JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для изучения патофизиологии пролиферативной диабетической ретинопатии, используя пациента производные, хирургического иссечена, сортопопуляциях тканей для трехмерных родной ткани характеристика и ex vivo культуры. Ex vivo культуры модель это также подходит для тестирования или разработки новых методов лечения.

Аннотация

Диабетическая ретинопатия (DR) является наиболее распространенным осложнением микрососудистой диабета и одной из ведущих причин слепоты в взрослых трудоспособного возраста. Нет текущего животных моделей диабета и кислорода индуцированной ретинопатии разработать полный спектр прогрессивные изменения, проявляющиеся в человека пролиферативной диабетической ретинопатии (PDR). Таким образом понимание патогенеза заболевания и патофизиологии опиралась главным образом на использование Гистологические срезы и стекловидного тела образцов в подходах, которые только предоставляют установившегося информацию о связанных патогенных факторов. Все больше фактов указывает, что динамических клеток и клеток внеклеточного матрикса (ECM) взаимодействия в контексте трехмерной (3D) микросреды важны для механистическим и функциональных исследований по созданию новых стратегии лечения. Таким образом мы предположили, что патологические сортопопуляциях ткани, хирургического иссечена от глаз с НДР может использоваться надежно разгадать молекулярных и клеточных механизмов этой разрушительной болезни и проверить потенциал для Роман клинических вмешательства. С этой целью мы разработали новый метод для 3D ex vivo культуры хирургического иссечена пациента производные сортопопуляциях ткани (FT), который будет служить соответствующей модели человеческого PDR патофизиологии. ФНС расчлененный в эксплантов и встроенных в фибрин матрицы для ex vivo культуры и 3D характеристики. Целом гора иммунофлюоресценции родной ПТС и концевой культур позволяет тщательное расследование состав ткани и многоклеточных процессов, подчеркнув важность 3D ткани уровень квалификации для выявления соответствующих функций Патофизиология PDR. Эта модель позволит одновременно оценки молекулярных механизмов, процессов сотовых/ткани и лечения ответы в контексте сложных динамических биохимические и физические взаимодействия в рамках архитектуры ткани НДР и микроокружения. Поскольку эта модель резюмирует PDR патофизиологии, она будет также поддаются для тестирования или разработки новых методов лечения.

Введение

Д-р является серьезным глазной осложнение диабета, болезни, которая достигла огромных масштабов в последние три десятилетия1. Спустя двадцать лет после диагноза, практически каждый пациент с сахарным диабетом типа 1 и 60% больных с типа 2 диабет настоящее признаки ретинопатии, делая диабет само по себе одной из ведущих причин слепоты в работе возраст взрослых2. По уровню микрососудистой дегенерация и ишемического повреждения DR подразделяется на не Пролиферативная DR (не Фунтовую) и пролиферативной DR (НДР). Терминальная стадия заболевания, НДР, характеризуется ишемии и воспаления индуцированной неоваскуляризации и фиброзных ответы на интерфейсе витреоретинальной. В необработанной условий эти процессы будут привести к слепоте вследствие кровоизлияния в стекловидное тело, сетчатки фиброза, тяговых отслойка и Неоваскулярная Глаукома3,4. Несмотря на недавние успехи текущие варианты лечения нацелены только DR этапов, включая диабетического макулярного отека и PDR, когда повреждения сетчатки уже последовало. Кроме того значительная доля пациентов доктора не воспользоваться текущей арсенале лечения, указывающее настоятельную необходимость улучшения лечения4,5,6.

Несколько других яn vivo болезни/развития и диабетической животных модели были разработаны на сегодняшний день, но никто из них не повторяет весь спектр патологических функций наблюдается в человека PDR7,,8. Кроме того все больше фактов указывает, что лечение ответы тесно связаны с состав ECM, а также пространственное расположение и взаимодействие между сотовой и ацеллюлярной микроокружения9. Мы, таким образом, изложенных разработать клинически значимых модель человека НДР, используя FT патологического материала, который обычно иссечена от глаз, претерпевает Витрэктомия частью хирургическое лечение PDR10.

Эта рукопись описывает протокол для 3D ex vivo культуры и характеристика хирургически подакцизным, НДР пациента производные патологических FT. Метод, описанный здесь был использован в недавней публикацией, которая продемонстрировала успешных деконструкции родной 3D пейзаж ткани НДР и резюме особенностей PDR патофизиологии, включая ангиогенных и фиброзных ответы ненормальное 11сосудистых структур. Эта модель также показал новые возможности, которые не могут быть оценены легко от гистологической шлифов, такие как пространственно ограничивается апоптоз и распространения, а также формирование сосудистой островок11. На 3D эндотелиальной сфероида культур для оценки его ангиогенных потенциал и эффективность ангиостатический молекул12стекловидного тела жидкость успешно использовался другими. В сочетании с в vitro 3D лимфатический эндотелиальных клеток (LEC) сфероида прорастания анализа с использованием PDR стекловидного тела как стимулятор, наша модель показало, что вклад обоих растворимых vitreal факторы, а также местные сигналы в пределах неоваскулярной ткани, как пока плохо понимали LEC участие в ЛНДР патофизиологии3,11. В управлении НДР витреоретинальная хирургия является регулярно осуществляется еще сложной процедурой. Как хирургические контрольно-измерительных приборов и методов наблюдаем непрерывное улучшение и изысканность, своевременной и консервативные удаления сортопопуляциях пролиферативной образца не только улучшает видение результатов, но также обеспечивает неоценимую ткани материал для расследование PDR патофизиологии и лечения ответов в сложных переводческих аспектах микроокружения живой ткани человека.

протокол

Это исследование было одобрено институциональных Наблюдательный Совет и этического Комитета больницы университета Хельсинки. Подписанный информированное согласие было получено от каждого пациента.

1. Подготовка решений, средств массовой информации и оборудования

  1. Подготовьте следующее оборудование до сбора сортопопуляциях ткани (FT) для обеспечения быстрой обработки.
    1. Стерильными автоклав два microdissection пинцет.
    2. Подготовка 1 x фосфат амортизированное saline (PBS), растворяя 1 предварительно взвешенный PBS таблетка (0,14 М NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO4-3) в 900 мл деионизированной воды и перемешайте, чтобы растворить. Отрегулируйте громкость водой до 1 Л и стерильные автоклав готовое решение. Магазин на RT.
    3. Соберите упомянутые выше решения и оборудование в корзине, вместе с одноразовые стерильные скальпель, стерильные 6-см клеток культуры блюдо и пять стерильные 12-ну клетки культуры пластин.
  2. Подготовьте раствор фибриногена в Хэнкс сбалансированный соли раствора (HBSS) 6 мг/мл, растворяясь в 5 мл HBSS, используя 50 мл трубки погружается в ванну с водой при 37 ° C, по крайней мере 1 h 30 мг человека фибриноген, плазминоген истощены.
    Примечание: Это решение может храниться на водяной бане (37 ° C) для 7 h (максимум 10 h) перед использованием.
  3. Подготовьте ex vivo питательной среды, добавив 5% плода телячьей сыворотки (FCS) или 5% сыворотки крови человека, 0,4% дополнение рост эндотелиальных клеток, 10 нг/мл рекомбинантного человеческого эпидермального фактора роста, гидрокортизон 1 мкг/мл и 50 мкг/мл гентамицина в коммерчески доступных Средний рост эндотелиальных клеток и держать на водяной бане при 37 ° C до использования. Хранить при 4 ° C до одного месяца.

2. сортопопуляциях ткани рассечение

  1. Соберите сортопопуляциях ткани (FT), которая была вырезана из человеческих субъектов, проходит транс конъюнктивы microincision витреоретинальная хирургия, на 23 или 20 колеи 3 портовый Парс plana Витрэктомия как часть витреоретинальная хирургическая управления НДР.
    Примечание: FT является подакцизным с помощью сегментации и расслоению, сократить, если необходимо с microscissors и удаляется из полости стекловидного тела с интраокулярной конец сцепление microforceps опытных витреоретинальной хирургом. Крайне осторожно необходимо принимать для удаления целой, неповрежденной футов без повреждения глазной структур, включая зрительного нерва или временных сосудистых аркада, где ткани патологического неоваскулярной наиболее часто находится. Размер подакцизным ткани является переменной величиной, обычно колеблется от 3 до 50 мм2.
  2. Держите FT в 6 см клетки культуры блюдо или 1,5 мл, содержащих 1 мл стерильного PBS на мокрый лед и передать его немедленно, чтобы исследовательская лаборатория для обработки.
    Примечание: Важно, что исследовательское подразделение (лаборатории зал) близки к физически больнице операционной комнате (OR) для сведения к минимуму передачи раз небольшой подакцизным FT. В этом случае передача занимает менее 5 минут и эксплантов внедренные в фибрин обычно в 1-1,5 ч (максимум 2 h) после хирургического удаления. Влияние времени передачи на 3D культуры будет должна быть проверена.
  3. FT в 6-см клетки культуры блюдо, содержащие 1 мл PBS при комнатной температуре (RT, 25 ° C) и получить изображения тканей с помощью Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа с задачей 5 x.
    Примечание: Изображения приобретаются для качественной оценки и документации. Это будет возможность наблюдать за ткани размер, плотность и общей композиции (например, сосудистых структур).
  4. Нарежьте FT ~ 1 мм2 штук под стереомикроскопом вертикально рассечение, используя стерильным скальпель и microdissection пинцет. Держите ткани, хорошо погруженной в PBS, в месте с помощью microdissection пинцет и выполнять четкие отрубы с использованием стерильным скальпель. Избегайте разрывая футов, как это изменит родной сортопопуляциях структур.
  5. Место каждого индивидуального кусок в колодец плиты культуры 12-ну ячейки, содержащие 1 мл стерильного PBS.
    Примечание: При необходимости, слегка распространения FT на пластину с помощью пинцета microdissection, до выполнения сокращений.

3. приведение вертикально фибрина гель капельки для характеризации Ex Vivo культуры и родного FT

  1. Стерильными фильтр готов фибриноген раствор, приготовленный на шаге 1.2 с 0,22 мкм фильтром монтируется в шприц 10 мл.
  2. Подготовка аликвоты раствор фибриногена (25 мкл на 1,5 мл) и держать на RT. Prepare Алиготе для фибринового гель / каждый кусок FT, полученные после вскрытия, и пару дополнительных аликвоты для тестирования фибрина гель формирования.
  3. Подготовить раствор HBSS, содержащих 4 единиц/мл тромбина и 400 мкг/мл Апротинин, называемый далее TA решение и держать на RT. Prepare столько TA решения по мере необходимости, в зависимости от количество штук, полученные после вскрытия (25 мкл раствора TA используется для каждого FT/fibrin гель) и дополнительную сумму (например, 250 мкл) для тестирования гель образование фибрина и обеспечения того, чтобы достаточно решение всей территории литья капель геля фибрина.
    Примечание: Тромбин является обязательным для полимеризации фибрина, хотя Апротинин добавляется предотвращения деградации фибрина геля сотовой протеаз, выраженные FTs13,14.
  4. Проверить сроки формирования фибрина гель: добавить 25 мкл TA решения aliquoted 25 мкл фибриноген раствор, приготовленный на шаге 3.2 и, используя другой пипетки, равным 50 мкл, смешать в трубе, закупорить и обойтись в блюдо культуры клеток 6 см , образуя вертикальный капли.
    Примечание: Образование фибрина гель должен проходить в ~ 1 мин. Если это занимает свыше 1,5 мин, концентрацию тромбина в TA раствор, приготовленный на шаге 3.3 можно увеличить, добавив больше Стоковый раствор тромбина. Десятая часть изначально использованный объем Стоковый раствор тромбина могут быть добавлены, неоднократно, пока гель образование фибрина происходит в течение 1,5 мин. Время формирования фибрина гель имеет решающее значение для трех размерности культуры, как гель быстрого формирования (в течение 1,5 минут) предотвращает FT кусок от тонуть к дну геля фибрина и таким образом контактирующих 2D пластиковые поверхности клетки Культура пластина, которая может привести к 2D клеточной адгезии и нарост.
  5. Один FT заготовку в центре одной скважиной 24-ну пластины с помощью стерильный пинцет и удалите любые излишки PBS, дозирование с 0,5-10 мкл пипетки избежание всасывания силы на FT. В случае ткани прилипает к пинцет, использовать дополнительные пинцет для помощи размещение кусок ткани на плите.
    Примечание: FT/фибрина гели также может быть приведен на 48-ну плита уменьшить использование реагентов. Однако это более сложным, как пространство является более ограниченным и фибрин будет распространяться, если он вступает в контакт с хорошо стены.
  6. Добавить 25 мкл раствора TA 25 мкл фибриноген решение aliquoted в шаге 3.2, и с помощью другой пипеткой равным 50 мкл смеси в трубе, закупорить. Обойтись на FT кусок хорошо размещены на плите, и пипетки вверх и вниз 2 - 3 раза для того, чтобы включить кусок FT в вертикальном капелька, обеспечивая 3D матрицы окружающие FT.
    Примечание: Убедитесь, что FT не придыханием во время закупорить и что без воздушных пузырей образуются. Убедитесь также, что смешивание, провидение и закупорить выполняются быстро как фибрин гель будет сформировать в течение 1,5 мин, как тестирование в шаге 3.4. Если приведение фибрина гели на табличке, 48-а, используйте вместо 20 мкл раствора фибриногена и 20 мкл раствора TA.
  7. Повторите шаги 3.5 и 3.6 для всех частей FT.
  8. Разрешить фибрина гели закрепить путем инкубации пластины в инкубатор культуры клеток при 37 ° C в атмосфере увлажненный с 5% CO2.
  9. После 0,5-1 ч, проверьте, что фибрина гель полностью формируется тщательно наклона пластины. Перейдите к шагу 3.10 когда гель не двигаться наклоне пластину, указывающее, что гель образование фибрина является полным.
  10. Наложение FT/фибрина гели с ex vivo питательной среды (600 мкл/хорошо в 24-ну плиты) или 300 мкл/колодец в 48-ну пластины дополнена Апротинин 100 мкг/мл. Пипетка средство мягко, drop-wise провидение.
    Примечание: Здесь, Апротинин используется для предотвращения деградации фибрина геля сотовой протеаз, выраженные FTs13,14. Ex vivo питательной среды дополнительно могут быть дополнены рекомбинантных факторов роста, такие как VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (см. Таблицу материалов)11.
  11. Место FT ex vivo культуры пластины обратно в 37 ° C, 5% CO2 клетки инкубатор культуры и культуры за желаемый период (например, 2 - 18 дней, более культуры, которую периодов будет должна быть проверена). Замените 50% средних свежих ex vivo культуры среднего каждые три дня.

4. «в матрице» изображений

  1. Получение изображений FT ex vivo культур в тот же день (день 0) и в установленные интервалы времени (например, каждый день), используя Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа, чтобы начать следовать за 3D роста.
    Примечание: Изображения, полученные может использоваться для количественной оценки FT нарост как общая длина двух перпендикулярных диаметров через экспланта11.

5. родной FT и Ex Vivo культуры концевой

Примечание: Гели FT/фибрин может быть культивировали ex vivo на желаемое время период (FT ex vivo культур) или фиксированной в тот же день (родной FT) для родной FT характеристика11.

  1. Исправить родной FT или FT ex vivo культур, заменив питательной среды с 1 мл/хорошо параформальдегида 4% в растворе PBS, за 1 ч на RT. Для родной гели FT/фибрина, исправить 0,5-1 ч после добавления ex vivo культуры среднего (если фибрина гели не имеют смоченной в среде, фиксация может повредить их).
    Примечание: Выполните этот шаг в зонт как параформальдегида коррозионные, токсичными и канцерогенными.
  2. Промойте FT/фибрина гели с тремя 5 мин моет в PBS (2 мл/хорошо).
  3. Заменить PBS с 2 мл/хорошо PBS, содержащие азид натрия 0,02% и хранить фиксированный фибрина гели на 4 ° C до дальнейшей обработки. Уплотнение пластины с парафином фильм для обеспечения что FT/фибрина гели не сушите в хранилище.
    Примечание: Выполните этот шаг в зонт как азид натрия является токсичным.

6. всего гора иммунофлюоресценции пятнать

Примечание: Этот протокол длится 5 дней и может быть прерван с ночи инкубаций где указано. Не позволяйте фибрина, гели сухой в любой точке. Все действия выполняются на RT, если не указано иное.

  1. Подготовьте следующие решения перед началом окраски протокол.
    1. После фиксации решение: подготовка 50: 50 ацетон: метанол решение путем смешивания равных количеств ацетона и метанола (например, 50 мл). Хранить при температуре от-20 ° C. Готовить это решение последний на день до окрашивания. Это решение может храниться обратно при-20 ° C и использоваться для последующих stainings.
      Примечание: Подготовьте это решение в Зонта как ацетон и метанола легковоспламеняющихся и опасных для здоровья.
    2. Блокирование решение: подготовить 15% плода бычьим сывороточным (ФБС), 0,3% октиловый фенола ethoxylate раствора в PBS на первое добавление 15% FBS в PBS. Добавить октиловый фенол ethoxylate и перемешать, чтобы распустить. Хранить при 4 ° C.
      Примечание: Это решение можно готовить в большом объеме заранее, хранящиеся в 15 мл аликвот при-20 ° C и разморожен перед использованием, в тот день, когда начинается окрашивание протокол. Используйте свежеприготовленный или свежей талой aliquote для каждого протокола, окрашивание.
    3. Моющего раствора: подготовка 1 Л PBS, дополнена 0,45% фенола октиловый ethoxylate путем добавления 4,5 мл октиловый фенола ethoxylate 995.5 мл ФСБ. Движение, чтобы распустить. Магазин на RT.
  2. Поднимите капельки тщательно от пластины с помощью площади обрезная шпателем из нержавеющей стали. Вначале отсоединить капли от края до отмены в центр и передавать колодец 12-ну пластины, содержащие 1 мл ФСБ.
    Примечание: Выполните после фиксации, моет и блокирование в этом формате пластины.
  3. После исправьте капель с 1 мл раствора ацетона: метанол ледяной 50: 50 ~ 1 мин (границы капель станет белым).
    Примечание: Выполните этот шаг в Зонта, как ацетон и метанола, опасны для здоровья.
  4. Промойте с 3-5 стирок в 2 мл PBS (капельки утонет в решении PBS при завершении регидратации).
    Примечание: Не прикасайтесь капельки кончиком пипетки как, после после фиксации, они закрепляемые на пластик. На протяжении всего протокола Избегайте аспирационных после исправления, антитела, блокирование и обмыв всасывания, решения, как это может повредить или полностью уничтожить капли. Вместо этого наклона пластины и тщательно удалить решения с помощью пипетки 500-5000 мкл.
  5. Центрифуга блокировки решение для 15 мин на 21 000 x g и 4 ° C для того, чтобы удалить мусор.
    Примечание: Решение может быть aliquoted в 1,5 мл пробирок для центрифугирования. Неиспользованный раствор можно хранить при 4 ° C и используется для всех соответствующих последующих шагов.
  6. Инкубировать капельки в 500 мкл преграждая разрешение для 2 ч на RT.
    Примечание: Чтобы уменьшить объем блокирования решение используется, плита может быть наклонена в на поддержке и может использоваться как 300 мкл раствора/капли.
  7. Подготовьте смесь основное антитело (по крайней мере 30 мкл/капли) в соответствующие разрежения в блокировании решения и центрифуги для 15 мин на 21 000 x g и 4 ° C.
  8. Передача капельки в раунд (U)-снизу 96-луночных пластину с помощью шпателя раунд обрезная и проинкубируйте с по крайней мере 30 мкл/капли смеси основное антитело на ночь при 4 ° C.
  9. На следующий день, передачи, капельки в 12-ну пластины содержащий 2 мл моющего раствора/Ну, промыть с тремя 5 мин моет первой, а затем с 9 30 мин смывки. Оставьте последний мыть (2 мл) на ночь при 4 ° C.
  10. На следующий день, три раза промойте PBS и передачи капельки в раунд (U)-снизу 96-луночных пластины.
  11. Во время мойки Подготовьте соответствующий вторичное антитело проспряганное Флюорофор смесь (разбавленных 1: 500, по крайней мере 30 мкл/капли) в блокировании решения и центрифуги для 15 мин на 21 000 x g и 4 ° C.
  12. Перевести капли в раунд (U)-снизу 96-луночных пластину с помощью шпателя раунд обрезная и проинкубируйте с по крайней мере 30 мкл вторичное антитело смеси, для 4 h на RT, защищенном от света.
    Примечание: Выполните все последующие инкубаций и стиральная защищены от света.
  13. Перенесите капли в 12-ну пластины, содержащий 2 мл стирки решение/колодец с помощью шпателя раунд обрезная, полоскание с тремя 5 мин моет сначала и затем с четырьмя моет 30 мин. Оставьте последний мыть (2 мл) на ночь при 4 ° C.
  14. На следующий день промойте гели с пятью моет 30 мин и затем в три раза с PBS. Оставьте последний мыть (2 мл) на ночь при 4 ° C.
  15. На следующий день, передачи капли в раунд (U)-снизу 96-луночных пластину с помощью раунд кромкой шпателя и изображение ядер, инкубации с 10 мкг/мл Hoechst ядерной пятно (по крайней мере 30 мкл/капелька) за 30 минут на RT.
    Примечание: Монтаж среднего дополнена 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) для counterstaining ядер в качестве альтернативы может быть использован. В этом случае этот шаг и шаг 6.16 пропускаются, перейти непосредственно к шагу 6.17.
  16. Перевести капли в 12-ну пластины, содержащий 2 мл PBS/скважины с помощью шпателя раунд обрезная и промойте три раза с PBS.
  17. Смонтируйте капельки на микроскопа следующим образом:
    1. Применить узкий слой быстрой закалки монтажа средних по краям coverglass квадратная 22 x 22 мм и высушить на ~ 1 минуту. Выполните этот шаг для каждой капли индивидуально, чтобы избежать чрезмерного затвердения монтажной среды.
      Примечание: Выполните этот шаг в зонт как средство быстрой закалки монтажа опасных для здоровья.
    2. Промойте капли путем погружения в колодец 12-ну пластины, содержащий 2 мл деионизированной воды и перенести на микроскопа, с помощью шпателя раунд обрезная. Удалите лишнюю воду с помощью небольшой кусок фильтровальной бумаги.
    3. Отказаться от 15 мкл antifade монтажа не упрочнения среды на капли.
      Примечание: в качестве альтернативы, если ядерной пятно "Хёхст" не был использован, монтаж среднего, содержащую 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) может использоваться.
    4. Аккуратно положение крышка стекла, с быстрой закалки монтажа средой перед микроскопический слайд над капли и пусть урегулировать.
      Примечание: Средство быстрого затвердевания будет придерживаться микроскопических слайдов и сохранить дроплет на месте.
  18. Повторите шаг 6.17 для всех капельки. Смонтируйте две капельки на каждом микроскопа.
  19. Пусть слайды просушите на RT для ~ 2 h и хранить при 4 ° C на ночь. Убедитесь, что слайды располагаются горизонтально и защищены от света.
  20. Изображение окрашенных родной или концевой FT ex vivo культур с помощью Конфокальный микроскоп или вертикальном эпифлуоресцентного микроскопа, оборудованные оптической секущей функции и 20 x или 40 x цель. Используйте функцию плитки для захвата большей площади ткани сразу.

Результаты

Более глубокое понимание свойств сортопопуляциях ткани НДР и выражения протеина опиралась главным образом на стекловидном образцов и тонких гистологические FT секции3,15,16,17. Разработать метод для т?...

Обсуждение

С учетом важности соответствующих тканей микроокружение для надежных функциональных клеток и молекулярные механистический результаты необходимо найти соответствующие экспериментальные модели, которые предоставляют этот ткани окружающей среды. Здесь описаны ex vivo PDR культуры м?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы признательны коллег медицинских и хирургических сетчатки, медсестер и весь персонал диабетической группы и витреоретинальной хирургии группы на отделение офтальмологии больницы университета Хельсинки за активное участие в вербовке пациентов. Мы благодарим Biomedicum молекулярной визуализации подразделение для визуализации объектов. Мы благодарим Анастасия Черненко за отличную техническую помощь. Это исследование было поддержано грантов от Академии Финляндии (KL), Университет Хельсинки (KL), Сигрид Juselius Foundation (KL), Фонд Йоханссон K. Альбин (KL), Финский институт рака (KL), Karolinska Institutet (KL), Финский фонд глаз (SL), глаз и Фонд банка тканей (SL), Мэри и Георг C. Эрнруутов фонд (SL) и HUCH клинических исследовательских грантов (TYH2018127 после TYH2016230, SL), фонд исследования диабета (SL, KL, AK, например), а также докторскую программу в биомедицине (EG).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
MicroforcepsMedicon07.60.03Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - SterileSwann-Morton0513Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm)Greiner Bio-One391-3210Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-wellGreiner Bio-One392-0049Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mLGreiner Bio-One391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mLGreiner Bio-One525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDFMilliporeSLGV033RSUsed to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mLBraun4606108VUsed to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLFisherFB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-wellNunc142475Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottomGreiner Bio-One392-0019Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless SteelVWR82027-528Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1Menzel/Fisher15727582Used for mounting
Microscope slidesFisherKindler K102Used for mounting
Absorbent paperVWR115-0202Used for mounting
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
PBS tabletsMedicago09-9400-100Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human PlasmaCalbiochem341578
Hanks Balanced Salt SolutionSigma-AldrichH9394-500MLUsed for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serumGibco10270106Used for preparing the blocking solution
Human SerumSigma-AldrichH4522Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/mlBiowestL0011-100
Endothelial cell media MV KitPromocellC-22120Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azideSigma-AldrichS2002Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
AcetoneSigma-Aldrich32201-2.5L-MUsed to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
MethanolSigma-Aldrich32213Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)Sigma-AldrichT9284Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mMLife Technologies62249For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting mediumSigma-Aldrich03989-100mlTOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powderSigma-AldrichT9549-500UN Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powderSigmaA3428Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
NameCompanyCatalog NumberComments
Growth factors
Recombinant human VEGFAR&D Systems293-VE-01050 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFCR&D Systems752-VC-025200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβMilliporeGF3461 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGFMillipore01-10650 ng/ mL final concentration
NameCompanyCatalog NumberComments
Primary antibodies
CD31 (JC70A)DakoM0823Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)DakoM716501-2Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)DakoM070129-2Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68ImmunoWayRLM3161Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)Cell Signalling9664Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)DakoM731429-2Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAPDakoZ0334Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67Leica MicrosystemsNCL-Ki67pUsed at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1R&D SystemsAF2089Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2MilliporeAB5320Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1ReliaTech102-PA32Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1R&D SystemsAF2727Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)MilliporeMAB3757Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)SigmaC6198Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
NameCompanyCatalog NumberComments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgGLife TechnologiesA-21202Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgGInvitrogenA-11012Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgGThermo ScientificA-11057Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgGThermo ScientificA-11036Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgGMolecular ProbesA-21468Used at 1:500 dilution
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscopeZeissFor imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscopeOlympusFor FT dissection
LSM 780 confocal microscopeZeissFor imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with ApotomeZeissFor imaging of whole-mount immunostained FT

Ссылки

  1. Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
  3. Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
  4. Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
  5. Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
  6. Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
  7. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
  8. Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
  9. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  10. Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
  11. Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
  12. Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
  13. Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
  14. Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
  15. Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
  16. Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
  17. Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
  18. Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
  19. Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
  20. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
  21. Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
  22. Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
  23. Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
  24. Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
  25. Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
  26. Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
  27. Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
  28. Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143Ex vivoneovessel

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены