JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Подробные протоколы для обоих в пробирке и в клеток селективного 2'-гидроксильные Ацилирование анализируемой грунтовка расширение (SHAPE) экспериментов для определения вторичную структуру пре мРНК последовательностей интерес присутствии малых молекул РНК таргетинг представленные в этой статье.

Аннотация

В процессе разработки лекарственных средств малых молекул РНК таргетинг желательно изучение структурных изменений после их взаимодействия с РНК последовательности. Здесь мы предоставляем подробный в пробирке и в клеток селективного 2'-гидроксильные Ацилирование анализируемой выдвижение праймера (SHAPE) протокол для изучения структурных изменений РНК в присутствии экспериментальный препарат для спинальной мышечной атрофии (SMA), выживание двигательных нейронов (SMN)-C2 и в экзона 7 пре мРНК гена SMN2. В пробирке формы последовательности РНК 140 нуклеотидов, содержащие SMN2 экзона 7 трансляции, полимераза T7 RNA, сложить в присутствии SMN-C2 и впоследствии изменена мягкая 2'-OH Ацилирование реагент, imidazolide 2-methylnicotinic кислота (NAI). Это 2'-OH-Най adduct далее зондируемой 32P-меченых грунтовка расширение и решены путем электрофореза геля полиакриламида (страница). И наоборот Ацилирование 2'-OH-элементная формы происходит на месте с SMN-C2 связаны клеточной РНК в живых клетках. Пре мРНК последовательность экзона 7 гена SMN2, наряду с формы индуцированной мутации в выдвижение праймера, затем был усиленный PCR и при условии соблюдения следующего поколения последовательности. Сравнение двух методологий, в пробирке форма является более экономически эффективным методом и не требуют вычислительной мощности для визуализации результатов. Однако в пробирке модель формы производные РНК иногда отличается от вторичной структуры в сотовой связи, вероятно из-за потери всех взаимодействий с RNA-связывая протеинов. В клеточной формы не нужно радиоактивного материала на рабочем месте и дает более точные вторичной структуры РНК в сотовой связи. Кроме того, форма в клеток обычно применяется для большего круга РНК последовательности (~ 1000 нуклеотидов) путем использования виртуализации нового поколения, по сравнению с в пробирке формы (~ 200 нуклеотидов), которая обычно основывается на анализе страницы. В случае, если экзона 7 в SMN2 пре мРНК, полученных in vitro и в клеток форму РНК модели схожи друг с другом.

Введение

Селективный 2'-гидроксильные Ацилирование анализируемой выдвижение праймера (SHAPE) — это метод измерения кинетики каждого нуклеотидов РНК последовательности интерес и выяснения вторичная структура единого нуклеотидом резолюция1. ФОРМУ методологии, оба в vitro условий2,3,4 (очищенная РНК в системе определенного буфера) и в живых клетках млекопитающих5,6, были разработаны для расследования на вторичном Структура средней длины РНК последовательности (обычно < 1000 нуклеотидов в ячейке фигуры и < 200 нуклеотидов в пробирке фигуры). Это особенно полезно для оценки структурных изменений в рецептор РНК после привязки к взаимодействующих РНК малые молекулы метаболиты2,4,,78 и учиться механистический действия молекул РНК ориентации во время наркотиков развития9,10.

РНК таргетинг лекарств недавно обращено внимание в научных лабораториях и в фармацевтической промышленности11,12 через различные подходы и стратегии13,14,15 ,16. Недавние примеры малых молекул РНК таргетинг для клинического использования двух структурно различных экспериментальных наркотиков, LMI-07017 и RG-791618,19, для спинальной мышечной атрофии (SMA), которые показали многообещающие результаты в фазе II клинических испытаний20. Обе молекулы были продемонстрированы цели выживания мотонейрона (SMN) 2 пре мРНК и регулировать процесс сращивания SMN2 ген6,17,21. Ранее мы продемонстрировали применение в пробирке и в клеток формы в рассмотрении целевой РНК структурных изменений в присутствии аналог RG-7916, известный как SMN-C26.

В принципе форма измеряет уровень 2'-OH Ацилирование каждого нуклеотидов РНК последовательности при наличии избыточного количества самостоятельно тушения Ацилирование реагента в непредвзято. Ацилирование реагент не является стабильным в воде, с коротким периодом полураспада (например, T1/2 = 17 s 1-метил-7-nitroisatoic ангидрид; или 1 M 7, ~ 20 мин на 2-methylnicotinic кислоты imidazolide, или Най)22 и нечувствительность к личности баз-23. Это приводит к более благоприятным Ацилирование 2'-OH-групп гибких оснований, которые могут быть преобразованы в точной оценки динамики Каждый нуклеотид. В частности нуклеотидов в паре базы обычно менее реактивно, чем один неспаренный для модификации реагента 2'-OH, Най и 1 M 7.

Глядя на источник шаблона РНК и где происходит 2'-OH ацилирование, форма обычно можно подразделить на форму in vitro и в клеток. В vitro формы использует очищенный T7 транскрипции РНК и не хватает сотовой связи в экспериментальные проекты. В-клеток форму шаблон транскрипции РНК и 2'-OH Ацилирование происходят в живых клеток; Таким образом результаты можно резюмировать структурная модель РНК в сотовой связи. В клеточной формы был передан как в естественных условиях формы для формы, в живых клетках в литературе24. Поскольку этот эксперимент выполняется не в животное, мы назвать этот эксперимент как форму в ячейке для точности.

Стратегии для этапа расширения грунт в пробирке и в клеток формы также отличаются. В пробирке форму обратной транскрипции останавливается в позиции Ацилирование 2'-OH присутствии мг2 +. Выдвижение праймера 32P-помечены таким образом появляется как группу в электрофореза геля полиакриламида (страница) и интенсивность группы пропорциональна Ацилирование скорость1. В-клеточной формы, обратная транскрипция генерирует случайные мутации в 2'-OH аддукт позиции присутствии Mn2 +. Мутационного скорость каждого нуклеотидов может быть захвачено в глубину секвенирование нового поколения, и форма реактивности в резолюции единого нуклеотидом затем может быть рассчитана.

Потенциальная проблема для фигуры в ячейке является низкое соотношение сигнал шум (то есть, большинство 2'-OH-групп неизмененным, в то время как неизмененное последовательности занимают большую часть read в последовательности следующего поколения). Недавно метод обогатить 2'-OH изменения РНК, упоминаемый как в естественных условиях щелкните ФИГУРУ (icSHAPE), был разработан в Чанг Лаборатория25. Этот метод обогащения может быть выгодным в изучении слабых малых молекул, таких как РНК взаимодействия, особенно в ходе допросов транскриптом широкий.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. в Vitro форму

Примечание: Протокол изменяется от опубликованного протокола1.

  1. Подготовка шаблона РНК
    Примечание: Шаблон для транскрипции T7 было приказано как синтетическим двуцепочечной ДНК (dsDNA) и усиливается либо вставки в вектора E. coli , несет в себе уникальную пару EcoRI/BamHI эндонуклеазы, например pET28a, или методом ПЦР. Протокол для амплификации PCR иллюстрируется ниже.
    1. Смешайте следующие материалы: 50 мкл ПЦР мастер смесь (см. Таблицу материалы), 2 мкл для каждого праймера в 10 мкм (см. таблицу 1 для последовательностей), 200 нг dsDNA шаблон в 2 мкл и 3 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и 41 мкл H2O. Алиготе в два PCR трубы (каждая трубка содержит 50 мкл реакционной смеси).
    2. Установите вверх тепловая велосипедист следующим: этап 1) 95 ° C за 30 сек; этап 2) 95 ° C в течение 20 сек; Этап 3) 56 ° C 20 s; Этап 4) 72 ° C для 20 s; этап 5) цикл обратно в сцене 2 для 30 циклов; этап 6) 72 ° C для 3 мин; и этап 7) бесконечные держат при температуре 4 ° C до следующего шага.
    3. Очищать Ампликон ПЦР путем извлечения фрагментов геля (см. Таблицу материалов и использовать протокол изготовителя). Элюировать ДНК продукт с 35 мкл буфера Tris-ЭДТА (TE), содержащий 10 мм трис (рН 8.0) и 1 мм ЭДТА, приносить 0,1 – 0,5 мкг/мкл шаблон. Нормализовать очищенная ДНК шаблон в 0.10 мкг/мкл.
      Примечание: При необходимости качество шаблона могут быть проанализированы на 1,8% геля агарозы с 0.10 мкг ДНК. Ожидается, что на геле однодиапазонный ДНК нужный шаблон.
    4. Настройка реакции транскрипции T7 (общий объем 40 мкл), добавив следующие материалы в ПЦР-пробирку: 4 мкл 10 x буфер реакции, 4 мкл АТФ, 4 мкл CTP, 4 мкл ГТФ, 4 мкл UTP, 4 мкл T7 фермента (см. Таблицу материалы) , 4 мкл очищенный Ампликон ПЦР из шага 1.1.3 (0,4 мкг) и 12 мкл диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной воды. Смешайте закупорить вверх и вниз 4 x. Инкубируйте при 37 ° C для 4 – 16 h в тепловая велосипедист или инкубатора 37 ° C.
      Примечание: Начните, чтобы настроить шаг 1.1.6, в то время как реакция на шаге 1.1.4 продолжается.
    5. Добавить 2 мкл DNase, смешивать, закупорить вверх и вниз 4 x и инкубировать при 37 ° C на 15 мин микс с равным объемом 2 x трис Борат ЭДТА (КЭ)-буфер образца мочевины (см. Таблицу материалы). Тепло при 70 ° C на 3 мин для инактивации.
    6. В РНКазы бесплатная бутылка, Смешайте 75 мл 40% раствора акриламида/bisacrylamide (29: 1, смотрите Таблицу материалы), 180.2 г мочевины и 50 мл 10 x TBE буфера (РНКазы бесплатно, см. Таблицу материалы). Положить бутылку на орбитальный шейкер (250 об/мин), до тех пор, пока растворяются все кристаллы мочевины (может занять до 2 ч). Отрегулируйте громкость до 500 мл с DEPC-лечение водой. Фильтр решение с мембраной 0.2 мкм (см. Таблицу материалы).
      Примечание: В этом процессе, Избегайте использования зеркального и перемешать бар для предотвращения загрязнения РНКазы. Раствор может храниться при температуре 4 ° C на срок до 1 года.
    7. Очистить два электрофорез стеклянные пластины надлежащего размера (16,5 см х 24 см) с дейонизированной водой и 70% EtOH, используя кусок Протирочная бумага. Совместите пластины с парой распорки 2,0 мм (плита с поверхностью силицированного лицом внутрь) и уплотнить пластин с лентой. Двухместный лента угол пластины для предотвращения утечки.
    8. В стакан смешать 200 мл раствора акриламида с шагом 1.1.6, 2.0 мл 10% раствора Аммония персульфат и 100 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED) с наконечником свободный РНКазы пипеткой путем смешивания быстро 30 s. наклона пластины на кусок крышки benchtop и залить решение от разрыв пластин. Нажмите пластину поднять любые пузыри и заложить плашмя на крышке benchtop пластину. Сразу вставить гребень и пусть гель полимеризоваться для по крайней мере 1 час.
      Примечание: Если гель будет использоваться в течение следующего дня, крышка в верхней части гель с куском влажной салфеткой и обернуть с больше кусок полиэтиленовой пленкой. Поместите его лежа плашмя на 4 ° C.
    9. Удалите ленту и зажима плиты электрофореза позицию. Снимите гребень и добавьте достаточное 1 x TBE буфер в верхней и нижней части водохранилища. Предварительно запустить гель для 30 минут 20 Вт.
      Примечание: При необходимости если содержание желаемых РНК ~ 90% или более, Мини-гель может использоваться взамен препаративные геля.
    10. Мыть каждый из скважин загрузки, закупорить вверх и вниз дважды с жидкости в резервуаре. Добавьте сырой РНК из шага 1.1.5 в скважины. Побегите гель на 20 Вт до тех пор, пока краска cyanol FF ксилола (светло-голубой) проходит примерно две трети длины гель (~ 60 мин).
      Примечание: Обеспечить, чтобы загрузить не более чем одной трети высоты также (при необходимости используйте несколько скважин).
    11. Погружать гель в 1 x TBE буфер с мэм разрежения безопасной краски (см. Таблицу материалы) в контейнере достаточно большой для геля. Поместите контейнер на орбитальный шейкер для 5 мин на 80 об/мин.
    12. Под УФ света определить нужный диапазон РНК и быстро вырезать тонкой полоске геля, используя чистые лезвия бритвы. Место 1-2 ломтика гель в 1,7 мл трубку.
    13. Восстановить РНК от среза геля, пассивной элюции. Добавить смесь адекватные элюции/осадков (~0.3 мл на ломтик) к каждой пробке: 0.3 M NaOAc (рН 5.2), 2,5 M LiCl, ЭДТА 1 мм, 0,1% лаурилсульфат натрия (SDS) в DEPC-лечение водой. Поворачивайте трубку, содержащую гель splice(s) на 4 ° C на 16 h.
      Примечание: Типичная восстановления составляет ~ 75% в этом шаге. Для увеличения урожайности, удалите и собирать элюента и добавьте такой же объем Элюирующий буфер, а затем повторите этот шаг.
    14. Объединить элюента в новой 1,7 мл трубки. Добавьте 2.5 x ледяной EtOH, инвертировать трубы шесть раз смешивать жидкости и трубы на-80 ° C для по крайней мере 1 час.
    15. Центрифуги для 10 мин на 10000 x g и 4 ° C. Тщательно удалите супернатант, закупорить. Помыть лепешка РНК путем добавления 80% EtOH (1 мл на трубы), вихрь для 15 s и центрифуги для 10 мин на 10000 x g и 4 ° C.
    16. Удалить супернатант и просушите РНК Пелле за 5 минут добавьте 50 мкл РНКазы свободной воды и перемешать, закупорить вверх и вниз по 10 раз. Нормализации концентрации РНК до 0,10 мкг/мкл. Хранить очищенную РНК-80 ° c.
      Примечание: Не чрезмерно сухие гранулы РНК.
    17. При необходимости, для анализа качества РНК, разбавьте 1 мкл (100 нг) РНК от шага 1.1.16 в 5 мкл воды и перемешать с 5 мкл буфера выборки КЭ мочевина 2 x. Затем тепла при 70 ° C 3 мин и нагрузки на 6% КЭ мочевина мини-гель.
      1. Запустите гель на 180 V на 1 ч. выполнение окрашивание как сделано в шаге 1.1.11. Визуализируйте гель с УФ в систему обработки изображений. Одно-диапазонная ожидается на нужной длины.
  2. Подготовка 32P-меченых грунтовка
    1. Настройка реакции, смешивая следующие материалы: 10 мкл γ -32P-АТФ (~1.5 mCi, ~ 25 мкм, см. Таблицу материалы), 2 мкл обратной транскрипции (RT) праймера (100 мкм, для последовательности см. таблицу 1), 2 мкл 10 x T4 полинуклеотид киназы (ПНК) реакция буфера, 1 мкл T4 PNK (см. Таблицу материалы) и 5 мкл РНКазы свободной воды. Инкубируйте при 37 ° C в течение 1 ч.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Надлежащая защита необходима шаги 1.2-1.5 в уполномоченных на рабочем месте для радиоактивных материалов.
    2. Инактивирует тепла для 20 мин на 65 ° C. Добавьте образцы на ЭЛОУ столбца и центрифуги на 1000 x g за 1 мин смешать элюента с 25 мкл пример буфера 2 x TBE-мочевина. .
      Примечание: Храните меткой сырой продукт при-20 ° C, если это не для того, чтобы быть очищены сразу же.
    3. Побегите гель акриламида 10% на 20 Вт на 1 ч.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Загрузить 32P-меченых грунт из шаг 1.2.1 на гель и избежать кровотечения радиоактивности в верхнем водохранилище. Не загружайте более чем одной трети высоты также обеспечить тонкой полоске на геле (при необходимости используйте несколько скважин). Жидкости в резервуаре дно может быть высоко радиоактивных.
    4. Удаление стекла кассеты гель и выложить гель на кусок полиэтиленовой пленкой. Сложите полиэтиленовой пленкой для покрытия верхней части геля сделать герметичный бутерброд. Поместите гель сэндвич на экране светомассы вольфрамат кальция и разоблачить изображений инструмент. Изображения геля снова с регулярные свет, чтобы знать, где находятся по краям геля.
    5. Использование программного обеспечения для обработки изображения для наложения двух изображений. Выровняйте геля на отпечатанного изображения. Используйте свежие лезвия бритвы вырезать нужную полос из геля. Место 1 до 2 гель ломтики в 1,7 мл трубку.
      Примечание: Убедитесь, что изображение имеет тот же размер, как фактическое геля. Дважды проверьте выравнивание изображения остатки геля снова после вырезания фрагментов геля.
    6. Восстановите 32P-меченых грунт, выполните шаги 1.1.13 для 1.1.16. Возьмите 1.0 мкл раствора в 0,4 мл трубку и размыть грунт с 1 x TE буфер для получения радиоактивности 1.0 мкл на ~ 100000 cpm. Храните очищенную 32P-меченых грунт-80 ° c до РНК реакции модификации 2'-OH, но не более чем 4 недели.
  3. Малые молекулы привязки и модификация 2'-OH РНК
    1. Подготовить четыре образца, добавьте 8 пмоль РНК в 32 мкл 0.5 x TE буфера до 1,7 мл трубки, тепла при 80 ° C в течение 2 мин и оснастки прохладно на льду, по крайней мере 1 мин.
      Примечание: Используйте следующее уравнение для расчета приблизительный вес молекулярного РНК: MW = (# баз) x 340 да.
    2. Добавьте 8 мкл 5 x складывания смесь, содержащая 500 мм HEPES (рН 8,0), 20 мм MgCl2и 500 мм NaCl. Аликвота 9 мкл РНК смеси в каждой из четырех ПЦР пробирок и маркировать их #1-#4. Добавить 1 мкл 10% ДМСО в #1 трубку, 1 мкл концентрированного малые молекулы раствора (10% ДМСО) в #2, 1 мкл разбавленного малые молекулы раствора (10% ДМСО) в #3 и 1 мкл воды в #4.
    3. Инкубируйте ПЦР трубы при 37 ° C в тепловой циклователь на 30 мин.
    4. Прямо перед реакции модификации 2'-OH развести 1 мкл Най Стоковый раствор (2 М) с 3 мкл DEPC-лечение водой для получения рабочего решения 0,5 М. Без промедления добавьте 1 мкл рабочего раствора в пробирки #1, #2 и #3 Най и 1 мкл 25% ДМСО в #4. Инкубируйте при 37 ° C в тепловой циклователь на 15 мин.
    5. Добавьте 100 мкл элюции/осадков смеси (см. шаг 1.1.13 рецепт), 2 мкл гликогена (15 мг/мл) и передавать все жидкости в каждую ПЦР-пробирку в 1,7 мл трубку. Добавьте 0.34 мл ледяной 200-доказательство EtOH (3 x объем) в каждую пробирку. Микс на vortexing для 5 s и место трубы в морозильной камере-80 ° C для по крайней мере 1 час.
      Примечание: В этот период приступайте к настройке последовательности гель для использования в шаг 1.5.1.
    6. Центрифуги для 15 мин при 14.000 x g и 4 ° C. Удалите супернатант не нарушая Пелле РНК. Помыть лепешка РНК путем добавления 80% EtOH (0,5 мл на трубы), вихрь для 15 s и центрифуги для 15 мин на 20000 x g и 4 ° C. Снова удалите супернатант.
      Примечание: При необходимости используйте Гейгера, чтобы радиоактивные Пелле, сохраняя в трубе.
    7. Просушите РНК Пелле за 5 минут добавить 9 мкл РНКазы свободной воды и перемешать, закупорить вверх и вниз по 10 раз.
      Примечание: Не чрезмерно сухие гранулы РНК. Ожидается, что быть распущен в конце этого шага все осадков.
  4. Расширение подготовки и грунтовка маркер
    1. Перенесите изменение РНК в 4 новые трубы ПЦР и маркировать их #1-#4 как ранее. Добавить 2 пмоль управления РНК в 7 мкл воды DEPC-лечение 4 дополнительные ПЦР-пробирки и маркировать их #5 – 8. Добавьте 2 мкл radiolabeled праймера (шаг 1.2.6) всех восьми трубок. Тепло для отжига при 65 ° C за 5 мин, затем Остудите до 4 ° C в тепловая велосипедист.
    2. Добавить 4 мкл 5 x RT буфера (см. Таблицу материалы), 1 мкл Дитиотреитол (DTT, 0.1 М) и 1 мкл dNTP смеси (по 10 мм) для каждого из восьми трубок ПЦР.
    3. Добавьте 2 мкл DEPC-лечение H2O трубы #1-#4. Добавьте 4 мкл ddATP (5 мм), 4 мкл ddTTP (5 мм) и 4 мкл ddCTP (5 мм) в пробирки #5 – 7, соответственно. Добавьте 1 мкл ddGTP (5 мм) и 3 мкл воды DEPC-лечение трубки #8. Пипетка четыре раза смешивать.
    4. Тепло на 52 ° C в течение 1 мин в тепловая велосипедист. Добавить 1 мкл обратной транскриптазы (см. Таблицу материалы), затем смешайте закупорить вверх и вниз четыре раза. Инкубируйте реакции на 52 ° C в течение 20 мин.
    5. Добавьте 1 мкл 5 M NaOH в каждой из трубок для гидролизуют РНК. Тепловые трубы на 95 ° C за 5 мин.
    6. Добавить 5 мкл 1 M HCl и повторить этанола осадков (шаги 1.3.5 и 1.3.6), за исключением опустить гликогена и перекачки жидкостей.
      Примечание: Если результаты шага 1.4.6 размывания региона в середине гель, известный как «соль фронт».
    7. Просушите ДНК Пелле за 5 минут добавить 10 мкл H2O и 10 мкл 2 x TBE-мочевина образец загрузки буфера и пипетки вверх и вниз по 10 раз, чтобы растворяться. Тепла при 70 ° C за 5 минут место трубы на льду перед загрузкой на геле.
  5. Анализ страницы
    1. Для приготовления геля полиакриламида 8% последовательности, выполните шаги 1.1.6 для 1.1.10 со следующими изменениями: используйте 100 мл 40% раствора акриламида/bisacrylamide (29: 1) подготовить 8% раствор акриламида и секвенирования гель стеклянные пластины (например, 46 x 57 см) с распоркой 0,4 мм.
    2. Загрузка 10 мкл пример из шага 1.4.7. Побегите гель на 65 Вт для 2 ч или до нижней краска достигает 3/4 геля.
      Примечание: Храните остальные образцов-80 ° C для повторения, при необходимости.
    3. Удаление Топ силицированного стеклянной пластиной, удалив распорка и аккуратно вставляя шпателем. Поместите кусок большой фильтр-бумаги для покрытия гель и аккуратно нажмите Разрешить гель присоединиться к фильтровальной бумаги. Начиная с нижнего конца, поднимите фильтровальная бумага и удалить гель из стеклянной пластины вместе.
    4. Поместите гель вместе с фильтровальной бумаги на кусок полиэтиленовой пленкой, достаточно большой, чтобы покрыть весь гель (фильтровальной бумаги вверх). Фильтр бумага/гель/пластик оберните сэндвич передать Гель осушитель с фильтровальной бумаги лицевой стороной вниз.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Чтобы избежать радиоактивного материала, использовать 3-4 больше частей больших фильтровальной бумаги между сэндвич гель и Гель осушитель.
    5. Сухие гель при 70 ° C для 1 h с вакуумом. Перевести гель сэндвич на кассету экрана хранения фото отбеленная фосфора. Разоблачить радиоактивности геля на экран для 4 – 16 ч.
    6. Место на экране хранения люминофора на изображений устройства и сканирования со средним разрешением (~ 30 мин).
      Примечание: Если на изображении гель улыбка как артефакт, используйте исправление программного обеспечения (например, Сафа) для обработки изображения в публикуемые качество. Имейте в виду, что стандартный маркер Лейн — 1 нуклеотидов дольше, чем 2'-OH модификации полос.

2. в клетки форму

  1. Конструкция праймера
    Примечание: В отличие от в пробирке форма форма в клеток не нужно создавать выражение кассеты. Однако, набор оптимальных грунт должен использоваться и должны быть оценены до формы эксперимент.
    1. Создайте по крайней мере три уникальных грунтовка пар, взрыв based праймер дизайн инструмента (например, грунт-взрыв). Для изучения пре мРНК в клетках человека, выберите генома человека (не транскриптом) в качестве справочной базы данных в параметры проверки грунтовка пара специфика. Выберите размер ампликон в диапазоне 200 – 1000-пары (bp).
    2. Извлечение геномной ДНК из ~ 106 клеток интерес с спин метод на основе столбцов с лечением РНКазы A и протеаза K (см. Таблицу материалов и использовать протокол изготовителя). Нормализовать очищенного геномной ДНК в 0,1 мкг/мкл буфера TE.
    3. ПЦР с протоколом испытание в шагах 1.1.1 и 1.1.2.
      Примечание: Набор желаемых грунт должен принести однодиапазонный на 1,8% агарозном геле.
  2. Подготовка и модификация 2'-OH
    Примечание: Для увеличения изобилия пре мРНК интерес, minigene с правильной последовательности под цитомегаловирусом (CMV) промоутер для составных выражений является transfected в клетки хозяина.
    1. Предварительно теплой питательной среды, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 x антибиотик смесь в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) при 37 ° C. Семя 293T клеток на 50% confluency за 24 часа до трансфекции в культурной среде. Изменения среды в 2% FBS в среде DMEM без антибиотиков ~ 1 ч до transfection.
    2. Добавьте 10 мкг minigene плазмид в 100 мкл сокращение сыворотке СМИ (см. Таблицу материалы) в 1 о 96-луночных пластины хорошо. Пипетка решение вверх и вниз четыре раза, чтобы перемешать.
    3. Добавить 40 мкл Реагента трансфекции (см. Таблицу материалы) в 100 мкл сокращение сыворотке СМИ в другой хорошо пластины. Пипетка вверх и вниз четыре раза, чтобы перемешать. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
    4. Добавьте решение всего плазмида в трансфекции реагент подвеска. Пипетка вверх и вниз четыре раза, чтобы перемешать. Инкубации при комнатной температуре за 30 мин.
    5. Добавьте все ДНК / смеси реагентов трансфекции прикапывают на поверхности среды на протяжении всего блюдо. Инкубируйте при 37 ° C для 6 – 12 ч.
    6. Аспирационная среднего и аккуратно мыть раз с 5 мл фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,4, без CaCl2 и MgCl2, см. Таблицу материалы). Trypsinize клетки с 3 мл раствора трипсина. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
    7. Стук блюдо осторожно отделить клетки из нижней части блюдо. Нейтрализовать трипсина с 6 мл питательной среды. Центрифуга на 300 x g 4 мин и удалить носитель.
    8. Ресуспензируйте ~ 106 клеток для каждого образца в 199 мкл реакция среды (1% FBS в среде DMEM) и переноса суспензию клеток в 96-луночных плиту. Инкубировать клетки с 1 мкл составного рабочего раствора или 1 мкл ДМСО в всех трех элементов управления для 30 минут при 37 ° C.
      Примечание: Три контрольных образцов должны быть включены: управления ДМСО с Най, денатурированной РНК с Най и Най отрицательного контроля.
    9. Добавьте 10 мкл 2 м NAI для каждого образца, за исключением денатурируя управления (DC) РНК и Най негативные элементы. Пипетка вверх и вниз четыре раза, чтобы перемешать. Инкубируйте при 37 ° C на 15 мин осторожно встряхните пластины вновь приостановить клетки каждые 5 мин.
    10. Переход клеток в 1,7 мл трубки и центрифуги на 400 x g на 2 мин без промедления. Удалите супернатант не нарушая Пелле ячейки.
    11. Добавить 0,4 мл Гуанидиновые тиоцианат (см. Таблицу материалы). Вихрь для 15 s для гомогенизации. Проинкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 5 мин.
      Примечание: Образцы можно хранить при температуре-20 ° C до перехода к следующему шагу.
  3. Извлечение RNA
    1. Добавьте 0,2 мл хлороформа для каждого из образцов тиоцианат гомогенизированные Гуанидиновые. Вихрь для 15 s. инкубировать при комнатной температуре на 2 мин.
    2. Центрифуги для 5 мин в 12000 x g и 4 ° C. Топ бесцветный водный слой содержит РНК. Трансфер ~ 380 мкл водный раствор в новой 1,7 мл трубку.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Не беспокоить интерфаза чтобы избежать загрязнения.
    3. Добавить 1,5 x тома EtOH (~ 570 мкл). Вихрь для 15 s смешивать.
    4. Передача 600 мкл РНК смеси в столбец спин изоляции РНК (см. Таблицу материалы). Центрифуга на 12000 x g для 15 s. отменить элюента. Повторите этот шаг, чтобы пройти через все жидкости в один и тот же столбец спина.
    5. Промойте колонку с 0,35 мл RW1 буфера (см. Таблицу материалы), крутя за 15 с. Добавить 80 мкл бесплатно РНКазы DNase RDD буфера (см. Таблицу материалы). Инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин.
      Примечание: Важно, чтобы удалить все загрязнения ДНК.
    6. Затем промойте колонку с 0,35 мл RW1 буфера и 0,6 мл 2 x RPE буфера (см. Таблицу материалы), спиннинг для 15 s на каждом шагу. Сухие столбце центрифугированием столбце спин с пустой коллекции трубки на 12000 x g за 1 мин.
    7. Добавление 32 мкл РНКазы свободной воды в центр столбца. Инкубировать 1 мин центрифуги на 12000 x g 30 s для получения ~ 30 мкл раствора очищенный РНК. Поместите образцы при-20 ° C при обработке денатурированного образца.
  4. Денатурированной РНК управления подготовка
    1. Место 30 мкл пример РНК для DC в 1,7 мл пластиковых труб на льду. Добавьте 50 мкл формамида и 15 мкл DC буфер, содержащий 300 мм HEPES (рН 8.0) и 25 мм ЭДТА в трубу.
    2. Тепла, чтобы денатурировать РНК на 95 ° C в течение 1 мин быстро добавить 5 мкл Най Стоковый раствор (2 М), а затем проведите дважды, чтобы смешивать и положил трубку обратно на Отопление блока. Инкубируйте на 95 ° C для дополнительного 1 мин, а затем сразу же положил трубку на льду.
    3. Добавьте 0,4 мл тиоцианат Гуанидиновые. Повторите шаги 2.3.1–2.3.4.
    4. Промойте колонку с 0,6 мл 2 x RPE буфера (см. Таблицу материалы), спиннинг для 15 s на каждом шагу. Сухие столбце центрифугированием столбце спин с пустой коллекции трубки на 12000 x g за 1 мин.
    5. Добавление 32 мкл РНКазы свободной воды в центр столбца. Инкубировать 1 мин центрифуги на 12000 x g 30 s для получения ~ 30 мкл раствора восстановить DC РНК.
  5. Выдвижение праймера
    1. Нормализовать раствор РНК из 2.3.7 и 2.4.5 в 0,5 мкг/мкл с РНКазы свободной воды. Свеже Подготовьте 30 мм НКД2 решения от НКД2∙4H2O порошок.
    2. Перевести 9 мкл раствора РНК для каждого образца в полосу ПЦР. Добавьте 1 мкл dNTP 10 мм и 1 мкл 2 мкм ген специфического праймера (ВСП) в каждой тюбике. Пипетка вверх и вниз четыре раза, чтобы перемешать. Инкубируйте на 65 ° C за 5 мин в тепловая велосипедист и положить на льду > 1 мин.
      Примечание: Кроме того 1 мкл случайных nonamer может использоваться в замене ВСП.
    3. В каждую ПЦР-пробирку добавить смесь 2 мкл 10 x буфер RT (см. Таблицу материалы), 4 мкл НКД 30 мм2, и 2 мкл, 100 мм DTT. Пипетка вверх и вниз 4 x смешивать. Инкубируйте на 42 ° C на 2 мин.
    4. Добавить 1 мкл обратной транскриптазы (см. Таблицу материалы). Пипетка вверх и вниз 4 x смешивать. Инкубируйте на 42 ° C в тепловой циклователь на 3 ч.
  6. Подготовка библиотеки и секвенирование нового поколения
    1. Настройка реакции PCR, добавив 1 мкл ДНК-полимеразы, 5 мкл 10 x буфер ДНК-полимеразы (см. Таблицу материалы), 2 мкл ДМСО, 1,5 мкл для каждого из грунтовки (10 мкм), 34 мкл H2O и 5 мкл cDNA от шага 2.5.4.
    2. Установите вверх тепловая велосипедист следующим: этап 1) 95 ° C на 2 мин; этап 2) 95 ° C за 30 сек; Этап 3) 60 ° C за 30 сек; Этап 4) 68 ° C за 30 сек; этап 5) цикл обратно в сцене 2 для 30 циклов; этап 6) 68 ° C 3 мин; и этап 7) бесконечные держат при температуре 4 ° C до следующего шага.
    3. Ампликон очищают с помощью геля агарозы 1,8%.
      Примечание: ПЦР группы должен появиться как одной полосы на геле.
    4. Постройте библиотеку с помощью стандартных фрагментации и перевязка методы, определенные в литературе6,26.
    5. За образец считывает последовательность на секвенирование нового поколения оборудования с помощью 1 x 75 сингл конца читает для создания примерно 10 миллионов.
    6. Анализировать результаты, используя ShapeMapper и SuperFold программное обеспечение пакеты, разработанные в недели группа26.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы ранее показало, что РНК сплайсинга модулятор, SMN-C2, взаимодействует с AGGAAG мотив на экзона 7 SMN2 ген пре мРНК и использовать форму для оценки структурных изменений РНК в присутствии SMN-C26. Привязка сайта SMN-C2 отличается от FDA утвержденных антисмысловых олигон...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В форме в лабораторных условиях важно использовать высокое качество однородной РНК шаблон. Однако, транскрипции T7, часто дает разнородные последовательности36. Особенно последовательности нуклеотидов ±1 на 3'-Отель terminus с не ничтожно малый урожайности36 обычно ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа стало возможным благодаря НИЗ R01 Грант (NS094721, K.A.J.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DNA oligonucleotideIDTgBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master MixThermo FisherF566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kitTakara740609.50
MegaScript T7 transcription kitThermo FisherAM1333Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated waterThermo Fisher750023
2x TBE-urea sample bufferThermo FisherLC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)Bio-Rad1610146
10x TBE bufferThermo Fisher15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter UnitThermo Fisher166-0045
KimwipeKimberly-Clark34133
TEMEDThermo Fisher17919
SYBR-Safe dyeThermo FisherS33102
6% TBE-urea mini-gelThermo FisherEC6865BOX
ChemiDocBio-Rad
T4 PNKNEBM0201S
γ-32P-ATPPerkin ElmerNEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying ScreenGE HealthcareRPN1669calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screenMolecular DynamicsBAS-IP MS 3543 E
Amersham TyphoonGE Healthcare
NAI (2M)EMD Millipore03-310
GlycoBlueThermo FisherAM9515
SuperScript IV Reverse TranscriptaseThermo Fisher18090010Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM)Thermo FisherR0192
ddNTP set (5 mM)SigmaGE27-2045-01
large filter paperWhatman1001-917
Gel dryerHoeferGD 2000
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34Addgene72287
Heat inactivated FBSThermo Fisher10438026
Pen-StrepThermo Fisher15140122
Opti-MEM IThermo Fisher31985062
FuGene HDPromegaE2311
TrpLEThermo Fisher12605010
DPBS without Ca/MgThermo Fisher14190250
TRIzolThermo Fisher15596018
RNeasy mini columnQiagen74104Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase SetQiagen79254Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamideThermo FisherAM9342
MnCl2•4H2OSigma-AldrichM3634
random nonamerSigma-AldrichR7647
SuperScript First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher11904-018Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerseThermo Fisher12344024
NextSeq500Illumina
NucAway columnThermo FisherAM10070for desalting purpose

Ссылки

  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205(2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959(2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143SHAPERG 7916

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены