Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes-опосредованной трансформации картофеля и промоутер активность гена суберин путем окрашивания ГАС

Sandra Fernández-Piñán; Jennifer López; Iker Armendariz; Pau Boher; Mercè Figueras; Olga Serra

doi:10.3791/59119

АВТОРЫ

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Method Article

Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes-опосредованной трансформации картофеля и промоутер активность гена суберин путем окрашивания ГАС

DOI:

10.3791/59119

⸱

March 29th, 2019

Sandra Fernández-Piñán¹, Jennifer López¹, Iker Armendariz¹, Pau Boher¹, Mercè Figueras¹, Olga Serra¹

¹Department of Biology, Universitat de Girona

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Резюме

Здесь мы представляем два протокола для преобразования растений картофеля. Agrobacterium tumefaciens преобразование приводит к полной трансгенных растений в то время как Agrobacterium rhizogenes производит трансгенных волосатые корни в стрелять дикого типа, который может быть самостоятельной распространенный. Мы затем обнаружить промоутер активность GUS пятнать в преобразованной корни.

Аннотация

Agrobacterium sp. является одним из наиболее широко используемых методов для получения трансгенных растений, поскольку он имеет возможность передачи и интегрировать свой собственный T-ДНК генома растений. Здесь мы представляем два преобразования систем генетически изменить растений картофеля (Solanum tuberosum). В A. tumefaciens трансформации зараженные листья, трансформированных клеток выбираются и новый полный преобразованные завод генерируется с использованием фитогормонов в 18 недель. A. rhizogenes трансформации стебли зараженных инъекционных бактерии с помощью иглы, новых появившихся преобразованные волосатые корни обнаруживаются с помощью маркера красных флуоресцентных и корни-трансформированных удаляются. В 5-6 недель результатом завод представляет собой совокупность дикого типа стрелять с полностью развитой преобразованные волосатые корнями. Для увеличения биомассы, преобразованные волосатые корни можно подакцизным и распространяются самостоятельно. Мы применяли оба методы трансформации Agrobacterium -опосредованной получить корни, выражая GUS Репортер ген обусловлен промоутера суберин биосинтетических генов. GUS пятная процедуру предоставляется и позволяет ячейки локализации промоутер индукции. В обоих методах корни преобразованные картофеля показал, что окрашивание в suberized эндодермы и exodermis и Кроме того, а. rhizogenes преобразован корни активность GUS GUS был также обнаружен в появление боковых корней. Эти результаты показывают, что а. rhizogenes может быть быстро альтернативных инструментом для изучения генов, которые выражаются в корни.

Введение

Помимо экономических интересов поколение трансгенных растений имеет свою собственную значимость в исследованиях продемонстрировать конечной функции генов и лучше понять физиологии растений и развития. Наиболее широко используемый метод для растений ДНК вставки Agrobacterium-опосредованной трансформации. Agrobacterium tumefaciens способен генерировать Корона галлов в инфицированных тканях многих видов растений под действием его опухоль заставить плазмида (Ti). Плазмида содержит область T-ДНК с набором генов, которые будут интегрированы в генома растений и побудить ткани дифференцировке¹^,². Обмен этих генов в T-ДНК, трансген позволила поколения изменения конкретных растений, избегая Фенотипическая воздействию³. Для облегчения трансген, клонирование в T-ДНК, регионе T-ДНК был вырезан в независимой плазмида, называемый двоичной плазмида, а остальные гены плазмида Ti были (генов вирулентности, которые позволяют механизмы передачи и вставки T-ДНК) помещены в вспомогательный плазмиды. Для исследования в области биотехнологии растений, преобразование A. tumefaciens имеет ряд преимуществ: она не нужны дорогие устройства, способен генерировать как завод стабильного и переходных преобразований, так и небольшого числа генов, копии интегрированы в хромосома⁴. Однако для большинства растений, но не арабидопсиса, поколение стабильной трансформантов требует регенерации растений из одного или нескольких клеток с помощью экзогенных фитогормонов, делая этот процесс трудоемкий и требует много времени. A. rhizogenes также возможность изменения генома растений, производства волосатые корни или придаточных корней на сайтах инфекции из-за экспрессию генов рол ( локусовкорень), закодированы в плазмиду вызывая корень (Ri)⁵. Хотя менее изучены чем A. tumefaciens, а. rhizogenes также используется для получения трансгенных корни. В этом случае, а rhizogenes содержит оригинальные T-ДНК в Ри плазмиды и двоичные плазмида с второй T-ДНК, перевозящих трансген. Когда сайт инфекции в стеблях или гипокотиля, композитный растений могут быть получены, с новой волосатые трансгенных корнями, переживших побеги дикого типа. В качестве альтернативы волосатые преобразованные корни могут расти автономно в пробирке в СМИ с входными данными источника углерода. Использование A. rhizogenes вместо A. tumefaciens производить трансгенной ткани приобретает актуальность, когда корень является органом-мишенью, потому что завод регенерации не требуется, и следовательно это быстрее и менее дорогостоящим. Предыдущие исследования показали эту методологию, ассигнованных для фенотипические характеристики корневого конкретные гены⁶^,^,⁷⁸^,⁹.

Картофеля (Solanum tuberosum) является четвертым наиболее важных сельскохозяйственных культур в мире согласно данным Продовольственной и сельскохозяйственной Организации Объединенных Наций (ФАО), поскольку клубень имеет питания актуальность для потребления человеком за то, что является хорошим источником витаминов и минералов. По этой причине картофель был помещен в центре внимания сельскохозяйственной биотехнологии и также считается хорошим биологической модели для генетических и развития исследований в¹⁰^,¹¹. Значительный вклад в понимание молекулярных механизмов базовой suberized тканей через характеристика генов, участвующих в суберин и воск биосинтез¹²^,¹³^,^{14 трансформации картофеля} ^,^,¹⁵¹⁶^,¹⁷, суберин мономера транспорт¹⁸ и транскрипции правила¹⁹. Суберин feruloyl трансферазы генов, FHT, является одним из этих характеризуется биосинтетических генов; его Даунрегуляция порождает сильное ухудшение Перидерма защиты, которая коррелируется с сильным снижением ferulate эфиры суберин и воски в клубни картофеля¹⁴. Одновременно в корни и семена Arabidopsis, нокаут своего предполагаемого orthologue (ASFT/RWP1) также продемонстрировал свою роль в производить алкиловые ferulates в суберин²⁰^,²¹. В картофеля линии репортер transcriptional FHT и антитела FHT показал соответственно что промоутер активность и белка расположены в exodermis, эндодермы, phellogen производные и раненых тканей¹⁵.

В этой работе мы подробно протокол с помощью A. rhizogenes для производства трансгенных волосатые корней, которые поддерживаются в дикого типа стрелять, генерации растений композитный картофеля или вырезан самостоятельно выращивать в пробирке. Мы также предоставляем протокол, используя A. tumefaciens для получения полного трансгенные картофель растений. В качестве тематического исследования а. rhizogenes и A. tumefaciens преобразована с же бинарный вектор используются для получения корни с FHT промоутер вождения ГАС репортер экспрессии генов. Результаты сообщили и сравнить.

протокол

A. rhizogenes протокол преобразования был адаптирован и изменения из рога et al.⁷ и тестирование генотипа был S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Дезирэ). A. tumefaciens преобразования протокола был адаптирован и изменения Банерджи et al.²² и генотипов испытания были S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Дезирэ) и S. tuberosum ssp. andigena. Основные этапы обеих процедур резюмируются в Рисунок 1 и 2, соответственно.

Примечание: На всех этапах процедуры, выполнение переводов в vitro сделать это быстро и когда это возможно, поддерживать пластин или горшки закрыты, таким образом минимизируя завод воздействия воздуха, чтобы избежать загрязнения и увядания. Не указано иное, все растение инкубаций были сделаны в шкафах в условиях 12 h 24 ° C свет/12 h 20 ° C темной и 67 мкмоль m^-1 s^-1. Иное, выполняют все бактерии манипуляции и в vitro растений трансферы в асептических условиях ламинарных капюшоном. Все рецепты СМИ для посева и в пробирке растительных культур приведены в Таблице S1.

ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Хранение всех генетически модифицированных бактерий и растений для выделенных контейнер для отходов.

1. Agrobacterium культур, используемых для преобразования

Примечание: Штамм, используемый для преобразования A. rhizogenes был C58C1:Pri1583⁷ (любезно предоставлены доктором Инге Broer) и что для A. tumefaciens был GV2260 (любезно предоставлены доктором Salomé Прат). A. rhizogenes был преобразован с бинарный вектор PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-кафедра биологии растений в Гент Universiteit; http://gateway.psb.ugent.be), содержащий T-ДНК перевозящих преобразования маркера для мониторинга волосатые корень формирование. Для сравнения преобразованных корни, а. rhizogenes и A. tumefaciens, оба были преобразованы с бинарный вектор pKGWFS7, который содержит T-ДНК, перевозящих FHT промоутер, вождение репортер гена β-glucoronidase (GUS) и канамицин сопротивления ген как выбирается маркер¹⁵.

Выберите колонии Agrobacterium и вырастить его на ночь (O/N) в 5 мл YEB среды с антибиотиками (Таблица S1) в 50 мл пластиковых пробирок на 28 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
Для преобразования A. tumefaciens , измерения оптической плотности, которая должна быть ОД₆₀₀ = 0,6-1,0.
1. Если оптическая плотность выше, сделать субкультуры, опустив ее в ОД₆₀₀ = 0,3 с свежими СМИ и ждать до тех пор, пока культура достигает₆₀₀ OD = 0,6-1.
Центрифуга 1 мл Agrobacterium культуры на 3000 x g в центрифугу скамейка Топ 10 мин при комнатной температуре.
Удалить супернатант, закупорить и Ресуспензируйте клеток в 1 мл свежего YEB среды без антибиотиков. Повторите этот шаг, чтобы обеспечить полное удаление антибиотиков.
1. A. tumefaciens трансформации, в прошлом ресуспендирования добавить соответствующий объем YEB для получения окончательного оптическая плотность OD₆₀₀ = 0,8.
Держите клетки на льду при подготовке растения, чтобы быть заражены.

2. растительный материал для преобразования

Сделать один или два узла стволовых черенками либо содержащие апикальной или вспомогательные почки от стерильного в vitro растений картофеля (доноров растения); выращивать их в средне твердой 2MS в горшках для 3-4 недели (рис. 1A и 2A рисунок).

3. завод преобразования с помощью A. rhizogenes (рис. 1)

Примечание: Эта процедура позволяет получать преобразованные волосатые корней. Чтобы вычислить выражение трансген, отрицательный контроль необходим. Подготовить отрицательный контроль, следуйте процедуре, с помощью штамма A. rhizogenes непреобразованной или преобразованы с пустой вектор, который включает преобразования маркера гена.

Использовать свежие СМИ пластины; Кроме того плиты может храниться при температуре 4 ° C с крышкой стороной вверх, плотно закрытой с прозрачной пленкой, чтобы избежать обезвоживания СМИ. Подготовить квадратный СМИ пластины, раздвиньте их ~ 15°, заливка с 40 мл МС и пусть они затвердевают. Это позволит свести к минимуму контакт воздушной части завода с носителя.
Передавать очень тщательно доноров завод от среднего 2MS квадратные пластины 120 x 120 мм.
Привнести в один стебель internode 3 мкл культуры а. rhizogenes , с помощью иглы хирургические и повторить его два раза в завод в различных междоузлий, когда это возможно.
Примечание: Рассмотрим каждой инъекции как независимое преобразование событие (рис. 1B).
Передавать сразу весь завод квадратные пластины с твердой питательной MS, дополняется acetosyringone 0,1 мм. Разместиться 2 растения на пластину.
Примечание: 1 M acetosyringone Стоковый раствор готовится в ДМСО и может храниться при температуре-20 ° C.
Печать пластину с помощью хирургическая лента и организовать его по вертикали внутри шкафа рост на 4 дня.
Передача завода на новой площади пластины с MS среднего дополнена Цефотаксим натрия [500 мкг/мл] убить а. rhizogenes.
После 10-12 дней волосатые корни начнут появляться (рис. 1 c,1 D). Затем акцизный Родные корни растения и передать завод на новой площади пластины с MS среднего дополнена Цефотаксим натрия [500 мкг/мл].
Примечание: Преобразованная волосатые корни могут проверяться красной флуоресценции при использовании DsRed преобразования маркера (рис. 3D).
Для получения составного завод (Рисунок 1E), пусть трансгенных волосатые корни расти на 3-4 недели в среде MS дополнена Цефотаксим натрия [500 мкг/мл] (изменить носитель каждую неделю).
В зависимости от цели распространение трансгенных волосатые корни и негативный контроль как следовать.
1. Передача всей композитный завод гидропонных (Таблица S2) или почвенной среды для массивных развития.
2. Индивидуально, распространять преобразованный волосатые корни, с помощью скальпеля отрезать корни, выражая красной флуоресцентной преобразования маркера (DsRed белок) когда они длиной 4-8 см (Рисунок 1E) и перенести их в чашке Петри с твердой питательной Gamborg B5 дополнен с 2% сахарозы и Цефотаксим натрия [500 мкг/мл]. Уплотнение пластины с пластиковой Лаборатория фильм и вырастить их в темноте при температуре 20 ° C.
  Примечание: Корни можно манипулировать под стереомикроскопом, оборудованных для обнаружения флуоресценции в стерильных условиях (см. Таблицу материалы).
3. Для производства биомассы (т.е. анализ выражения гена) сократить длинный волосатая корень 5 см и распространять ее в 150 мл колбу Эрленмейера с 20 мл жидкой среды Gamborg B5 с 2% сахарозы и Цефотаксим натрия [500 мкг/мл]. Растут на 6 недель в темноте при 20 ° C и 60 об/мин.

figure-protocol-7631
Рисунок 1: Временная шкала для получения картофельного трансгенных волосатые корни, с использованием а. rhizogenes. Показаны совокупные недель для достижения каждого этапа процесса трансформации и последующие шаги расти волосатые корни. Представитель изображения различных этапов изображены: начало процесса с использованием 3-недели старый в vitro растений (A), затем инфекции растений путем инъекций A. rhizogenes (B), формирование пролиферативных ткани (C, стрелки) с возникающих волосатые корни (D) и развитых волосатые корни, выражая красной флуоресцентной преобразования маркера DsRed (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

4. завод преобразования с помощью A. tumefaciens (рис. 2)

Примечание: Эта процедура позволяет получать трансформированных растений. Чтобы оценить эффект трансген, отрицательный контроль необходим. Одним из вариантов является следовать процедуре, с помощью A. tumefaciens преобразована с пустой вектор. В качестве альтернативы можно использовать растения дикого типа.

Вырезать и поместите лист из 3-4-недельных растений (рисунок 2A) в чашку Петри. С помощью скальпеля исключить черешок и поперечных разрезов (1-3 в зависимости от размера листьев) от центра листа к краям, избегая отрезав их (рис. 2B).
Сразу же месте листа, плавающей на 10 мл свежего 2MS жидких сред в чашке Петри с abaxial стороной вверх и закройте пластины. Повторите шаг, вмещающий до 15 листьев для cv. Дезирэ и 25 листья для ssp.ndigena (в зависимости от размера листьев).
Сразу же добавить 80 мкл A. tumefaciens культуры в ОД₆₀₀= 0,8 в жидких средах и гомогенизации пластины вручную за 1 мин распространить бактериальных решение.
Тщательно печать с пленки для запайки, накрыть алюминиевой фольгой и инкубировать в течение 2 дней в камере при 24 ° C для преобразования происходят.
Передача листья, сохраняя abaxial стороне до среднего CIM (рис. 2B) и инкубировать их на одну неделю в росте кабинета.
1. Скрип среднего CIM с помощью пинцета, так что листья могут лучше разместиться на средства массовой информации.
Передача листья, сохраняя abaxial стороне до среднего SIM (рис. 2 c) и инкубировать их в рост кабинета, освежающий носитель каждые 7-10 дней, до тех пор, пока побеги, около 2 см в высоту.
1. Царапать среднего SIM с помощью пинцета, так что листья могут быть полностью окружен средств массовой информации. Когда возникла побеги достигают крышку, работать с высокими Петри (100 x 20 мм, высота х диаметр).
  Примечание: После 2-3 недели в SIM среднего (Рисунок 2D) и побеги после 6-7 недель (Рисунок 2E) составят каллуса. Побеги будет рассматриваться в качестве независимых преобразования события, когда они выходят из каллуса образуются из независимых раны.
Вырезать три стреляет возникла из каждого каллуса (считается один и то же событие преобразования) (Рисунок 2E), передачи их культуры колбы с мг средний дополнена Цефотаксим натрия [250 мг/Л] чтобы болеть, ярлык подмножество с номером и Инкубируйте в росте, кабинет для 3-4 недели или до тех пор, пока побеги являются энергичные (Рисунок 2F).
Примечание: Когда резка побеги, удалить также каллуса иначе корень будет не образуют.
1. Повторите столько раз, как независимые линии необходимы. До 5 различных преобразований события могут быть размещены в колбе культуры с диаметром 8 см для работы в полной уверенности, что растения из разных событий не смешиваются.
Выберите наиболее энергичных завод каждого события, вырезать апикальной сегмент стрелять с 3-4 междоузлий и поместите его в новой культуры колбу с 2MS среднего дополнена Цефотаксим натрия [250 мг/Л].
Примечание: В 3-6 недель, что растение будет расти эффективно, разработке энергичной стрелять и корни.
1. Вернуть к камере невыбранных побеги до тех пор, пока завод выбран полностью разработаны.
Вырезать сегменты ствола от завода с по крайней мере один между узлами или верхушечный бутон и передавать их на новый носитель 2MS дополнена Цефотаксим [250 мг/Л]. Инкубируйте их в кабинет роста.
1. Реплицируйте каждые 3-4 недель для установления линии в vitro превращается.
  Примечание: Цефотаксим натрия необходима в по меньшей мере три последующие переводы 2MS средний чтобы убить A. tumefaciens; Впоследствии если наблюдается разрастание A. tumefaciens , передать растения снова 2MS СМИ дополнена Цефотаксим натрия.
Характеризовать завод фенотип, передачи растений в почву для их полной характеризации или культуре гидропоники для корня инспекции.
1. Держите клубни в почве распространять и поддерживать установленные линии.

figure-protocol-13121
Рисунок 2: Сроки для получения картофеля преобразован растений с использованием A. tumefaciens. Показаны совокупные недель для достижения каждого этапа процесса трансформации и последующие шаги для выращивания растений. Представитель изображения различных этапов изображены: начало процесса с использованием листья от 3 - неделя старый в vitro растений (A), передача раненых и зараженные листья в CIM СМИ (B), листья при передаче СИМ СМИ (C), Визуализация каллуса вокруг раненых области после 2-3 недели в СМИ (D) SIM, формирование стрелять после 9-11 недель в SIM СМИ (E) и побеги после перевода мг СМИ (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

5. гидропонные культуры

Приготовляют раствор Хоугланд половину численности (0.5 x) (Таблица S2) в ведро 10 Л.
Погружайте в аквариум насос для поддержания однородности и условий надлежащего кислорода.
Покрывают стены ведро с алюминиевой фольгой расти корни в условиях темноты.
Во избежание повреждения корневой, передачи в vitro растений в культуре гидропоники.
Примечание: Удалите любые оставшиеся средства в пробирке из корней, чтобы избежать распространения микроорганизмов во время инкубации встряхнув тщательно корни в воде.
Обложка растений с прозрачной пленки как glasshouse чтобы адекватные акклиматизации и инкубировать в рост палата.
Сделайте отверстия в фильме после 3 дней и удалить его полностью через одну неделю после.
Замените свежим СМИ каждые 10 дней.

6. ГАС гистохимические Репортер ген пробирного

Примечание: В нашем случае ГУС был проведен анализ с корнями 2-3 недель, выращенных в гидропоники или в пробирке.

Исправьте корни ацетоном (v/v) 90% охлажденной и проинкубируйте его за 20 минут на льду.
Выполняют два мойки с дистиллированной водой.
Добавить свежие ГАС, окрашивание раствора (Таблица 1) и применить вакуум (-70 Па) за 20 мин.
Инкубируйте при 37 ° C в темноте, чтобы защитить фоточувствительные GUS за 4 ч или до тех пор, пока синий цвет является видимым.
Примечание: Присутствие и Ферри - Ферроцианид в ГАС решение свести к минимуму распространение продуктов реакции и обеспечивают более точной локализации.
Предупреждение: Использовать вытяжной шкаф и носить защитную одежду при обработке токсичных цианида производные в растворе гусь (калия Гексацианоферрат и Ферроцианид калия). GUS субстрата и утилизации материала должны быть удалены безопасно.
ГУСЬ, окрашивание раствора снимите и выбросьте его в соответствующие контейнеры.
Выполняют два мойки с этанол 70% (v/v).
Наблюдать под микроскопом светлые области.
Примечание: ГСУ окрашивание является стабильным в течение нескольких недель; Однако в течение первой недели, GUS сигнал ясно и рассеивает меньше на соседние клетки. Для более длительного хранения печать трубки и хранить при 4 ° C.

figure-protocol-16572
Таблица 1: GUS окрашивание решения рецепт.

Результаты

Agrobacterium rhizogenes -опосредованной трансформации картофеля

В этой рукописи представлена пошаговая процедура для получения преобразованного корень с A. rhizogenes . На рисунке 1 представлен обзор проце...

Обсуждение

В картофеля наиболее распространенной системой для получения стабильной полный трансгенных растений использует преобразование Agrobacterium tumefaciens штаммов, которые требуют органогенеза с помощью экзогенных фитогормонов. Хотя у Agrobacterium на основе протоколов имеет потенциал, чтобы ...

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана Ministerio de Innovación y науки (AGL2009-13745, ИПИ Грант для PB), y Ministerio де Economía развитию и ФЕДЕР финансирования (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) и Жиронского университета (доктор Грант SF, и Грант SING11/1). Авторы благодарны доктором Инге Broer (Институт землепользования, университета г. Росток, Росток, Германия) и доктор Salomé Прат (Centro Nacional де биотехнология, Мадрид, Испания) для обеспечения а. rhizogenes и A. tumefaciens деформации, соответственно и доктор Marçal Солер и д-р Анна Plasencia за помощь и поддержку, полученную в инициировании трансформации экспериментов A. rhizogenes (Университет Тулуза III Поль Сабатье — CNRS, завод лабораторных исследований (LRSV), Castanet Толозан, Франция). Авторы благодарят Сара Гомес (Кафедра де Biologia, UdG, Жирона) за ее ценную помощь в проведении лабораторных работ и забота о растений и Ferran Fontdecaba и Карла Санчес, который помогал с некоторыми из экспериментов, в то время как они делают свои окончательные дипломных проектов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Panreac	1.310.071.21
Acetosyringone	Acros	115540050
Aquarium pump	Prodac	MP350
Autoclave	Ragpa Strelimatic
Bacteriological agar	Lab Conda	1800
BAP	Duchefa	B0904
Beef extract	Lab Conda	1700
Plant growing cabinet	Nuaire
Carbenicillin	Duchefa	C0109
Cefotaxime sodium	Duchefa	C0111
DMSO	Merck	1029310161
Ecotron infors	HT	29378
Ethanol	Merck	1,009,831,011
Falcon tube	Control tecnica	CFT011500
Ferricyanate	Sigma	101001081
Ferrocyanate	Sigma	100979088
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture	Apiglass	ref16
GA3	Sigma	G7645
Gamborg B5 media	Duchefa	G0210
Gelrite	Duchefa	G1101
Glucosa	Sigma	G5767
Kanamycin	Sigma	K1377
Leukopor tape	BSN Leukopor	BDF47467
Lupe	Wild-Heerbrugg	M420
Magnetic shaker	Agimatic	7000243
MES hydrate	Sigma	M2933-25G
MgSO₄	Panreac	131404
Microscope	Olympus
Minufugue centrifugue 5415R	Eppendorf
Murashige and Skoog media	Duchefa	M0254.0050
Na₂HPO₄	Panreac	131679
NAA	Duchefa	N0903
NaCl	Panreac	131659
NaH₂PO₄	Sigma	58282
NightSea Stereo	SFA Moonting Adapter
Parafilm	Anorsa	PRFL-001-001
Peptone	Lab Conda	1616
Petri dishes (90 x 14)	Anorsa	200200
pHmetre	Crison
Phytotron	Inkoa	RFTI-R5485
Plant Agar	Duchefa	P1001
Refrigeratot	Liebherr Medline
Rifampicin	Duchefa	R0146
Spectinomycin	Sigma	59007
Spectrophotometer	Shimadzu
Square plates (120 x 120)	Deltalab	200204
Streptomycin	Sigma	S6501
Sucrose	Panreac	131621
Surgical blades	Swann-Morton	201
Surgical needle	NIPRO	015/0204
Triptone	Lab Conda	1612
Triton	Serva	37240
Unimax 1010 shaker	Heidolph
Vacuum	Dinko
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)	Biosynth	B-7398
Yeast extract	Lab Conda	1702.00
Zeatin riboside	Sigma	1001042850