Нержавеющая протокол для высокого качества изоляции РНК от лазерного захват клеток Пуркинье Microdissected мозжечка человека Post-Mortem

Резюме

Этот протокол использует пятно свободный подход для визуализации и изолировать клеток Пуркинье свежемороженые ткани от мозжечка человека посмертные через лазерный захвата microdissection. Цель настоящего Протокола заключается в том, для создания достаточного количества качественных РНК РНК последовательности.

Аннотация

Лазерная захвата microdissection (LCM) является выгодным инструментом, который позволяет для коллекции обнаружения и/или фенотипически соответствующих ячеек или регионов из гетерогенных тканей. Захваченные продукт может быть использован в различных молекулярных методов для белков, ДНК или РНК изоляции. Однако сохранение РНК из ткани посмертных человеческого мозга является особенно сложным. Методы стандартных визуализации для LCM требуют гистологического или иммуногистохимическое окрашивание процедур, которые может еще больше ухудшить РНК. Таким образом мы разработали нержавеющей протокол для визуализации в LCM с цель сохранения целостности РНК в ткани мозга человека post-mortem. Клетки Пуркинье мозжечка является хорошим кандидатом для нержавеющей визуализации, благодаря его размер и расположение характерной. Коры мозжечка имеет различные слои, которые отличаются в плотность клеток, что делает их хорошим архетип для идентификации под большим увеличением микроскопии. Клетки Пуркинье являются крупные нейроны, расположенный между гранул слоя клеток, который плотно сотовой сети мелких нейронов, и молекулярный слой, который редкий в клетки тела. Из-за этой архитектуры целесообразно использование нержавеющей визуализации. Подойдет также другие органа или ячейки системы, которые имитируют этот фенотип. Нержавеющая протокол призван исправить свежемороженые ткани с этанолом и удаление липидов с ксилол для улучшения визуализации морфологических под большим увеличением световой микроскопии. Этот протокол не учитывает другие методы фиксации и разработан специально для образцов тканей, свежемороженая, захвачен с помощью ультрафиолетового (УФ)-LCM системы. Здесь мы представляем полный протокол для разрезания и фиксации свежий замороженные посмертные тканей мозжечка человека и Очистка РНК из клеток Пуркинье, изолированные, УФ-НОК, при сохранении качества РНК для последующего РНК последовательности. В наших руках этот протокол производит исключительным уровнем сотовой визуализации без необходимости для окрашивания реагентов и урожаи РНК с большим числом целостности РНК (≥8), необходимые для профилирования транскрипционный анализ экспериментов.

Введение

Лазерная захвата microdissection (LCM) является ценный исследовательский инструмент, который позволяет разделение патологически соответствующих клеток для последующей оценки молекулярно приводом. Использование молекулярного анализа образцов этих разнородных тканей и корреляции с патологическим и клинических данных является необходимым шагом в оценке трансляционная значение биологических исследований¹. При анализе данных выражение гена РНК, использование разделов замороженные ткани очень рекомендуется, так как она позволяет за отличное качество РНК, а также максимальным количеством². Хорошо известно, что высокое качество и количество РНК необходимы для значимых данных от РНК последовательности³. Однако при использовании РНК из ткани свежий замороженные посмертные для LCM, РНК деградации является серьезной проблемой, как это происходит сразу же после смерти и его степени опосредовано различные факторы, связанные с ткани коллекции метод^4,5 . Кроме того РНК деградации усугубляется, когда методы окраски необходимо признать гистологических детали и идентификации клетки. Специализированных пятная методы, такие как гематоксилином и эозином, Ниссль пятно, иммунофлюоресценции и иммуногистохимии полезны в дифференциации клеток от окружающих стромы, но было показано, снизить РНК и изменить выражение Стенограмма ⁶профилей. Таким образом наша лаборатория создала нержавеющей протокол, специально предназначенных для сохранения РНК человека мозжечка посмертные для целей РНК последовательности после изоляции LCM Пуркинье нейронов.

В обработке свежий замороженные ткани для LCM, метод фиксации переменно может повлиять на целостность РНК и тканей. Формалин фиксации стандартный морфологический сохранения, но причины cross-linking который может фрагмент РНК и мешать амплификации РНК⁷. Фиксация этанол является лучшей альтернативой для изоляции РНК, как это коагуляционное фиксатором, который не побудить сшивки¹. Для лучшей визуализации тканей морфологии, ксилол является лучшим выбором, как она удаляет липиды из ткани. Однако существуют известные ограничения при использовании ксилола в НОК, как ткани могут высохнуть и стать хрупкими вызывая ткани фрагментации после лазерной захвата⁷. Ксилол также летучих токсин и должно быть правильно обработаны в зонта. Тем не менее ксилол было показано для улучшения визуализации тканей, сохраняя при этом целостность РНК⁸. Таким образом наш протокол центров вокруг 70% этанол фиксации и дегидратации этанола, следуют ксилол инкубации для морфологических ясность.

Важно обратить внимание на различные виды microdissection лазерных систем, как они показали отличаются в скорости, точности и качества РНК. Инфракрасный (ИК) лазерный захватить microdissection и ультрафиолетового (УФ) Лазерные Микролучевой microdissection системы были оба романа LCM платформ, которые почти одновременно появились⁸. IR-LCM система использует «контактной системы» с помощью прозрачная пленка из термопластичного помещены непосредственно на участке ткани, и клетки интереса выборочно придерживаться фильм сосредоточены импульсы от ИК-лазер. Кроме того система УФ-НОК является «система-контакт», whereby сфокусированного лазерного пучка порезы от клетки или регионы интереса в ткани; в зависимости от конфигурации в двух имеющихся в настоящее время коммерческих платформ, использующих либо прямой или инвертированный микроскоп дизайн ткани приобретается в коллекции устройство по лазерно индуцированным давления волны, что катапульты против силы тяжести или ткани собранные под действием силы тяжести, соответственно. Значительные преимущества УФ-LCM системы включают в себя быстрее клеток приобретения, свободной от загрязнения коллекции с бесконтактным подхода и более точного рассечение из-за гораздо меньшие лазерный луч диаметром⁹. Этот протокол был разработан специально для системы УФ-LCM и не тестировался в системе ИК-НОК. В конструкции системы либо УФ-НОК когда накопления клеток в коллекции колпачок, использование coverslip, улучшает сотовых ясность при микроскопии не подходит, как клетки не сможет вступить в коллекции Кап. Таким образом чтобы повысить визуализации тканей, мы протестировали использование непрозрачной коллекции шапки, которые призваны выступать в качестве coverslip для микроскопических визуализации в системах УФ-НОК, против жидкости заполнены коллекции шапки. Колпачков жидкости заполнены коллекции может быть сложным, как жидкость подлежит испарения и должны быть заменены часто во время работы в Микроскоп. Время становится важным фактором стабильности РНК, как захваченных ткани растворяет сразу⁷.

Наша лаборатория изучает посмертных neuropathologic изменения в мозжечке больных с необходимым тремор (ET) и смежных нейродегенеративных расстройств мозжечка. Мы продемонстрировали морфологических изменений, сосредоточены на клетки Пуркинье, которые отличают ET дела против контроля, в том числе уменьшение количества клеток Пуркинье, увеличение дендритных регрессии и разнообразные аксональное изменений, ведущих нас постулат что Пуркинье дегенерации клеток является основной функцией биологических ET патогенеза^10,11,12,13. Транскрипционный анализ профиля используется во многих неврологических заболеваний исследовать основные молекулярные основы дегенеративных клеточных изменений. Однако транскрипционный анализ профилей из гетерогенных образцов, таких как ткани областях мозга, могут действенно маска выражение низкой изобилие стенограммы и/или уменьшить обнаружения молекулярных изменений, которые происходят только в небольшой численностью населения пострадавших клеток, таких как клетки Пуркинье в коре мозжечка. Например клетки Пуркинье значительно превосходили клетками обильные гранул в коре мозжечка, приблизительно в избытке; Таким образом чтобы эффективно целевой их транскриптом требует конкретных изоляции этих нейронов. Коры мозжечка, разделенное на различные слои, которые отличаются в ячейке плотность и размер ячейки. Эта Сотовая архитектура идеально подходит для визуализации в образец ткани, свежемороженая без красителя содержащих окрашивание реагентов. В теории, этот протокол может также применяться к другим типам ткани, которые имеют аналогичные отличительные ткани Организации.

Этот протокол был разработан для работы специально для визуализации клеток Пуркинье в мозжечок человека посмертные. Для фиксации, окрашивание визуализации и РНК сохранение многих видов тканей для целей из обоих ИК - и УФ-LCM существуют многочисленные протоколы. При созерцая экспериментальный дизайн для УФ-НОК, лиц следует адаптировать их протокол для наилучшего нужд и потребностей, начиная и заканчивая материалы. Здесь мы объединяем многие аспекты различных протоколов LCM, чтобы предоставить метод расширения для визуализации клеток Пуркинье трупа человека мозжечка без необходимости краски, содержащие окрашивание реагентов для подготовки высококачественных РНК транскриптом последовательности.

протокол

Все человеческие образцы, используемые в настоящем протоколе были получены с осознанного согласия и были одобрены внутреннего обзора (КИБ) при Колумбийском университете, Йельском университете.

Примечание: Полностью этот протокол должен следовать строгим РНК, обработка руководящие принципы, whereby перчатке всегда используется, все поверхности очищаются с РНКазы обеззараживатель и все рабочие материалы являются РНК/ДНК/нуклеиназы бесплатно.

1. Проверьте целостность РНК ткани до начала LCM

Примечание: Тестирование качества РНК может быть сделано многими методами. Убедитесь, что РНК от всей секции тестируется для обеспечения репрезентативного числа целостности РНК (Рин) для образца.

1. Тщательно выберите образцы тканей для включения, которые вписываются в параметре экспериментального дизайна. Если резки на криостат, перейти к шагу 1.2. Если нет, то соответственно обрабатывать ткани и перейти к шагу 1.11.
2. Получите два контейнеров сухого льда. Размер будет зависеть количество выборок.
   1. В первый контейнер сухого льда место пустым, обозначенные 2-мл пробирку с кодом ткани.
      Примечание: 10 минут для трубок для замораживания. Трубы должны быть заморожены до размещения на ткани в них; в противном случае ткани будет таять на поверхности трубы.
   2. В второй контейнер сухого льда место ткани из морозильной камеры-80 ° C, которая требует проверки РНК.
3. Очистите криостата. Разделе 4.7 шаг подробная процедура очистки.
4. Удаление ткани из сухого льда и вырезать небольшой участок ткани с лезвием бритвы РНКазы дезактивацию. Ткань должна быть около 1 см x 1 см в размер.
5. Место примерно 3 мм высокий Курган оптимального раскроя температуры (OCT) соединение на криостата «Чак» и позволяют ему частично заморозить. Затем, место ткани поверх OCT — не толкать в OCT, просто дайте ему отдохнуть на верхней части.
6. После октября твердеет, место патрона с подключенного ткани в криостата резки руку и позицию перед криостата лезвие.
7. Трим 30 мкм разделы пока даже ткани.
8. Вырежьте 300 мкм ткани и место в замороженных 2-мл пробирку. Установите трубку обратно в сухой лед.
9. Удаление ткани из «Чак» и место обратно в сухого льда до готовности положить прочь.
10. Повторите шаги с 1,4-1,9 для всех тканей.
11. После того, как все образцы выполнены, извлечь РНК с помощью РНК добыча комплект предоставляется (Таблица материалов #15). В РНК добыча комплект предоставляется подробный протокол. Следуйте всем инструкциям, включая необязательный шаг для сухих Мембранная трубка коллекции и необязательный шаг для DNase пищеварения (Таблица материалов #16).
12. Проверьте целостность извлеченные РНК посредством оценки качества bioanalyzer¹⁴.

2. подготовить до начала секционирование для LCM

1. Очистите слайды Держатели перед каждой ткани секционирование для LCM. Выполните процедуру очистки день перед использованием, чтобы позволить полного высыхания на ночь.
   Примечание: слайд Держатели используются для фиксации секции ткани в этаноле и очистки в ксилоле.
   1. Сдвиньте держатель процедура очистки: промыть РНКазы дезинфектор следуют диэтиловым pyrocarbonate лечение (DEPC) воды. Разрешить для высыхания на ночь вниз на РНК/ДНК/нуклеиназы свободной поверхности, избегая любой пыли или других обсемененности.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: DEPC высокотоксичных и следует обрабатывать и обезвреженных EH & S протоколу стандартных опасных химических веществ.
2. Чистой щетки для разрезания с РНКазы decontaminator и позволяют для высыхания на ночь. Избегайте любой пыли и других загрязнений.
3. Место мембраны слайды под УФ на 30 минут при комнатной температуре. Сделать не подвергайте слайды для УФ более чем 1-2 дня до использовать. Это улучшает связывание ткани на слайд мембраны.
   Примечание: 2.3 шаг может сочетаться с шаг 4, который позволяет для слайда УФ лечение происходит в тот же день как секущей ткани (см. шаг 4.4).

3. Подготовьте фиксации решений с РНКазы свободной воды и этанола высокого качества

Примечание: Все решения готовятся свежие для каждого эксперимента. Убедитесь, что держатель слайдов, процедура от шага 1.1 очистки завершена. Все решения готовятся в слайд Держатели.

1. Место 30 мл 100% этанола в один слайд владельца.
2. Разбавьте этанола с бесплатной водой РНКазы/DNase/нуклеиназы. Место 30 мл 95% этанола в одном слайд держатель и положить на льду.
3. Разбавьте этанола с бесплатной водой РНКазы/DNase/нуклеиназы. Место 30 мл 70% этанола в одном слайд держатель и положить на льду.
4. Место 30 мл 100% ксилола в двух отдельных слайдов Держатели и обозначить их как #1 и #2.

4. Подготовьте криостат для разрезания тканей

1. Получите ведро льда для растворы этанола и контейнер с сухим льдом для ткани.
   ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Сухой лед очень холодно, так что используйте защитные перчатки. Не кладите лед и сухого льда в том же контейнере. Различных температур в лед и сухим льдом приведет к их форме вместе при температуре неопределенный.
2. Удаление ткани от-80 ° C морозильника и место на сухой лед для транспорта для криостата.
3. Криостат настройки:
   1. Установка толщины среза до 14 мкм.
   2. Значение отделку толщиной 30 мкм для сохранения количества ткани.
   3. Для криостатов с двойной камерой и проведение температуры образца установите температуру камеры (CT) до-18 ° C. Для криостатов с одной установки установите температуру до-17 ° C.
   4. Для криостатов с двойной камерой и проведение температуры образца установите температуру объекта (OT) до-16 ° C.
      Примечание: OT должен быть теплее, чем CT для обеспечения даже резки. Если ткань еще измельчения, OT может быть увеличена до-15 ° C и КТ может быть увеличена до-18 ° C.
4. Место ткани в криостат для по крайней мере 20 минут позволить прийти к оптимальной температуры.
   Примечание: Если ткань не при оптимальной температуре, он будет перерабатывать после резки. Не ставьте ткани в-20 ° C ночью сохранения целостности РНК и предотвратить образование кристаллов льда. Разрешить ткани как много время необходимости сбалансировать до оптимальной температуры, чтобы сократить гладко. Необязательная реализация инкубации слайд под УФ может произойти здесь (см. шаг 1.3).
5. Место «Чак» в криостата по крайней мере 20 минут, чтобы спуститься к температуре криостата.
6. Место чистой щетки в криостата по крайней мере 20 минут, чтобы спуститься к температуре криостата.
7. Очистить криостат
   1. Очистите сцену с 1:1 смесь РНКазы обеззараживатель и 70% этанола, разбавляют РНК/ДНК/нуклеиназы свободной воды, чтобы предотвратить замораживание на сцене.
   2. Очистите нового лезвия одноразовые криостат с РНКазы обеззараживатель и место в держатель лезвия на сцене. Позвольте по крайней мере 20 минут для криостата лезвие прийти к температуре криостата.
   3. Очистить пластина уголка с РНКазы обеззараживатель и прикрепить к сцене. Позвольте по крайней мере 20 минут для пластина уголка прийти к температуре криостата.
      Примечание: Пластина уголка для резки не требуется, но настоятельно рекомендуется. Если пластина уголка не доступен, уборка кисть работает в качестве альтернативы. Если пластина уголка не при правильной температуре, ткани расплава или палку после резки.

5. секущей ткани

1. Вырежьте небольшой кусочек ткани (~ 1 см x 1 см) для разрезания. Возвращение оставшихся ткани в сухой лед-80 ° C морозильник.
   Примечание: Убедитесь, что в разделе ткани ~ 95% коры мозжечка, где расположены клетки Пуркинье.
2. Место примерно 3 мм высокий Курган Сен для покрытия «Чак». Начните с создания слоев на верхней части в медленно, круговыми движениями, до тех пор, пока существует небольшой холм.
3. После октября частично заморожен, но есть еще некоторые жидкости в центре, место ткани поверх Окт. Не вставляйте ткани глубоко в октября разрешить ткани, чтобы сидеть на вершине октября до тех пор, пока полностью заморожены. Это займет 1 – 2 мин.
4. Место «Чак» с замороженных OCT и ткани в руку резки криостата. Отрегулируйте ткани, так что это заподлицо с лезвия.
5. Разрешить ткани сидеть в руку резки для 15 – 20 мин адаптироваться к новой температуре.
   Примечание: В зависимости от толщины ткани необходимо время для адаптационного температуры. Разрешить ткани сидеть до тех пор, как требуется аккуратно вырезать. Отрегулируйте OT и CT для оказания помощи с адаптационного температуры тканей.
6. Медленно перемещайте ткани ближе к лезвию. Как только ткань достиг лезвие, начните процесс отделки. Обрезать толщины должно быть присвоено 30 мкм.
7. Трим x 2 – 3 до тех пор, пока видны слои коры.
8. Место и выровнять пластина уголка чуть выше лезвие криостата.
   Примечание: Серебряная линия появится от света в криостата на стыке лезвие и пластина уголка. Это означает, что пластина уголка находится прямо над краем лезвия.
9. Начните сократить разделы на 14 мкм. Должным образом сократить разделы будет плоский под пластину уголка.
   Примечание: Если ткань застрял, убедитесь, что пластина уголка достаточно холодно. Если необходимо, поместив кусок сухого льда на внешних (сторона, не касаясь этап) будет быстро охладите пластина уголка.
10. Вырезать 4 – 6 секций и выровнять их по горизонтали по сцене криостата.
11. Рыбалка на слайд, забрать все части ткани в одно время.
    Примечание: С помощью щетки, поднимите вверх концы ткани, чтобы быть более доступными для слайда после забрать. Не забрать одного раздела одновременно. Воздействие комнатной температуре воздуха будет деградировать РНК целостности.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Не позволяйте коснуться стадии криостата мембраны. Если мембрана прикоснется к сцене, он начнет отделить от стеклянное скольжение и будут вызывать ошибки при попытке LCM.
12. Сразу перейти к шагу 6. Не откладывайте фиксации.

6. Крепление ткани/пятно менее визуализации

1. Сразу перейти к протокол фиксации этанола
2. Поместите слайд в слайд держатель с 70% этанола на 2 мин — на льду.
3. Поместите слайд в слайд держатель с 95% этанола для 45 s — на льду.
4. Поместите слайд в слайд держатель с 100% этанола на 2 мин — на RT.
5. Погрузите слайд 3 раза в слайд держатель с ксилол 1 — на RT.
6. Поместите слайд в слайд держатель с ксилоле 2 для 5 мин — на RT.
7. Дайте высохнуть в чистой зоне, по крайней мере 30 минут дольше сухой раз являются оптимальными, до 60 мин.
   ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Встаньте слайды для сушки в зонта. Ксилол нестабильна. Укладка слайды плоский вызовет ксилол пул в разделе ткани, который приведет к ткани, чтобы быть слишком темно.

7. Факультативный — Слайд хранения

1. Место сушеные слайды в отдельных 50 мл трубки (один слайд на трубку) и места в холодильнике-80 ° C до 7 дней.
   Примечание: Слайды должны быть сухими до размещения в морозильной камере-80 ° С. Не используйте осушитель внутри трубки, как частицы будет вставлять в ткани и мембраны. Убедитесь, что трубка крышка плотно; Если нет, то будет происходить конденсация на слайде при оттаивании для использования.
   ОСТОРОЖНОСТЬЮ: РНК целостности уменьшается после 7 дней, как это делает качество визуализации тканей.

8. размораживание хранить слайды для использования

1. Снимите трубку с одного слайда из морозильной камеры-80 ° C 1 ч до предполагаемого использования.
2. Не открывайте сразу трубку. Разрешить трубки приехать в комнатной температуре. На внешней стороне трубки только будет происходить конденсация.
3. После того, как трубка пришел к комнатной температуре и все уплотнения пошли (приблизительно 30-40 мин.), снимите крышку и разоблачить слайд к комнатной температуре воздуха.
4. Разрешить на слайд, чтобы акклиматизироваться к комнатной температуре в течение 15 – 20 мин отпуск слайд внутри трубки с крышкой удалены.
   Примечание: Слайд теперь готов к НОК.

9. Лазерная захвата Microdissection клеток Пуркинье:

Примечание: Этот раздел протокола будет обсуждать только особенности, связанные с захвата клеток Пуркинье для последующих РНК последовательности. В этом разделе предполагается, что пользователь знаком с УФ лазер захвата микроскоп и аффилированных программного обеспечения.

1. Очистить микроскопа и коллекции Кап АРМ РНКазы дезинфектор.
2. В перчатках место слайда на микроскопе и 500 мкл непрозрачной крышкой в коллекции руку.
   Примечание: Всегда обеспечить правильную технику РНК путем очистки области работы с РНКазы обеззараживатель и использовать перчатках Касаясь слайд или непрозрачной крышкой. Перчатки могут быть удалены после слайд и Кап находятся на месте и начала захвата лазера.
3. При низком увеличении Совместите непрозрачный колпачок мозжечковой ткани, обеспечивая, что крышка охватывает всю территорию визуализирована в глаз кусок.
   Примечание: Только глаза часть микроскопа покажет, если центру непрозрачный Кап. Камера не будет показывать, если крышка центрируется над ткани. В зависимости от конструкции область захвата лазер визуализации через непрозрачные колпачок будет либо в глаз кусок только или визуализировать как глаз кусок, так и камеры.
4. Визуализировать мозжечковой слои с 5 x - 10 x объектив и поместите курсор над разделом, где молекулярный слой и слой клеток гранул пересекаются (слоя клеток Пуркинье).
5. Перейти к 40 X и визуализировать клеток Пуркинье.
   Примечание: Рисунок 1 и на рисунке 2 приведена Пример визуализации.
6. Начните захват клеток Пуркинье.
   Примечание: Для выполнения РНК последовательности, по крайней мере 5 нг РНК не требуется. Примерно 1600-2000 Пуркинье клетки привести достаточно РНК материала для виртуализации. РНК будет стабильной до 8 ч в Микроскоп. Энергии тест УФ и УФ фокус до сбора для обеспечения уровня являются правильными. Со временем ткани будет по-прежнему высыхает и энергии УФ и УФ фокус может потребоваться изменить.

10. РНК коллекции пост LCM

1. Подготовьте буфер lysis клетки (приготовить свежий каждый раз)
   1. Развести 2-меркаптоэтанол литического буфера на масштаба 1: 100 (10 μL:1 мл, соответственно). Буфер Lysis (RLT) приводится в Таблице материалов (#14 и #15).
2. Добавьте 50 мкл буфера lysis клетки в крышку непрозрачные, с крышкой вверх. Тщательно закройте трубку над крышкой.
3. Оставьте трубку вниз головой за 1 мин.
4. Вихревой трубе для 30 s и быстро спина литического буфера в нижней части трубки.
5. Возобновить трубки и повторите шаги 10.2-10,4.
6. Место труб, содержащей 100 мкл буфера lysis и РНК из морозильной камеры-80 ° C до тех пор, пока все образцы готовой и готовы к РНК добыча (Таблица материалов #14).

Результаты

Этот протокол описывает шаги для подготовки ткани мозга человека свежий замороженные посмертные УФ-LCM. Тщательной спецификации и аннотации приведены для криостата резки, как это может быть трудно вырезать свежий замороженные мозговой ткани с высокой степенью точнос?...

Обсуждение

Протокола, представленные здесь специально изменены нержавеющей подход в визуализации морфологически различные ткани для УФ-НОК. Этот метод предназначен для обеспечения максимальной целостности РНК для последующих прямой последовательности РНК, сохраняя при этом повышенный уровен?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.