мкл базолатеральной жидкости из хорошо пластины и место в белый 96 хорошо пластины. Измерения флуоресценции DCF, с помощью волны возбуждения/выбросов 485/530 Нм каждые 30 мин после воздействия за 2 ч.
    6. Пусть жидкость базолатеральной сбалансировать до комнатной температуры для 20-30 мин добавьте 50 мкл ЛДГ пробирного раствора, смешанного следующий протокол производитель, базолатеральной жидкости из хорошо пластины и пусть реагировать на 10 минут добавить 25 мкл раствора стоп хорошо. Читайте флуоресценции resorufin продукта с использованием длины волны возбуждения/выбросов 560/590 нм.
    7. Удалите дополнительные базолатеральной жидкости и повторите шаг 5.4.6 на 4 ч. и 24 ч после воздействия.

6 статистические методы

  1. Анализ биологических анализа данных
    1. Доклад ROS производство как увеличение интенсивности флуоресценции клеток лечение относительно базового измерения. Отчет активность ЛДГ как увеличение интенсивности флуоресценции лечение клеток по отношению к необработанной клетки.
    2. Выполните один фактор дисперсионного анализа для определения статистических различий между наборами данных. Там, где это уместно, выполняют студенческих t тесты на значение значение 0,05. Данные отчета как среднее ± стандартное отклонение по крайней мере три измерения воздействия.

Результаты

Труда в vitro токсикологии включает в себя поддержание клеточной жизнеспособности при выполнении воздействия аэрозолей. PIVEC системы показано на Рисунок 2, включая температуру и контроль влажности и носить PIVEC. Температура поддерживалась с помощью б?...

Обсуждение

Фильтр кассеты обеспечивают простой и недорогой метод сбора аэрозолей в зоне дыхания; Однако образцы аэрозоля, извлеченные из фильтров не представляют всю аэрозоля (т.е. газов, летучих веществ и твердых частиц) и соответственно ограничить оценку соответствующих биологических эффектов...

Раскрытие информации

Принадлежность авторов, как показано на обложке. Авторы при финансовой поддержке Университета Содружества Вирджинии, где работа была завершена в Ричмонд, штат Вирджиния. Авторы имеют исключительную ответственность за написание и содержание этого документа. Авторы заявляют, что существует не конкурирующие интересы.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Борис Соломонов и магазин машина инноваций Содружества Вирджиния за помощь с быстрое прототипирование устройства. Авторы хотели бы также поблагодарить Cristian Ромеро-Фуэнтес Левинский группы, д-р Виталий Аврутин, д-р Дмитрий Пестов и Вирджиния Содружества наноматериалов основных характеристик объекта за их помощь с гранулометрического состава. Эта работа была поддержана запуска средства, предоставленные для доктора Левинский Инженерный колледж Университета Содружества Вирджинии.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Scanning mobility particle sizer (SMPS)TSI, Inc.3910NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS)TSI, Inc.3330
Stainless Steel Pipe, 4" LongMcMaster-Carr4830K116Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever HandleMcMaster-Carr4112T12Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" LongMcMaster-Carr7753K121Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filterGE Healthcare09-744-12HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum GeneratorPISCO USAVCH10-018C
PIVECVCUFor design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectorsZefon International, Inc.459743
Porous tubingScientific Commodities, Inc.BB2062-1814AHydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insertFisherbrand35309524 well plate insert
Filter ForcepsFisherbrand09-753-50
Transfer PipetteThermoScientific13-711-27
Glass Fiber FiltersSKC225-7Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro BalanceA&DBM-22Housed in environmental chamber
37 mm filter cassetteSKC225-3250Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pumpSKC220-5000TCAirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper ParticlesU.S. Research Materials, Inc.US109040 nm
Copper ParticlesU.S. Research Materials, Inc.US1088100 nm
Copper ParticlesU.S. Research Materials, Inc.US1117M800 nm

Ссылки

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. , 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3 (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013 (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51 (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. . Aerosol Science for Industrial Hygienists. , (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26 (2), 84-93 (2013).
  17. . . Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. , (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10 (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31 (2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8 (2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. , 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97 (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20 (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 20 (2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514 (2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. , 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8 (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9 (1), 33 (2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103 (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. , 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36 (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19 (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 16 (2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41 (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47 (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19 (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. . NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27 (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26, 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29 (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9 (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5 (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5 (3), 389-399 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

144

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены