Средне-пропускная способность, отбор проб для оценки воздействия на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы

Резюме

Здесь, две средних-пропускная способность анализов для оценки воздействия на Ca^{2 +}-описаны сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы. Эти анализы могут использоваться для экрана быстро и легко большое количество соединений для воздействия на Ca^{2 +}-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы.

Аннотация

CA^{2 +}-сигнализации имеет важное значение для функции нормальных клеток спермы и мужской фертильности. Аналогично реакция Акросома имеет жизненно важное значение для способности человека сперматозоид проникает вителлинового и оплодотворить яйцеклетку. Именно поэтому представляет большой интерес для проверки соединений (например, экологические химических веществ или наркотиков кандидатов) за их влияние на Ca^{2 +}-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы либо для изучения потенциального неблагоприятного воздействия на человека сперматозоид функции или для изучения возможной роли в качестве средства контрацепции. Здесь описаны два анализов средне-пропускная способность: 1) на основе флуоресценции assay для оценки воздействия на Ca^{2 +}-сигнализации в человеческой спермы и 2) изображения гранулярных assay для оценки реакции Акросома в человеческой спермы. Эти анализы могут использоваться для экран большое количество соединений для воздействия на Ca^{2 +}-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы. Кроме того анализов может использоваться для создания узкоспециализированных доза реакция кривых индивидуальных соединений, определить потенциальные аддитивности/синергизм для соединения двух или более и для изучения режима фармакологических действий путем конкурентного ингибирования эксперименты с ингибиторами CatSper.

Введение

Цель двух анализов, описанные здесь является изучить воздействие на Ca^{2 +}-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы, как уже было показано для нескольких соединений в ряде публикаций, используя эти assays^{1,2, 3,4,5,6,7}. CA^{2 +}-сигнализации и Акросома реакции являются жизненно важное значение для нормального человека сперматозоид функцию и плодовитость мужчины.

Общая цель клетки спермы человека заключается в том, чтобы оплодотворить яйцеклетку. Чтобы иметь возможность успешно и естественно оплодотворить яйцеклетку, функции клетки спермы должно регулироваться плотно во время путешествия сперматозоид через женского репродуктивного тракта^8,9. Многие из функций клеток спермы регулируются через внутриклеточные Ca^{2 +}-концентрация [Ca^{2 +}]_я (например, спермы моторики, хемотаксис и Акросома реакции)¹⁰. Кроме того процесс созревания, называется капацитации, который оказывает сперматозоид способен подкормки яйцо, это частично регулируется [Ca^{2 +}],_я¹⁰. CA^{2 +}-экструзия Ca^{2 +}-АТФазы насосы¹¹ поддерживать приблизительно 20.000 раза Ca^{2 +}-градиента над человеческой спермы клеточной мембраны, с отдыха [Ca^{2 +}]_я 50-100 Нм. Если Ca^{2 +} разрешается пересекать клеточной мембраны (например, путем открытия Ca^{2 +}-каналы), значительный приток Ca^{2 +} происходит, что приводит к высоте [Ca^{2 +}]_я. Однако, также носит сперматозоид внутриклеточных Ca^{2 +}-магазины, которые могут освободить Ca^{2 +} и, таким образом, также дать подняться над уровнем моря [Ca^{2 +}]_я¹². Интересно, что все канал опосредованной Ca^{2 +}-приток в клетках человека спермы до настоящего времени были найдены происходят через CatSper (Catионный канал Sperm), который только выражается в сперматозоиды¹¹. В клетках человека спермы, CatSper активируется эндогенные лиганды прогестерона и простагландинов через собственный лигандом привязки сайтов^13,14,15, приводит к быстрому Ca^{2 +}-приток в сперматозоид. Два основных источника возле яйца обеспечивают высокий уровень эти эндогенные лиганды. Один является фолликулярная жидкость, которая содержит высокий уровень прогестерона¹⁶. Фолликулярная жидкость освобождается от зрелых фолликулов вместе с яйцо в овуляции и смешивается с жидкостью в пределах яйцеводов¹⁷. Другим основным источником является кучевые клетки, которые окружают яйцо и освободить высокий уровень прогестерона и простагландинов. Прогестерон индуцированной Ca^{2 +}-приток в клетки спермы было показано посредником хемотаксис к яйцо^9,18, контролировать^19,подвижности сперматозоидов²⁰ и стимулировать Акросома ²¹реакция. Срабатывание этих отдельных [Ca^{2 +}]_я-регулируемые спермы функций в правильном порядке и в нужное время имеет решающее значение для оплодотворения яйцеклетки⁸. В соответствии с этим, субоптимальный прогестерон индуцированной Ca^{2 +}-приток был найден ассоциируется с снижением мужской фертильности^{22,23,24,25,26 ,27,,2829} и функциональных CatSper имеет важное значение для мужской плодовитости^{26,30,,3132, 33,34,35,36}.

Как сперматозоиды достигают яйцо, последовательность событий должны иметь место для оплодотворение происходит: 1 клетки спермы должны проникнуть окружающие отель cumulus слоя клеток, 2) привязки к zona pellucida, 3) exocytose акросомной содержание, так называемый Акросома реакции ³⁷, 4) проникают zona pellucida и 5) предохранитель с яйцо мембраны для завершения оплодотворение³⁸. Чтобы иметь возможность пройти через эти шаги и оплодотворить яйцеклетку, сперматозоид должны сначала пройти капацитации¹¹, которая начинается как клетки спермы оставить семенной жидкости, содержащие «decapacitating» факторов³⁹ и плавать в жидкости самка репродуктивного тракта с высоким уровнем бикарбоната и альбумина³⁷. Капацитации выносит сперматозоиды могут пройти гиперактивацию, форма подвижности с энергичной избиение жгутика, и Акросома реакции³⁷. Гиперактивными подвижности требуется для проникновения в zona pellucida⁴⁰, и Акросома содержит различные гидролитических ферментов, которые помогают этот процесс проникновения⁴¹. Кроме того реакция Акросома отрисовывает клетки спермы, способных слияния с яйцом, подвергая конкретных мембранных белков на поверхности сперматозоидов необходимых для спермы яйцо фьюжн⁴². Следовательно, возможность пройти гиперактивацию и Акросома реакции, так необходимых для успешного оплодотворения яйцеклетки^40,42. Вопреки тому, что видел для мыши сперматозоиды^43,,4445только человеческие сперматозоиды, которые сохранились Акросома можно привязать к zona pellucida⁴⁶. Когда человека клетки спермы привязаны к zona pellucida, они должны пройти Акросома реакции как проникнуть вителлинового⁴¹ , так и для предоставления конкретных мембранных белков, которые необходимы для синтеза с яйцо³⁸. Таким образом, время реакции Акросома в человеческой спермы имеет решающее значение для оплодотворение произойти.

Как описано выше, Ca^{2 +}-сигнализации имеет жизненно важное значение для нормальной спермы функция⁸, и это, следовательно, большой интерес для экрана большого числа соединений для воздействия на Ca^{2 +}-сигнализации в человеческих клеток спермы. Точно так же как только человеческие сперматозоиды, которые проходят Акросома реакции в нужное время и место может проникнуть вителлинового и оплодотворить яйца^46,47, это также большой интерес, чтобы иметь возможность проверить соединения на их способность влияет на Акросома реакции в человеческой спермы. С этой целью, описаны два скрининга средне-пропускная способность анализов: 1) assay для воздействия на Ca^{2 +}-сигнализации в человеческие сперматозоиды и 2) assay для получения возможности побудить Акросома реакции в человеческих клеток спермы.

Проба 1 является средне-пропускная способность Ca^{2 +}-сигнализации assay. Этот метод на основе чтения флуоресценции пластины отслеживает изменения в флуоресцировании как функцию от времени одновременно в нескольких скважин. Ca^{2 +}-чувствительных Люминесцентную краску, Fluo-4 имеет K_d для Ca^{2 +}≈ 335 Нм и клеток permeant в форме Эстер AM (acetoxymethyl). С помощью флуоресцентного-4, это можно измерить изменения в [Ca^{2 +}]_я со временем и после добавления соединений, представляющих интерес для клеток спермы. Проба была разработана лабораторией Timo Strünker в 2011¹³ и с тех пор был использован в нескольких исследованиях на экране соединений для воздействия на Ca^{2 +}-сигнализации в человеческой спермы^{1,2,3, 4,5}. Также подобный метод использовался для экран несколько наркотиков кандидатов⁴⁸. Кроме того этот assay также полезна для оценки режима фармакологических действий^1,2,3,4,5,^{, доза реакция кривых1 2,3,4,5}, конкурентного ингибирования^1,2, аддитивности^1,2и³ синергизм соединений, представляющих интерес.

Проба 2 относится средне-пропускная способность Акросома реакции. Этот метод на основе цитометр изображения измеряет количество жизнеспособных отреагировали Акросома сперматозоидов в выборке, используя три Краски люминесцентные, флуоресцентные: пропидий йодидом (PI), FITC-сочетании Лектин Pisum sativum (FITC-PSA) и Hoechst 33342. Проба была изменена от аналогичного метода на основе цитометрии потока Zoppino et al.⁴⁹ и был использован в нескольких исследованиях^6,7. Что касается Ca^{2 +}-сигнализации пробирного, этот assay Акросома реакция может также использоваться для оценки доза реакция кривых, ингибирование, аддитивности и синергизм соединений, представляющих интерес.

протокол

Сбор и анализ образцов человеческой спермы в протоколах соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований столицы региона Дании. Все образцы спермы были получены после информированного согласия от безвозмездных доноров. После родов образцы были полностью анонимными. Для их неудобства каждый донор получил гонорар в размере 500 датских крон (около $75 долларов США) на сэмпл. Образцы были проанализированы в день доставки и затем уничтожены сразу же после лабораторных экспериментов.

Примечание: Средняя пропускная способность Ca^{2 +}-сигнализации пробирного описан в шаги 4-5 и пробирного реакции Акросома средней пропускной способности в шаги 6-7. Протокол для подготовки среднего человека трубной жидкости (HTF⁺) описано в шаге 1, и очищению клеток спермы для анализов это описано в шагах 2-3.

1. Подготовка среднего человека трубной жидкости (HTF⁺)

Примечание: Использование объемных колбы соответствующих размеров, 1 Л Измерительный цилиндр, Магнитная мешалка, соли, перечисленных в таблице 1 и таблице 2, вода очищенная, 0,2 мкм поры фильтра и 50 мл пластиковых труб.

1. Подготовка запасов растворов солей в очищенной воде (таблица 1).
   1. Добавьте количество соли, перечисленных в таблице 1 для объемной колбу соответствующего размера, добавить немного ниже желаемого объема очищенной воды и смеси хорошо с использованием магнитной мешалкой.
   2. Когда соль полностью растворяется, удалите магнит и заливки очищенной водой для желаемого конечного объема.
2. Передача акций решения к бутылке и хранить до использования.
   Примечание: Запасов решения могут храниться и повторно для более длительных периодов времени: глюкозы и HEPES при-20 ° C и других запасов решения при комнатной температуре (RT).
3. Подготовка 1 Л HTF⁺ среды из запасов растворов (таблица 2).
   1. Убедитесь, что все акции решения полностью растворяются и хорошо перемешать перед использованием.
   2. Добавьте количество Стоковый раствор и соли, перечисленные в таблице 2 к 1 Л, Измерительный цилиндр и добавьте 900 мл очищенной воды.
   3. Смеси хорошо с использованием магнитной мешалкой и скорректировать рН до 7,35 с растворе NaOH.
   4. Удалите магнит и добавьте очищенную воду до 1000 мл.
4. Стерильный фильтрат HTF⁺ средний через 0,2 мкм поры фильтра, аликвота средних HTF⁺ 50 мл пластиковых труб и хранить при 4 ° C до использования.
5. Как раз перед запуском эксперимент, мкл 165 Na пирувата в 50 мл Алиготе получить окончательный концентрации Na пируват 0,33 мм.
   Примечание: Человека трубной текучей среды также можно получить из различных коммерческих поставщиков. При использовании 4 мм HCO₃^– средний, образцы можно инкубировали с закрытой крышкой в инкубаторе без дополнительных CO₂ в воздухе без большие сугробы в pH. Если доступен CO₂ инкубатора, соответствующее количество CO₂ может рассчитываться с помощью уравнение Henderson Hasselbalch и используется. Если используется 25 мм HCO₃^– средний, образцы следует инкубировали с открытой крышкой в инкубаторе₂ CO с воздухом, содержащий соответствующее количество CO₂ (в зависимости от атмосферного давления, обычно между 5-10%) чтобы избежать дрейф в pH. Точное количество CO₂ могут рассчитываться с использованием уравнения Henderson Hasselbalch.

2. Очистка подвижных сперматозоидов через Swim-up (рис. 1)

Примечание: Используйте чистый широкий громкий пластиковый контейнер для образца спермы, пластиковые трубы 50 мл, инкубатор, стойку для размещения 50 мл пластиковых труб на угол 45°, HTF⁺ среднего (подготовленные в шаг 1 или полученные от коммерческого провайдера), центрифуги и сыворотку крови человека Альбумин (HSA).

1. Получите образец свежезаваренным донорской человеческой спермы производится путем мастурбации и произнес в масштабах громкий чистый пластиковый контейнер. Используйте только образцы спермы, которые выполняют параметров, установленных руководством лаборатория ВОЗ по проверке и обработке человеческой спермы.
2. Проинкубируйте образцы при 37 ° C на 15-30 минут, чтобы позволить ему для разжижения.
3. Нагреть до 50 мл среды HTF⁺ с 4 мм HCO₃^– – 37 ° C.
4. Место чистой 50 мл трубки пластмассовые в стойку под углом 45° (для увеличения площади поверхности между жидкости). Используйте 1 тюбик на мл сырой спермы.
5. Добавьте 4 мл разогретой средних⁺ HTF каждой из трубок.
6. Тщательно Пипетка 1 мл образца сжиженного спермы в нижней части каждой трубы, содержащих 4 мл разогретой HTF⁺. Избегайте выпуска воздушных пузырьков.
7. Закройте крышки и инкубировать трубы при 37 ° C в течение 1 ч.
8. Аккуратно аспирационная и передать столько верхней дроби (HTF⁺ с подвижные сперматозоиды) максимально новой пластиковой трубки 15 мл, при уделении внимания, что ничего из нижней часть (Семён с сперматозоидов и мертвых клеток) включен. Как правило это безопасно для передачи 3,5 мл Топ фракции, не нарушая нижней доли. Чтобы избежать всасывания турбулентности, отрезать внешний 1-2 мм кончика пипетки под углом 45° для получения большего открытия.
9. Заполните вверх пластиковой трубки 15 мл с HTF⁺ мыть клетки и центрифуги трубки на 700 x g 10 мин на RT.
10. Аккуратно аспирационная и удалить супернатант и Ресуспензируйте сперматозоид Пелле в 2 мл⁺HTF.
11. Передать две небольшие пластиковые трубы для оценки концентрации сперматозоидов 20 мкл суспензии спермы (см. шаг 3).
12. Заполните вверх пластиковой трубки 15 мл с HTF⁺ мыть клетки и центрифуги трубки на 700 x g 10 мин на RT.
13. Аккуратно аспирационная и удалить супернатант и Ресуспензируйте сперматозоид гранул до 10 x 10⁶ клеток/мл (основанный на концентрации клеток, начисленных на шаге 2.11).
    1. Для экспериментов с использованием снимите capacitated сперматозоиды (обычные Ca^{2 +}-сигнализации пробирного)
       1. Ресуспензируйте клетки в HTF⁺ с 4 мм HCO₃^–.
       2. Мкл 30 человеческого сывороточного альбумина (HSA) (100 мг/мл) на мл HTF⁺ для получения конечной концентрации 3 мг/мл.
       3. Закройте крышкой и инкубировать ≥1 ч при 37 ° C.
    2. Для экспериментов с использованием полномочия сперматозоиды (Акросома реакции проба)
       1. Ресуспензируйте клетки в HTF⁺ с 25 мм HCO₃^–.
       2. 30 мкл HSA (100 мг/мл), мл HTF⁺ для получения конечной концентрации 3 мг/мл.
       3. Слегка прикрепите крышки и проинкубируйте ≥3 ч при 37 ° C с соответствующее количество CO₂ (см. шаг 1, обычно между 5-10% CO₂).

3. Подсчет клеток спермы

Примечание: Сперматозоиды могут либо учитываться вручную⁵⁰ или с использованием изображения цитометр⁵¹, как описано здесь. Использовать изображения цитометр, вортекс, С100 буфера, SP1-кассету, кромки очищенного сперматозоиды (подготовленных на шаге 2).

1. Разбавьте 20 мкл аликвота фактор 10, 20, 30, 50 или 90 С100 буфера, используя 2-мл пробирку круглым дном согласно ожидаемой концентрации (оценены ручной проверки гранул в шаге 2.10). Использование разрежения, которая ближе всего к концентрации ожидается (то есть, если концентрация 15 х 10⁶ клеток спермы на мл после того, как ожидается, кромки затем разбавить 20 мкл образца спермы с 380 мкл буфера S100 [коэффициент разбавления 20]).
2. Смесь хорошо для 10 s с помощью вихревой смеситель на максимальные 700 об/мин, погрузите SP1-кассета в образце и нажмите белый поршень полностью вниз аспирата Алиготе образца в кассету.
3. Открыть изображение цитометр, место кассеты в лоток и запустите пробирного Фото из PI витражи человеческих клеток спермы Assay согласно прикладной разрежения фактор (выбран на шаге 3.1).
4. Повторите шаг 3.1-3.3 с еще 20 мкл пример, используя коэффициент разрежения, ближе всего к измеренная концентрация, полученные из первых 20 мкл пример.
5. Вычислите среднее сперматозоид концентрации от двух измерений.
6. Умножение означает спермы концентрации клеток с исходной громкости для получения числа общей сперматозоид (на шаге 2, этот исходный объем-2 мл).

4. измерение изменений в свободной внутриклеточных Ca^{2 +}-концентрация ([Ca^{2 +}]_я) с помощью Ca^{2 +}- флуориметрия (рис. 2)

Примечание: Использовать флуоресценции пластины читатель, 384 несколькими хорошо пластины, Fluo-4 утра, кромки очищенный сперматозоиды (подготовленные в шаг 2), соединения интереса а также позитивные и негативные элементы, автоматический репитер пипетки и 12-канальный дозатор.

1. Готовить 2 мм Fluo-4 утра складе, добавив 22.7 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) во флаконе 50 мкг Fluo-4 утра и хорошо перемешайте трубки.
2. Добавьте новый тест трубки Алиготе 700 мкл восстановленные спермы кромки подвески (полномочия или ООН capacitated, как об этом говорится в шаг 2). 700 мкл пример спермы является сумма, необходимая для анализа одной строке 24 скважин в 384-микрорезервуар пластины (используется для проверки 3 управления и 9 соединений в Дуплеты).
3. 3.5 мкл Fluo-4 AM Fluo-4 утра Стоковый раствор для 700 мкл суспензии спермы для получения конечной концентрации 10 мкм.
4. Инкубируйте образца для 45 минут при 37 ° C, защищать от света.
5. Центрифуга для образца на 700 x g 10 мин, аспирационная и удалить супернатант удалить избыток Fluo-4.
6. Ресуспензируйте окрашенных гранул в HTF⁺ до 5 х 10⁶ клеток/мл (т.е., использование 2 x объем суспензии клеток, сделанной в шаге 4.2)
7. Приготовляют разведения соединений и элементов управления (может быть сделано в периоды инкубации и центрифугирования в шаге 4.4 и 4.5, соответственно).
   1. Ослабить соединения, а также отрицательный контроль (буфер с транспортного средства) и положительный контроль (Прогестерон) в⁺HTF. Разбавьте соединений и элементов управления для 3 x желаемой конечной концентрации, как они являются разбавленных 1:3, когда они добавляются в сперматозоиды в шаге 4.16.
   2. Место труб с разведения в стойку с расстоянием между трубами, соответствующее расстояние между пипетки Советы 12-канальный дозатор на шаге 4.16.
8. Используйте автоматический репитер пипетки (24 этапа 50 мкл).
   1. Mix Fluo-4 запятнана спермы нежно закупорить всю сумму вверх и вниз один раз.
   2. Добавьте аликвоты 50 мкл 24 скважины строки в 384-микрорезервуар пластины.
9. Место пластину микрорезервуар на читателя пластины флуоресценции при 30 ° C и закройте ящик.
10. Выберите нужный протокол для Fluo-4. Возбуждения флуоресценции 480 Нм и записи выбросов на 520 Нм. Используйте быстрый цикл сроки с параметром.
    Примечание: Используйте по крайней мере 10 вспышек в колодец и нижней Оптика, если это возможно.
11. Выберите хорошо в строке и Отрегулируйте усиление целевое значение 20%.
12. Старт измерения.
13. Управление базовой линии в течение первых 5 циклов.
    1. Если флуоресцентные индикации увеличивается или уменьшается с течением времени, остановить эксперимент, скорректировать коэффициент усиления и снова начать эксперимент.
    2. Если базовый существенно отличается между отдельными скважин в ряд, либо дозирование в шаге 4.8 был неточным или образец был не смешиваются перед достаточно хорошо закупорить. Выбросите эксперимент.
    3. Если флуоресцентный индикация сопоставимых между скважинами в строке и устойчивый в течение первых 5 циклов, перейдите к следующему шагу.
14. После 10 циклов (используется для базовых) паузы эксперимент.
15. Извлечь ящик с микрорезервуар пластины.
16. Использование 12-канальный дозатор (2 шагов 25 мкл), быстро 25 мкл готовые решения соединений и элементов управления (от шага 4.7) 12 хорошо дубликаты (24 скважины) строки. Решения будут разбавленных 1:3, как скважин уже содержат 50 мкл окрашенных спермы.
17. Продолжения измерений как можно быстрее (ящик будет автоматически закрыта) чтобы не пропустить флуоресцентные сигналов индуцированных соединений добавил и элементов управления. Изменения в флуоресцировании (ΔF) после добавления элементов управления и соединений теперь быть захвачены.
18. Запустите эксперимент пока флуоресцентные сигналы были зарегистрированы от позитивного управления и соединения интереса.
19. Остановить эксперимент и экспорта сырья флуоресценции данные для анализа как в шаге 5.
    Примечание: Как правило Fluo-4 утра был использован как Ca^{2 +}-чувствительных Флюорофор в assay, но другие Ca^{2 +}-чувствительных флуорофоров могут также использоваться, если возбуждения и выбросов спектры подходят с фильтрами в reader пластины флуоресценции. В зависимости от выбора Флюорофор убедитесь, что уровень усиления устанавливается на «безопасные» уровне, где индуцированные флуоресцентные вершины находятся в пределах диапазона измерений документа. Это можно проверить путем добавления одной скважине на конкретные выгоды параметр ionomycin. Если это побудило флуоресцентного сигнала выше порога, ниже прирост и повторите попытку. Некоторые использовать плюрониевого F-127 для помощи загрузки Fluo-4 в^1,13, но выяснилось, что это не необходимое². Максимальное количество строк, измерены одновременно зависит от двух факторов. 1) время цикла документа: Если время цикла является слишком длинным, индуцированная пик [Ca^{2 +}]_я могли бы пропустил. Измерить максимум двух строк одновременно, чтобы снизить время цикла; 2) скорость дозирование в шаге 4.16: использование 12-канальный дозатор, это можно быстро добавить 12 различных решений для 12 повторяющиеся скважин (24 скважины) 1 или 2 строк (например, одна строка, предварительно инкубировали с автомобиля и одна строка, предварительно инкубировали с ингибитором) , не пропуская индуцированных Ca^{2 +} пиков. Однако это не рекомендуется пытаться добавить 24 различных решений в две строки для одновременного измерения, как дозирования советы должны быть заменены между двух последовательных шагов дозирования, whereby индуцированных Ca^{2 +} пики могут быть пропущены.

5. анализ данных от Ca^{2 +}- флуориметрия

1. Откройте сырье флуоресценции полученных данных и экспортированы в шаге 4.
2. Вычислить среднее из повторяющихся скважин. Если существуют большие различия между дубликатами, отказаться от данных из конкретных скважин.
3. Определите базовые как первые 10 циклов.
4. Рассчитать ΔF/F₀ (%) как процент изменения в флуоресцировании (ΔF) со временем после добавления элементов управления в отношении средней базальной флюоресценция (₀F) в течение 10 циклов первой (базовой) и соединений.
5. При использовании данных для составления кривых доза реакция, вычтите индикация отрицательного контроля от других скважин, для удаления артефактов дозирования.

6. измерение реакции Акросома

Примечание: Используйте изображения цитометр, инкубатор, флуоресцентных красителей: PI, FITC-PSA и Hoechst 33342, соединения, интерес, а также позитивные и негативные элементы, застывший раствор, содержащий 0,6 М NaHCO₃ и 0,37% (v/v) формальдегида в дистиллированной воде, A2 слайд и полномочия кромки очищенный клетки спермы (подготовленных на шаге 2).

1. Подготовить окрашивание раствора, содержащего PI (5 мкг/мл), FITC-PSA (50 мкг/мл) и Hoechst 33342 (100 мкг/мл) в HTF⁺, смесь хорошо с помощью вихревой смеситель и защитить его от света до использования.
2. Готовить растворы соединений и элементов управления в 10 x желаемой конечной концентрации, как они разбавленным 1:10 на шаге 6.5. Всегда включать элемент управления отрицательной (автомобиль) и два положительных управления: конечная концентрация прогестерона 10 мкм и ionomycin 2 мкм конечная концентрация.
3. Передавать аликвоты 240 мкл полномочия сперматозоидов (подготовленных на шаге 2) пластиковые трубы.
4. 30 мкл окрашивания решение каждой трубы. Конечная концентрация пятна будет: 0,5 мкг/мл PI, FITC-PSA 5 мкг/мл и 10 мкг/мл Hoechst 33342.
5. 30 мкл решения с элементами управления или соединений для каждой трубы (1:10 разрежения).
6. Осторожно перемешать образцы, закупорить вверх и вниз несколько раз или мягкий vortexing. Из-за механического стресса Избегайте чрезмерного смешивания.
7. Инкубируйте при 37 ° C за 30 мин.
8. Подготовьте новые пластиковые трубы с 100 мкл застывший раствор, содержащий 0,6 М NaHCO₃ и 0,37% (v/v) формальдегида в дистиллированной воде, по одному на пробирку.
9. После инкубации mix образцы хорошо закупорить и добавьте 50 мкл испытуемого образца трубки с 100 мкл раствора иммобилизации.
10. Перед загрузкой камеры слайд A2, смешайте образец хорошо закупорить. Тщательно заполните камер с приблизительно 30 мкл без создания пузырьков воздуха.
    Примечание: Во время инкубации, количество подвижных сперматозоидов, как правило, в совокупности. Скопления клеток может нарушить измерений (даже если они исключены). Таким образом очень важно тщательное смешивание, закупорить после инкубации. Аналогичным образом пузырьков воздуха в камерах может нарушить измерения. Таким образом заполните камеры медленно и изменить угол пипеткой, если края жидкости собираются встретиться и создать воздушный пузырь.
11. Поместите загруженные слайд на лоток цитометр изображения и закрыть лоток.
12. Выберите протокол FlexiCyte и тиража.
    1. Выберите следующие параметры для протокола FlexiCyte: количество аналитических каналов: 2; Маскирование канал: UV (LED365), это канал, используемый для сегментации изображений; Канал 1: Синий (LED475), время экспозиции 3000 МС, фильтра выбросов 560/35; Канал 2: Зеленый (LED530), воздействие время 500 мс, фильтра выбросов 675/75; Минимальное количество анализируемых клеток: 5000; Исключить агрегированных ячейки: Да.
13. Повторите шаг 6,9-6.12 до тех пор, пока все образцы были измерены.

7. анализ данных из образа цитометрии

1. Открытые данные, полученные на шаге 6.
2. Создайте два следующих участков для оценки измерений.
   1. Создание точечной Hoechst 33342 интенсивности против Hoechst 33342 области на biexponential весах. Этот участок может быть использован для ворот Hoechst 33342 позитивные объекты, которые являются либо слишком мал или слишком велик, чтобы быть человеческих клеток спермы.
   2. Создание точечной из FITC-PSA интенсивности и PI на biexponential весах. Этот участок может быть использован для ослов количество Акросома отреагировали сперматозоидов путем использования квадранта ворот, которая отделяет четыре группы на участке (рис. 3): 1) PI позитивные и положительные группы FITC-PSA: Акросома отреагировали нежизнеспособных клеток спермы; 2) PI отрицательные и положительные группы FITC-PSA: Акросома отреагировали жизнеспособных клеток спермы; 3) PI положительные и FITC-PSA негативных Группа: Акросома нетронутыми нежизнеспособных клеток спермы; и 4) PI отрицательной и FITC-PSA негативных Группа: Акросома нетронутыми жизнеспособных клеток спермы.

Результаты

Представитель результаты эксперимента, тестирование эффект 4 соединений (A, B, C и D) вместе с положительным (Прогестерон) и отрицательной (буфер) управления на [Ca^{2 +}]_я в человеческой спермы с использованием средне-пропускная способность Ca^{2 +}-сигнализации п...

Обсуждение

Средняя пропускная способность Ca^{2 +} сигнализации что проба основана на измерениях флуоресценции от одного microwells содержит около 250.000 клеток спермы. В среднем захваченного сигнала от всех отдельных клеток спермы в колодец. Assay таким образом обеспечивает что никакой пространственно...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer