JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Опухоли мочевого пузыря мышиных индуцированных с канцерогенных нитрозаминов N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). Поколение опухоли мочевого пузыря является неоднородной; Поэтому точной оценки бремени опухоли требуется до рандомизации для экспериментального лечения. Здесь мы представляем быстрый, надежный протокол МРТ для оценки размера опухоли и стадии.

Аннотация

Мышиных пузыря опухоли модели имеют решающее значение для оценки новых терапевтических возможностей. Опухоли мочевого пузыря, индуцированной с канцерогенных нитрозаминов (BBN) N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) выгодны над клеток линии на основе модели, потому что они тесно репликация геномной профили человека опухоли, и, в отличие от клеток модели и ксенотрасплантатов, они обеспечивают хорошая возможность для изучения immunotherapies. Однако поколение опухоли мочевого пузыря является неоднородной; Поэтому точной оценки бремени опухоли требуется до рандомизации для экспериментального лечения. Описанные здесь является BBN мыши модель и протокол для оценки мочевого пузыря рак опухоли бремя в естественных условиях с помощью последовательности быстрый и надежный магнитный резонанс (МР) (правда FISP). Этот метод является простым и надежным, потому, что, в отличие от УЗИ, Мистер зависит от оператора и позволяет для обработки простой после приобретения изображений и обзор. С помощью осевой изображений мочевого пузыря, анализ регионов интерес вдоль стенки мочевого пузыря и опухоли позволяют для расчета площади стены и опухоли мочевого пузыря. Это измерение коррелирует с ex vivo вес мочевого пузыря (rs= 0,37, p = 0,009) и стадии опухоли (p = 0.0003). В заключение BBN генерирует гетерогенных опухоли, которые идеально подходят для оценки immunotherapies, и МРТ может быстро и надежно оценить опухоли бремя до рандомизации для экспериментального лечения оружия.

Введение

Рак мочевого пузыря является пятым наиболее распространенной формой рака в целом, отвечает за примерно 80 000 новых случаев заболевания и 16 000 смертей в Соединенных Штатах в 2017 году1. Примерно через 30 лет без значительных успехов для системного лечения рака мочевого пузыря2недавние испытания ингибитора анти PD-1 и анти PD-L1 КПП продемонстрировали захватывающие и иногда прочный ответы больных с передовой Urothelial карцинома3,4,5. Однако только около 20% больных показывают объективный ответ на эти процедуры, и необходимы дальнейшие исследования для расширения эффективного использования иммунотерапия больных с раком мочевого пузыря.

Мышиных мочевого пузыря рак модели являются важнейшими инструментами в доклинической оценке Роман лечения6,7. Для того чтобы контролировать размер опухоли при случайной мышей для различных методов лечения, опухоль бремя должны оценивать и контролируемых между группами лечения. Предыдущие исследования использовали УЗИ или биолюминесценции для оценки ортотопическая клеток на основе линии мочевого пузыря рак модели8,9,10,11. Однако оба методы представляют несколько недостатков. Ультразвуковых измерений могут зависеть от навыков оператора и отсутствие трехмерные характеристики и высокое пространственное разрешение. Биолюминесценции методы обеспечивают только полу количественной оценки опухолевых клеток и не позволяют для визуализации мочевого пузыря анатомии и морфологии. Кроме того биолюминесценцию может использоваться только с моделями на основе линии клеток, которые выражают биолюминесцентных генов в лысых мышей или мышей с белым пальто.

Магнитно-резонансная томография (МРТ), с другой стороны, предлагает уникальную гибкость в приобретении анатомических изображений с высоким разрешением, выставляют широкий спектр тканей контраст, который позволяет точную визуализацию и количественной оценки бремени опухоли без необходимости выразить биолюминесцентных свойства. Г-н изображения более легко воспроизводимые с соответствующий анализ трубопроводов и процедуру визуализации мочевого пузыря. Крупнейший ограничения МРТ, продолжительность времени, необходимого для обследования и связанные высокие затраты, которые ограничивают анализов высокой пропускной способности. Однако несколько исследований показали, что г-н последовательностей может предоставить диагностические изображения высокого качества, которые могут использоваться для эффективного выявления и мониторинга клетки опухоли мочевого пузыря, на основе линии; Таким образом они могут использоваться для высокой пропускной способности анализа9,12.

Здесь мы описываем неинвазивный метод, основанный на MR, надежно и эффективно охарактеризовать канцероген индуцированной пузыря опухолей у мышей. Для этого мы используем быстро изображений с установившемся прецессии MR техника (правда FISP), который гарантирует короткие сканирования сессий, обеспечивая высокое качество и высокое пространственное разрешение (~ 100 мкм) для обнаружения и измерения мочевого пузыря опухоли13. Кроме того чтобы подтвердить точность этой неинвазивной пробирного МРТ, мы описываем корреляции между МРТ производные параметры и ex vivo вес мочевого пузыря, а также стадии патологически подтвердил опухоли.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Северо-Западного университета.

1. индукции опухоли с BBN

  1. Получение самцов мышей C57/BL6, каждая по крайней мере 6 недель.
    Примечание: Мышей-самцов развиваться рак мочевого пузыря, более быстро и последовательно, чем самок мышей14,15.
  2. Добавьте N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) Амин (BBN) в дозе 0,05% питьевой воды. Сохранить его в контейнере непрозрачной и предоставить ad libitum как питьевая вода для мышей16.
    Примечание: Хранение BBN решение в контейнере ясно будет деградировать канцероген17.
  3. Измените 0,05% BBN воды два раза в неделю.
  4. Мониторинг животных, проверяя для признаки бедствия, связанные с опухоли мочевого пузыря, включая гематурия, фирма мочевого пузыря и масс. Осмотрите мышей дважды в неделю или в соответствии с местными IACUC руководящих принципов.
  5. Ожидаете опухоли развивать между 16 и 24 недель воздействия18.

2. МРТ установки

  1. Выполните подкожного введения стерильного физиологического раствора (0,1 – 0,2 мл, с помощью иглы и 1 мл шприца 25 – 27 G) 10 мин до МРТ для облегчения наполнения мочевого пузыря.
  2. Анестезировать каждая мышь с газовой смеси 100% O2 и изофлюрановая (2%-4% в случае необходимости). Проверка надлежащего плоскости анестезии путем проверки вывода рефлекс (мыс пинча) прежде. Применить стерильная глазная мазь для животного.
  3. Передача мыши владельцу изображений с ураном для доставки ингаляционных изофлюрановая (0,5%-3%).
  4. Следить за температурой тела и дыхания, используя ректальной температуры зонда, подключенных к компьютеру физиологических записи.
    Примечание: Нормальной температуры тела (36 — 37 ° C) поддерживается с помощью рециркуляции горячей воды цепи, построен в животных держатель MR. Температура измеряется через ректальным датчиком и записанные на физиологические мониторинга компьютера, используя выделенный физиологического мониторинга программного обеспечения. Та же система используется для записи дыхания и ЭКГ сигналов измеряется через пневматические подушки под грудной клетки и через электроды ЭКГ 3-свинца. Дыхание сигнала также используется для запуска приобретения МРТ и уменьшения артефактов, связанных с движением дыхания.

3. МРТ изображения приобретение

  1. Используйте катушки тела квадрирования для возбуждения.
  2. Место 4-канальный приемник катушки на нижней части живота мыши проверяемых для оптимизированного обнаружения сигналов от региона интерес.
  3. Инициируйте автоматической корректировки путем комплексной визуализации программного обеспечения приобрести tri осевой набор изображений тела всей мыши. От этого ссылка набора изображений Определите области интереса (в данном случае, область мочевого пузыря).
  4. Приобрести три набора ортогональных нарезанных изображений вдоль аксиальная, фронтальная и сагиттальная плоскости, с использованием радиологических отсчета.
  5. Использовать истинный FISP изображений последовательности (включены как одна из функций в комплексной обработки изображений) с указанными ниже параметрами MR: TR = 900 МС, TE = 2 мс, FA = 70, 14 средние.
    Примечание: Этот набор параметров позволяет для быстрой обработки изображений с высоким качеством диагностики, в том числе Утяжеление T1/T2 в < 10 мин на мышь.
  6. Пространственное резолюции и кусочек толщиной определяются геометрические параметры, выбранные пользователем через графический интерфейс интегрированной платформы обработки изображений. Это приводит к серии фрагментов через весь пузыря толщиной 0,5 мм с разрешением в плоскости 0,148 мм.

4. г-н анализ изображений

  1. Определите набор ломтиками толщиной 0,5 мм и в плоскости резолюции 0,148 мм, охватывающих весь мочевого пузыря.
  2. Экспорт программного обеспечения анализ медицинских изображений, выбрав папку с соответствующими изображениями в формате ANALYZE.
  3. Выберите «представитель осевой вид» в центре пузыря для количественного анализа, прокрутка изображений, созданных и выявления кусочек на середину мочевого пузыря, который позволяет для визуализации стенки мочевого пузыря и люмен.
    Примечание: Центр срез должен быть выбрали один с большим диаметром.
  4. Тщательно разграничить области интереса (ROI) вручную трассировки границ вокруг внешнего края мочевого пузыря (BLAвне) и внутренний просвет (БЛАв) мочевого пузыря (см. схема и представительных цифры на рисунке 2) в выбранном представлении представитель осевой.
  5. Вычтите внутренний просвет от внешнего края к вычислить площадь поверхности стенки мочевого пузыря.
    БЛАстены = блавне - блав
    Примечание: Площадь поверхности мочевого пузыря управления с не опухоль, как ожидается, будет меньше, чем с опухоли мочевого пузыря.

5. эвтаназии и вскрытия мочевого пузыря

  1. После 20 недель BBN воздействия усыпить мышей с использованием стандартных оперативных процедур в соответствии с местными IACUC руководящие принципы.
  2. Чистота области разреза с 70% этанола, а затем понять и снять кожу брюшной стенки с щипцами.
  3. Сделайте срединной линии разреза от лобковой симфиза до мечевидного отростка.
  4. Резко надрезать брюшной полости, схватив с щипцами и промо с ножницами.
  5. Определите пузырь, который расположен в средней линии нижней части живота.
  6. Выявить и сократить средний пупочной связки, соединяющий купол мочевого пузыря в пупок и брюшной стенки.
  7. Захватите купол мочевого пузыря с щипцами для обеспечения countertraction и вскрыть мочевого пузыря от окружающих структур, включая семенные пузырьки, прямой кишки и жира.
  8. Идентифицировать мочеточников, мочевого пузыря ввода и резать с ножницами недалеко от мочевого пузыря.
  9. Подъема пузыря краниально, вырезать уретры с ножницами и удаление мочевого пузыря.
  10. Сразу же весят мочевого пузыря после промывки с PBS.

6. гистологическое обследование ткани мочевого пузыря

  1. Исправьте ткани мочевого пузыря в нейтральных буферизации формалина 10% для 36-48 ч при комнатной температуре (RT).
  2. Внедрить в блоков парафина ткани, вырезать слайды для последующего изучения и выведение слайды с гематоксилином и эозином для микроскопического исследования как описано ранее,19,20.
  3. Выполните микроскопическое исследование мочевого пузыря мыши на низком уровне (2,5 x и 10 x) и высокой (20 x и 40 x) увеличений, изучению макроскопических поражений, гиперплазия, рак на месте, папиллом, папиллярных опухолей и инвазивных новообразования19 , 21.

Результаты

Используя протокол описал (рис. 1), опухоли мочевого пузыря были наведены в самцов мышей C57/B6. МРТ была исполнена на 16 недель, и мышей были умерщвлены в 20 недель. Ex vivo мочевого пузыря весов (BW) для каждой мыши были записаны. Слайды окрашивали гематоксил?...

Обсуждение

Точная визуализация моделей опухоли необходим для соответствующей предварительной эвтаназии промежуточной и животных рандомизации до начала экспериментального лечения. С помощью процедуры, представленные здесь, мы демонстрируем методологии (1) генерировать опухоли мочевого пузыря ...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

J. J. M. финансируется ветеранов здравоохранения администрации заслуги Грант BX0033692-01. J. J. м. также поддерживается Фондом Джона P. Hanson для исследований рака университета Роберт H. Лурье всеобъемлющем Рак центр из северо. Мы благодарим центр для трансляционного Imaging за приобретение МРТ и обработки. Источники финансирования имел никакой роли в письменной форме рукописи или решение представить для публикации.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 miceThe Jackson Laboratory664Mice
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN)TCI AmericanB0938Carcinogen
0.9% normal salineHospira, IncNDC 0409-488-02
IsofluranePiramal HealthCare60307-120-25Anesthetic
7Tesla ClinScan MRIBrukerNADedicated Small Animal Imaging MRI
SyngoSiemensNAMR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating SystemSmall Animal Instruments, Inc. (SAII)NASmall animal physiologic monitoring
Formalin, Neutral Buffered, 10%SigmaHT501128Fixative
Eosin YFisher ScientificNC1093844Histologic staining agent
HematoxylinFisher Scientific23-245651Histologic staining agent
Jim7Xinapse SystemsNAMedical image analysis software
GraphPad Prism v7.04GraphpadNAGraphing software
R v3.4.2The R Project for Statistical ComputingNAStatistical software
R package pROC v1.10.0.The R Project for Statistical ComputingNAROC analysis

Ссылки

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Abdollah, F., et al. Incidence, survival and mortality rates of stage-specific bladder cancer in United States: a trend analysis. Cancer Epidemiology. 37 (3), 219-225 (2013).
  3. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. The Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  4. Sharma, P., et al. Nivolumab monotherapy in recurrent metastatic urothelial carcinoma (CheckMate 032): a multicentre, open-label, two-stage, multi-arm, phase 1/2 trial. The Lancet Oncology. 17 (11), 1590-1598 (2016).
  5. Bellmunt, J., et al. Pembrolizumab as Second-Line Therapy for Advanced Urothelial Carcinoma. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1015-1026 (2017).
  6. Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU International. 104 (9), 1286-1291 (2009).
  7. Zhang, N., Li, D., Shao, J., Wang, X. Animal models for bladder cancer: The model establishment and evaluation (Review). Oncology Letters. 9 (4), 1515-1519 (2015).
  8. Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75 (4), 799-804 (2010).
  9. Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. The Journal of Urology. 145 (6), 1297-1301 (1991).
  10. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU International. 101 (1), 120-124 (2008).
  11. Vandeveer, A. J., et al. Systemic Immunotherapy of Non-Muscle Invasive Mouse Bladder Cancer with Avelumab, an Anti-PD-L1 Immune Checkpoint Inhibitor. Cancer Immunology Research. 4 (5), 452-462 (2016).
  12. Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. Journal of Urology. 170, 1375-1378 (2003).
  13. Chung, H. W., et al. T2-weighted fast MR imaging with true FISP versus HASTE: comparative efficacy in the evaluation of normal fetal brain maturation. American Journal of Roentgenology. 175 (5), 1375-1380 (2000).
  14. Miyamoto, H., et al. Promotion of bladder cancer development and progression by androgen receptor signals. Journal of the National Cancer Institute. 99 (7), 558-568 (2007).
  15. Bertram, J. S., Craig, A. W. Specific induction of bladder cancer in mice by butyl-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine and the effects of hormonal modifications on the sex difference in response. European Journal of Cancer. 8 (6), 587-594 (1972).
  16. Nagao, M., et al. Mutagenicity of N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine, a bladder carcinogen, and related compounds. Cancer Research. 37, 399-407 (1977).
  17. Hirose, M., Fukushima, S., Hananouchi, M., Shirai, T., Ogiso, T. Different susceptibilities of the urinary bladder epithelium of animal species to three nitroso compounds. Gan. Gann; The Japanese Journal of Cancer Research. 67 (2), 175-189 (1976).
  18. Shin, K., et al. Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma. Nature Cell Biology. 16 (5), 469-478 (2014).
  19. Epstein, J. I. Chapter 17: Immunohistology of the Bladder, Kidney, and Testis. Diagnostic Immunohistochemistry. , 624-661 (2019).
  20. Cohen, S. M., Ohnishi, T., Clark, N. M., He, J., Arnold, L. L. Investigations of rodent urinary bladder carcinogens: collection, processing, and evaluation of urine and bladders. Toxicologic Pathology. 35 (3), 337-347 (2007).
  21. Wood, D. P. Tumors of the bladder. Campbell-Walsh Urology. 11 (92), 2184-2204 (2016).
  22. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. , (2016).
  23. Kaneko, S., Li, X. X chromosome protects against bladder cancer in females via a KDM6A-dependent epigenetic mechanism. Science Advances. 4 (6), eaar5598 (2018).
  24. Smilowitz, H. M., et al. Biodistribution of gold nanoparticles in BBN-induced muscle-invasive bladder cancer in mice. International Journal of Nanomedicine. 12, 7937-7946 (2017).
  25. Dai, Y. C., et al. The interaction of arsenic and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine on urothelial carcinogenesis in mice. PLoS One. 12 (10), e0186214 (2017).
  26. Williams, P. D., Lee, J. K., Theodorescu, D. Molecular Credentialing of Rodent Bladder Carcinogenesis Models. Neoplasia. 10 (8), (2008).
  27. Fantini, D., et al. A Carcinogen-induced mouse model recapitulates the molecular alterations of human muscle invasive bladder cancer. Oncogene. 37 (14), 1911-1925 (2018).
  28. . NCCN Guidelines in Clinical Oncology - Bladder Cancer 5.2018 Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/bladder.pdf (2018)
  29. Costa, M. J., Delingette, H., Novellas, S., Ayache, N. Automatic segmentation of bladder and prostate using coupled 3-D deformable models. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention. 10 (Pt 1), 252-260 (2007).
  30. Rosenkrantz, A. B., et al. Utility of quantitative MRI metrics for assessment of stage and grade of urothelial carcinoma of the bladder: preliminary results. American Journal of Roentgenology. 201 (6), 1254-1259 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

145BBN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены